Microbiological and molecular detection of Mycoplasma bovis in milk samples from bovine clinical mastitis / Detecção microbiológica e molecular de Mycoplasma bovis em amostras de leite oriundas de mastite clínica bovina

The genus Mycoplasma includes more than 200 bacterial species that cause disease in animals. It is responsible for causing mastitis in bovines and may be related to other manifestations, such as arthritis and pneumonia in calves and heifers. The present study aimed to detect Mycoplasma bovis isolated from milk samples of bovine clinical mastitis, and to compare the isolation rates in two culture media: Hayflick and SP4. An initial screening was performed in order to detect the presence of the class Mollicutes in 1166 milk samples from clinical mastitis by the conventional Polymerase Chain Reaction (PCR) technique. According to the 1166 milk samples evaluated, 8.6% (100/1166) were positive to class Mollicutes. Regarding molecular analyses, 1.1% (13/1166) of conventional PCR for positive M. bovis was obtained and 0.9% (11/1166) in real-time PCR. The results of the microbiological culture of the 100 samples previously screened demonstrated that 6% (6/100) of colony growth have been developed when using the Hayflick medium, and 11% (11/100) when using the SP4 medium (including the positive on Hayflick medium). Concerning the 11 isolates obtained in the microbiological culture, conventional PCR confirmed M. bovis in nine of them, and two cultures were negative. In the phylogenetic analysis of the isolates, all of them were grouped in M. bovis and M. agalactiae clusters. The results confirmed the importance of the presence of M. bovis in the etiology of bovine clinical mastitis and reinforced the need for further studies to elucidate other Mycoplasma species that may be involved in bovine clinical mastitis in Brazil.(AU)

O gênero Mycoplasma inclui mais de 200 espécies que causam doenças nos animais. É responsável por quadros de mastite em bovinos, podendo também estar relacionado à outras manifestações como artrite e pneumonia em bezerros e novilhas. O presente estudo objetivou a detecção de Mycoplasma bovis isolados a partir de amostras de leite de mastite clínica bovina, bem como, a comparação da taxa de isolamento em dois meios de cultura: Hayflick e SP4. Para efeito de triagem amostral, foram avaliadas quanto à presença da classe Mollicutes 1166 amostras de leite de casos de mastite clínica pela técnica de PCR convencional. Das 1166 amostras de leite avaliadas, 8,6% (100/1166) foram positivas à classe. Nas análises moleculares, obteve-se 1,1% (13/1166) de positividade para Mycoplasma bovis na PCR convencional e 0,9% (11/1166) na PCR em tempo real. Os resultados do cultivo microbiológico das 100 amostras triadas previamente demonstraram 6% (6/100) de crescimento de colônias ao se utilizar o meio Hayflick e 11% (11/100) ao se utilizar o meio SP4 (incluindo as positivas ao primeiro). A partir dos 11 isolados obtidos no cultivo microbiológico, a PCR convencional confirmou Mycoplasma bovis em nove deles, e dois foram negativos para o agente. Na análise filogenética dos isolados, todos agruparam no cluster Mycoplasma bovis e Mycoplasma agalactiae. Frente aos resultados, ressalta-se a importância da presença de Mycoplasma bovis na etiologia da mastite clínica bovina e reforça a necessidade de estudos mais aprofundados para a elucidação de outras espécies de micoplasmas que possam estar envolvidas na mastite bovina.(AU)

Microbiological and molecular detection of Mycoplasma bovis in milk samples from bovine clinical mastitis / Detecção microbiológica e molecular de Mycoplasma bovis em amostras de leite oriundas de mastite clínica bovina

The genus Mycoplasma includes more than 200 bacterial species that cause disease in animals. It is responsible for causing mastitis in bovines and may be related to other manifestations, such as arthritis and pneumonia in calves and heifers. The present study aimed to detect Mycoplasma bovis isolated from milk samples of bovine clinical mastitis, and to compare the isolation rates in two culture media: Hayflick and SP4. An initial screening was performed in order to detect the presence of the class Mollicutes in 1166 milk samples from clinical mastitis by the conventional Polymerase Chain Reaction (PCR) technique. According to the 1166 milk samples evaluated, 8.6% (100/1166) were positive to class Mollicutes. Regarding molecular analyses, 1.1% (13/1166) of conventional PCR for positive M. bovis was obtained and 0.9% (11/1166) in real-time PCR. The results of the microbiological culture of the 100 samples previously screened demonstrated that 6% (6/100) of colony growth have been developed when using the Hayflick medium, and 11% (11/100) when using the SP4 medium (including the positive on Hayflick medium). Concerning the 11 isolates obtained in the microbiological culture, conventional PCR confirmed M. bovis in nine of them, and two cultures were negative. In the phylogenetic analysis of the isolates, all of them were grouped in M. bovis and M. agalactiae clusters. The results confirmed the importance of the presence of M. bovis in the etiology of bovine clinical mastitis and reinforced the need for further studies to elucidate other Mycoplasma species that may be involved in bovine clinical mastitis in Brazil.(AU)

O gênero Mycoplasma inclui mais de 200 espécies que causam doenças nos animais. É responsável por quadros de mastite em bovinos, podendo também estar relacionado à outras manifestações como artrite e pneumonia em bezerros e novilhas. O presente estudo objetivou a detecção de Mycoplasma bovis isolados a partir de amostras de leite de mastite clínica bovina, bem como, a comparação da taxa de isolamento em dois meios de cultura: Hayflick e SP4. Para efeito de triagem amostral, foram avaliadas quanto à presença da classe Mollicutes 1166 amostras de leite de casos de mastite clínica pela técnica de PCR convencional. Das 1166 amostras de leite avaliadas, 8,6% (100/1166) foram positivas à classe. Nas análises moleculares, obteve-se 1,1% (13/1166) de positividade para Mycoplasma bovis na PCR convencional e 0,9% (11/1166) na PCR em tempo real. Os resultados do cultivo microbiológico das 100 amostras triadas previamente demonstraram 6% (6/100) de crescimento de colônias ao se utilizar o meio Hayflick e 11% (11/100) ao se utilizar o meio SP4 (incluindo as positivas ao primeiro). A partir dos 11 isolados obtidos no cultivo microbiológico, a PCR convencional confirmou Mycoplasma bovis em nove deles, e dois foram negativos para o agente. Na análise filogenética dos isolados, todos agruparam no cluster Mycoplasma bovis e Mycoplasma agalactiae. Frente aos resultados, ressalta-se a importância da presença de Mycoplasma bovis na etiologia da mastite clínica bovina e reforça a necessidade de estudos mais aprofundados para a elucidação de outras espécies de micoplasmas que possam estar envolvidas na mastite bovina.(AU)

Bacteria isolated from the lower respiratory tract of sheep and their relationship to clinical signs of sheep respiratory disease / Bactérias detectadas no trato respiratório inferior de ovinos e a relação com as manifestações clínicas da doença respiratória ovina

Respiratory diseases are among the most important diseases in sheep flocks. Herein was studied the bacterial etiology of respiratory disease and the clinical signs of 99 female and male sheep breed in the states of São Paulo (SP) and Rio de Janeiro (RJ), Brazil. After physical examination of animals, tracheobronchial flushing samples were obtained. The usual bacteria and Mycoplasma spp. were searched, as well as their association with the clinical status and clinical signs of sheep with respiratory disease. The main observed signs were: tachypnea (75%), increase of rectal temperature (09.4%), mucopurulent/purulent nasal discharge (21.9%), cough (25%), dyspnea (31.2%), changes of lung sounds at auscultation (87.5%) and chest percussion (28.1%) in pneumonic sheep. Non-fermenting gram-negative bacteria and Bacillus sp. were the most isolated bacteria. Microorganisms of the Mollicutes class were molecularly (PCR) detected in 33.3% of the animals. In addition, the specific detection of M. mycoides subsp. capri was described for the first time in sheep from the state of São Paulo, Brazil.(AU)

A doença respiratória é uma das doenças mais importantes em rebanhos ovinos. Esta pesquisa teve como objetivo determinar a etiologia bacteriana da doença respiratória e sua relação com sinais clínicos em ovinos criados nos estados de São Paulo e Rio de Janeiro, Brasil. Noventa e nove ovelhas machos e fêmeas dos Estados de São Paulo (SP) e Rio de Janeiro (RJ) foram estudadas. Após o exame físico, amostras de lavagem traqueobrônquica foram obtidas. A presença de bactérias aeróbias e Mycoplasmaspp. foram estudados, assim como a associação entre os microrganismos e estado clínico e sinais clínicos de doença respiratória em ovinos. As principais manifestações clínicas observadas foram: taquipneia (75%), alta temperatura retal (09,4%), secreção nasal mucopurulenta/purulenta (21,9%), tosse (25%), dispneia (31,2%), sons pulmonares alterados na ausculta (87,5%) e na percussão torácica (28,1%) em ovelhas pneumônicas. Bactérias gram-negativas não fermentadoras e Bacillus sp. foram as bactérias mais isoladas. Microrganismos da classe Mollicutes foram detectados molecularmente (PCR) em 33,3% dos ovinos. Além disso, descreve-se pela primeira vez no estado de São Paulo, Brasil, a detecção do M. mycoides subsp. capri na espécie ovina utilizando a reação de polimerase em cadeia.(AU)

Bacteria isolated from the lower respiratory tract of sheep and their relationship to clinical signs of sheep respiratory disease

ABSTRACT: Respiratory diseases are among the most important diseases in sheep flocks. Herein was studied the bacterial etiology of respiratory disease and the clinical signs of 99 female and male sheep breed in the states of São Paulo (SP) and Rio de Janeiro (RJ), Brazil. After physical examination of animals, tracheobronchial flushing samples were obtained. The usual bacteria and Mycoplasma spp. were searched, as well as their association with the clinical status and clinical signs of sheep with respiratory disease. The main observed signs were: tachypnea (75%), increase of rectal temperature (09.4%), mucopurulent/purulent nasal discharge (21.9%), cough (25%), dyspnea (31.2%), changes of lung sounds at auscultation (87.5%) and chest percussion (28.1%) in pneumonic sheep. Non-fermenting gram-negative bacteria and Bacillus sp. were the most isolated bacteria. Microorganisms of the Mollicutes class were molecularly (PCR) detected in 33.3% of the animals. In addition, the specific detection of M. mycoides subsp. capri was described for the first time in sheep from the state of São Paulo, Brazil.

RESUMO: A doença respiratória é uma das doenças mais importantes em rebanhos ovinos. Esta pesquisa teve como objetivo determinar a etiologia bacteriana da doença respiratória e sua relação com sinais clínicos em ovinos criados nos estados de São Paulo e Rio de Janeiro, Brasil. Noventa e nove ovelhas machos e fêmeas dos Estados de São Paulo (SP) e Rio de Janeiro (RJ) foram estudadas. Após o exame físico, amostras de lavagem traqueobrônquica foram obtidas. A presença de bactérias aeróbias e Mycoplasmaspp. foram estudados, assim como a associação entre os microrganismos e estado clínico e sinais clínicos de doença respiratória em ovinos. As principais manifestações clínicas observadas foram: taquipneia (75%), alta temperatura retal (09,4%), secreção nasal mucopurulenta/purulenta (21,9%), tosse (25%), dispneia (31,2%), sons pulmonares alterados na ausculta (87,5%) e na percussão torácica (28,1%) em ovelhas pneumônicas. Bactérias gram-negativas não fermentadoras e Bacillus sp. foram as bactérias mais isoladas. Microrganismos da classe Mollicutes foram detectados molecularmente (PCR) em 33,3% dos ovinos. Além disso, descreve-se pela primeira vez no estado de São Paulo, Brasil, a detecção do M. mycoides subsp. capri na espécie ovina utilizando a reação de polimerase em cadeia.

Bacteria isolated from the lower respiratory tract of sheep and their relationship to clinical signs of sheep respiratory disease / Bactérias detectadas no trato respiratório inferior de ovinos e a relação com as manifestações clínicas da doença respiratória ovina

Respiratory diseases are among the most important diseases in sheep flocks. Herein was studied the bacterial etiology of respiratory disease and the clinical signs of 99 female and male sheep breed in the states of São Paulo (SP) and Rio de Janeiro (RJ), Brazil. After physical examination of animals, tracheobronchial flushing samples were obtained. The usual bacteria and Mycoplasma spp. were searched, as well as their association with the clinical status and clinical signs of sheep with respiratory disease. The main observed signs were: tachypnea (75%), increase of rectal temperature (09.4%), mucopurulent/purulent nasal discharge (21.9%), cough (25%), dyspnea (31.2%), changes of lung sounds at auscultation (87.5%) and chest percussion (28.1%) in pneumonic sheep. Non-fermenting gram-negative bacteria and Bacillus sp. were the most isolated bacteria. Microorganisms of the Mollicutes class were molecularly (PCR) detected in 33.3% of the animals. In addition, the specific detection of M. mycoides subsp. capri was described for the first time in sheep from the state of São Paulo, Brazil.(AU)

A doença respiratória é uma das doenças mais importantes em rebanhos ovinos. Esta pesquisa teve como objetivo determinar a etiologia bacteriana da doença respiratória e sua relação com sinais clínicos em ovinos criados nos estados de São Paulo e Rio de Janeiro, Brasil. Noventa e nove ovelhas machos e fêmeas dos Estados de São Paulo (SP) e Rio de Janeiro (RJ) foram estudadas. Após o exame físico, amostras de lavagem traqueobrônquica foram obtidas. A presença de bactérias aeróbias e Mycoplasma spp. foram estudados, assim como a associação entre os microrganismos e estado clínico e sinais clínicos de doença respiratória em ovinos. As principais manifestações clínicas observadas foram: taquipneia (75%), alta temperatura retal (09,4%), secreção nasal mucopurulenta/purulenta (21,9%), tosse (25%), dispneia (31,2%), sons pulmonares alterados na ausculta (87,5%) e na percussão torácica (28,1%) em ovelhas pneumônicas. Bactérias gram-negativas não fermentadoras e Bacillus sp. foram as bactérias mais isoladas. Microrganismos da classe Mollicutes foram detectados molecularmente (PCR) em 33,3% dos ovinos. Além disso, descreve-se pela primeira vez no estado de São Paulo, Brasil, a detecção do M. mycoides subsp. capri na espécie ovina utilizando a reação de polimerase em cadeia.(AU)

Bacterial pathogens of the lower respiratory tract of calves from Brazilian rural settlement herds and their association with clinical signs of bovine respiratory disease / Patógenos bacterianos do trato respiratório inferior de bezerros criados em rebanhos de assentamentos brasileiros e sua associação com os sinais clínicos da doença respiratória dos bovinos

Bovine respiratory disease (BRD) is considered the major cause of economic losses in dairy and beef cattle production. The study aimed to detect the most important bacteria related to respiratory disease in tracheobronchial fluid samples of healthy and dairy calves with clinical signs of BRD in Brazilian rural settlements. Hundred and forty-one mongrel dairy calves were randomly selected from 42 family farm dairy herds from Brazilian settlements. Physical examination was performed and calves were classified as healthy (n=100) and BRD (n=41). Tracheobronchial fluid samples were collected. Isolation and molecular detection of Mycoplasma dispar, M. bovis and M. mycoides subsp. mycoides SC besides isolation of other aerobic bacteria were performed. Abnormal lung sounds (crackle/snoring/whistle), mucopurulent/purulent nasal discharge, body temperature >39.5°C and respiratory rate >40 breaths/min were higher in BRD calves compared to healthy calves (P<0.05). Bacillus sp., Staphylococcus intermedius and non-fermentative Gram-negative were the most prevalent bacteria isolated. Non-identified species from Enterobacteriaceae family was higher in BRD calves compared to healthy calves (P<0.05). Mollicutes were isolated in 7.4% of samples and only M. dispar was detected. Mollicutes was associated with purulent/mucopurulent nasal discharge (P=0.017). Pantoea agglomerans was associated to tachypnea (P=0.020), and Streptococcus spp. was associated with hyperthermia. Statistical tendencies were observed to M. dispar and tachypnea (P=0.066), and P. agglomerans and tachycardia (P=0.066). The obtained results describe the microorganisms found in tracheobronchial fluid of calves with BRD in some herds of Brazilian family farming and their relation to clinical signs of BRD.(AU)

A doença respiratória dos bovinos (DRB) é considerada a principal causa de perdas econômicas nas produções de leite e carne. O objetivo deste estudo foi detectar as mais importantes bactérias relacionadas a doença respiratória presentes em amostras de lavado traqueobrônquico de bezerros sadios e com sinais clínicos da DRB de assentamentos brasileiros. Cento e quarenta e um bezerros leiteiros sem raça definida foram randomicamente selecionados de 42 rebanhos leiteiros de assentamentos brasileiros. Exame físico foi realizado e os animais foram classificados em sadios (n=100) e com DRB (n=41). Amostras de lavado traqueobrônquico foram coletadas. Foram realizados o isolamento e a detecção molecular de Mycoplasma dispar, M. bovis e M. mycoides subsp. mycoides SC além de isolamento de outras bactérias aeróbias. Ruídos pulmonares anormais (crepitação/ ronco/sibilo), secreção nasal mucopurulenta/purulenta, temperatura corporal >39.5°C e frequência respiratória >40 movimentos respiratórios/min foram observados com maior frequência em bezerros com DRB comparado aos animais sadios (P<0.05). Bacillus sp, Staphylococcus intermedius e bactérias Gram-negativas não fermentadoras foram as bactérias mais prevalentes. Bactérias da família Enterobacteriaceae cuja espécie não fora identificada foram mais frequentes em bezerros com DRB comparado aos bezerros sadios (P<0.05). Mollicutes foram isolados em 7,4% das amostras e somente M. dispar foi detectado. Mollicutes foi associado à secreção nasal purulenta/mucopurulenta (P=0.017). Pantoea agglomerans foi associada a taquipneia (P=0.020), e Streptococcus spp. Foi associado a hipertermia. Tendência estatística foi observada para M. dispar e taquipneia (P=0.066), e P. agglomerans e taquicardia (P=0.066). Os resultados obtidos descrevem os micro-organismos encontrados no lavado traqueobrônquico de bezerros com DRB em rebanhos de agricultura familiar brasileira e sua relação com as manifestações clínicas da DRB.(AU)

Bacterial pathogens of the lower respiratory tract of calves from Brazilian rural settlement herds and their association with clinical signs of bovine respiratory disease / Patógenos bacterianos do trato respiratório inferior de bezerros criados em rebanhos de assentamentos brasileiros e sua associação com os sinais clínicos da doença respiratória dos bovinos

Bovine respiratory disease (BRD) is considered the major cause of economic losses in dairy and beef cattle production. The study aimed to detect the most important bacteria related to respiratory disease in tracheobronchial fluid samples of healthy and dairy calves with clinical signs of BRD in Brazilian rural settlements. Hundred and forty-one mongrel dairy calves were randomly selected from 42 family farm dairy herds from Brazilian settlements. Physical examination was performed and calves were classified as healthy (n=100) and BRD (n=41). Tracheobronchial fluid samples were collected. Isolation and molecular detection of Mycoplasma dispar, M. bovis and M. mycoides subsp. mycoides SC besides isolation of other aerobic bacteria were performed. Abnormal lung sounds (crackle/snoring/whistle), mucopurulent/purulent nasal discharge, body temperature >39.5°C and respiratory rate >40 breaths/min were higher in BRD calves compared to healthy calves (P<0.05). Bacillus sp., Staphylococcus intermedius and non-fermentative Gram-negative were the most prevalent bacteria isolated. Non-identified species from Enterobacteriaceae family was higher in BRD calves compared to healthy calves (P<0.05). Mollicutes were isolated in 7.4% of samples and only M. dispar was detected. Mollicutes was associated with purulent/mucopurulent nasal discharge (P=0.017). Pantoea agglomerans was associated to tachypnea (P=0.020), and Streptococcus spp. was associated with hyperthermia. Statistical tendencies were observed to M. dispar and tachypnea (P=0.066), and P. agglomerans and tachycardia (P=0.066). The obtained results describe the microorganisms found in tracheobronchial fluid of calves with BRD in some herds of Brazilian family farming and their relation to clinical signs of BRD.(AU)

A doença respiratória dos bovinos (DRB) é considerada a principal causa de perdas econômicas nas produções de leite e carne. O objetivo deste estudo foi detectar as mais importantes bactérias relacionadas a doença respiratória presentes em amostras de lavado traqueobrônquico de bezerros sadios e com sinais clínicos da DRB de assentamentos brasileiros. Cento e quarenta e um bezerros leiteiros sem raça definida foram randomicamente selecionados de 42 rebanhos leiteiros de assentamentos brasileiros. Exame físico foi realizado e os animais foram classificados em sadios (n=100) e com DRB (n=41). Amostras de lavado traqueobrônquico foram coletadas. Foram realizados o isolamento e a detecção molecular de Mycoplasma dispar, M. bovis e M. mycoides subsp. mycoides SC além de isolamento de outras bactérias aeróbias. Ruídos pulmonares anormais (crepitação/ ronco/sibilo), secreção nasal mucopurulenta/purulenta, temperatura corporal >39.5°C e frequência respiratória >40 movimentos respiratórios/min foram observados com maior frequência em bezerros com DRB comparado aos animais sadios (P<0.05). Bacillus sp, Staphylococcus intermedius e bactérias Gram-negativas não fermentadoras foram as bactérias mais prevalentes. Bactérias da família Enterobacteriaceae cuja espécie não fora identificada foram mais frequentes em bezerros com DRB comparado aos bezerros sadios (P<0.05). Mollicutes foram isolados em 7,4% das amostras e somente M. dispar foi detectado. Mollicutes foi associado à secreção nasal purulenta/mucopurulenta (P=0.017). Pantoea agglomerans foi associada a taquipneia (P=0.020), e Streptococcus spp. Foi associado a hipertermia. Tendência estatística foi observada para M. dispar e taquipneia (P=0.066), e P. agglomerans e taquicardia (P=0.066). Os resultados obtidos descrevem os micro-organismos encontrados no lavado traqueobrônquico de bezerros com DRB em rebanhos de agricultura familiar brasileira e sua relação com as manifestações clínicas da DRB.(AU)

Molecular characterization of ureaplasmas isolated from reproductive tract of goats and sheep from Brazil

Ovine/caprine ureaplasmas have not yet been assigned a species designation, but they have been classified into nine serotypes. Herein ureaplasmas were searched for in 120 samples of vulvo vaginal mucous from sheep and 98 samples from goats at 17 farms. In addition, semen samples were collected from 11 sheep and 23 goats. The recovered ureaplasma were from sheep and goats from animals without any reproductive disorder symptoms, but not all animals presented positive cultures. In sheep, 17 (68%) cultures of vulvovaginal mucous were positive for ureaplasma and 11 (27%) samples of semen presented positive cultures in animals with clinical signs of orchitis, balanoposthitis or low sperm motility. In goats four ureaplasma isolates were obtained from vulvovaginal mucus, but the semen samples were all negative. The isolates were submitted to Pulsed-field gel electrophoresis methodology and their 16S rRNA genes were sequenced. Fifty percent of ureaplasma recovered from sheep allowed for PFGE typing. Eleven isolates showed eight profiles genetically close to the bovine ureaplasmas. The 16S rRNA gene sequencing showed differences or similarities of isolates from sheep and goats, and the reference strains of bovine and human ureaplasma. Four clinical isolates from sheep were grouped separately. The studied ureaplasma isolates showed to be a diverse group of mollicutes.(AU)

Evaluation of a PCR multiplex for detection and differentiation of Mycoplasma synoviae, M. gallisepticum, and M. gallisepticum strain F-vaccine / Avaliação de uma PCR multiplex para detecção e diferenciação de Mycoplasma synoviae, Mycoplasma gallisepticum e Mycoplasma gallisepticum cepa F vacinal

Mycoplasma gallisepticum (MG) and Mycoplasma synoviae (MS) are the mycoplasma infections of most concern for commercial poultry industry. MG infection is commonly designated as chronic respiratory disease (CRD) of chickens and infections sinusitis of turkeys. MS causes sub clinical upper respiratory infection and tenosynovitis or bursitis in chickens and turkeys. The multiplex PCR was standardized to detect simultaneously the MS, MG field strains and MG F-vaccine strain specific. The generic PCR for detection of any species of Mollicutes Class was performed and compared to the multiplex PCR and to PCR using species-specific primers. A total of 129 avian tracheal swabs were collected from broiler-breeders, layer hens and broilers in seven different farms and were examined by multiplex PCR methods. The system (multiplex PCR) demonstrated to be very rapid, sensitive, and specific. Therefore, the results showed a high prevalence of MS in the flocks examined (27.9%), and indicate that the MS is a recurrent pathogen in Brazilian commercial poultry flocks.(AU)

Mycoplasma gallisepticum (MG) and Mycoplasma synoviae (MS) são micoplasmas que causam infecção de maior preocupação para a indústria avícola. MG é a bactéria responsável pela infecção, comumente designada, como doença crônica respiratória (DCR) de galinhas e sinusite infecciosa de perus. MS é responsável por infecções subclínicas do trato respiratório superior e tenosinovite ou bursite em galinha e perus. A reação da PCR multiplex foi padronizada para detectar simultaneamente MS, MG cepa de campo e MG-F cepa vacinal. A PCR genérica para detecção de qualquer espécie de Mycoplasma foi realizada e comparada a PCR multiplex e a PCR com primers específicos. O total de 129 amostras de suabes de traqueia foi coletado de reprodutoras pesadas, poedeiras e frangos em sete diferentes empresas avícolas e então foram examinados por PCR multiplex. O sistema da PCR multiplex demonstrou ser muito rápido, sensível e específico. Então, os resultados mostraram uma alta prevalência de MS nos lotes examinados ( 27,9%), e indica que MS é um patógeno recorrente nos lotes de aves comerciais brasileiro.(AU)

Detection, quantification and genetic variability of Mycoplasma hyopneumoniae from apparently healthy and pneumonic swine / Detecção, quantificação e variabilidade genética de Mycoplasma hyopneumoniae a partir de suínos pneumônicos e aparentemente saudáveis

Molecular differences among Mycoplasma hyopneumoniae strains present in pneumonic lungs of swine have been largely studied. However, no comparative studies concerning the strains present in apparently healthy pigs have been carried out. This study aimed to detect, quantify and perform molecular analysis of M. hyopneumoniae strains in pig lungs with and without pneumonic lesions. The detection of M. hyopneumoniae was performed using multiplex PCR (YAMAGUTI, 2008), real-time PCR (STRAIT et al., 2008) and multiple VNTR amplification (VRANCKX et al., 2011). Molecular characterization of the strains was achieved by analysis of the VNTR copy number in P97R1, P146R3, H2R1 and H4. M. hyopneumoniae was detected in samples from healthy and pneumonic pigs and the amount of M. hyopneumoniae positive samples detected varied with the type of assay. The greater number of positive samples was identified by the multiple VNTR amplification combined with capillary electrophoresis. Using real-time PCR, 4.9*104 M. hyopneumoniae genome copies/mL was detected in apparently healthy lungs. A mean quantity of 3.9*106 M. hyopneumoniae genome copies/mL was detected in pneumonic lungs. The analysis of VNTR copy number demonstrated a high genetic variability of the M. hyopneumoniae strains present in apparently healthy and pneumonic lungs. Strains having 3 VNTR copy number in P97R1, were detected only in pneumonic lungs and strains having 40 and 43 VNTR copy number in P146R3 were detected only in apparently healthy lungs. Despite the genetic variability of M. hyopneumoniae, predominant strains in the swine farms could be identified(AU)

As diferenças moleculares entre as estirpes de Mycoplasma hyopneumoniae presentes em pulmões de suínos com pneumonia tem sido estudadas. Porém, estudos comparativos relativos as estirpes presentes nos suínos aparentemente saudáveis não foram levados a cabo. O objetivo do estudo foi a detecção, quantificação e analise molecular de M. hyopneumoniae nos pulmões suínos com e sem lesões pneumônicas. Para a detecção de M. hyopneumoniae usaramse o PCR Multiplo (YAMAGUTI, 2008), o PCR a Tempo Real (STRAIT et al., 2008) e a amplificação de múltiplo VNTR (VRANCKX et al., 2011). A caracterização molecular das estirpes foi realizada mediante a análise do número de copias de VNTR em P97R1, P146R3, H2R1 e H4. O M. hyopneumoniae foi detectado em amostras de suínos saudáveis e pneumônicos e a quantidade de M. hyopneumoniae nas amostras positivas variou com o tipo de ensaio. O maior número de amostras positivas foi identificado pela amplificação de múltiplas VNTR combinado com a eletroforese de capilares. Usando o PCR a Tempo Real, 4.9*104 copias de genoma/mL de M. hyopneumoniae foram detectadas em pulmões aparentemente saudáveis. Uma quantidade média de 3.9*106 copias de genoma/mL de M. hyopneumoniae foi detectada em pulmões pneumônicos. A análise do número de copias de VNTR demonstrou uma elevada variabilidade(AU)

Experimental infection of BHK21 and Vero cell lines with different Mycoplasma spp

Mycoplasma spp, belongs to the class Mollicutes and is capable to produce alterations in cellular cultures causing damages to the biotechnological industry. Bioproducts generally require two essential inputs, bovine serum and cells. The study herein aims to evaluate the mycoplasma concentrations that affect the growing of BHK21 and Vero cells. The species used were: Mycoplasma orale, M. salivarium, M. arginini and M. hyorhinis, cultivated in a SP4 media. Two contamination tests were performed with BHK21 and Vero cells and one of them applied different concentrations of mycoplasma. In the first one, mycoplasma was applied at the day zero and, in the second one, the contamination was performed after the monolayer establishment. The both cellular cultures presented cytopathic effects with mycoplasma contamination, but the Vero cells suffered more damages than the BHK21 ones. It was also observed that the severity of the cytopathic effect depended on the mycoplasma specie, on the concentration and on the time of contact with the cellular culture, which evidences the importance of controlling the presence of mycoplasma in biotechnological industries.

Isolamento e PCR para detecção de Mollicutes em muco vaginal e sua associação com problemas reprodutivos em ovinos criados na região de Piedade, São Paulo, Brasil

It was evaluated the presence of Mycoplasma spp, Ureaplasma spp and Acholeplasma laidlawiii in 60 samples of ovine vaginal mucous with the presence or absence of vulvovaginitis in the specific exam of the reproductive tract. The microorganisms were characterized based on bacteriological culture and DNA detection by Polymerase Chain Reaction (PCR) with specific primers to Mollicutes (GPO and MGSO), Ureaplasma (UGPF and UGPS) and Acholeplasma laidlawii (UNI and ACH3). The presence of mycoplasmas could not be associated with reproductive disorders in animals. The PCR to Acholeplasma laidlawii detected only one positive sample. However, all isolations of Ureaplasma spp were from animals presenting reproductive disorders, suggesting a possible involvement of this agent in reproductive diseases.

Pesquisou-se Mycoplasma spp, Ureaplasma spp e Acholeplasma laidlawiii em amostras de muco vaginal de 60 ovinos, criados na região de Piedade no Estado de São Paulo, Brasil, que apresentavam ou não vulvovaginite no exame específico do sistema genital. A caracterização desses microrganismos baseou-se no cultivo e detecção do respectivo DNA pela Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) com os primers para classe Mollicutes (GPO e MGSO), para o gênero Ureaplasma (UGPF e UGPS) e a espécie Acholeplasma laidlawii (UNI e ACH3). A presença de micoplasmas não foi associada com distúrbios do trato reprodutivo dos animais, entretanto todos os isolados obtidos de Ureaplasma spp foram provenientes de animais com distúrbios reprodutivos, sugerindo o possível envolvimento desse agente nas enfermidades da reprodução. A PCR para a espécie Acholeplasma laidlawii detectou somente uma amostra positiva.

Isolamento e PCR para detecção de Mollicutes em muco vaginal e sua associação com problemas reprodutivos em ovinos criados na região de Piedade, São Paulo, Brasil

It was evaluated the presence of Mycoplasma spp, Ureaplasma spp and Acholeplasma laidlawiii in 60 samples of ovine vaginal mucous with the presence or absence of vulvovaginitis in the specific exam of the reproductive tract. The microorganisms were characterized based on bacteriological culture and DNA detection by Polymerase Chain Reaction (PCR) with specific primers to Mollicutes (GPO and MGSO), Ureaplasma (UGPF and UGPS) and Acholeplasma laidlawii (UNI and ACH3). The presence of mycoplasmas could not be associated with reproductive disorders in animals. The PCR to Acholeplasma laidlawii detected only one positive sample. However, all isolations of Ureaplasma spp were from animals presenting reproductive disorders, suggesting a possible involvement of this agent in reproductive diseases.

Pesquisou-se Mycoplasma spp, Ureaplasma spp e Acholeplasma laidlawiii em amostras de muco vaginal de 60 ovinos, criados na região de Piedade no Estado de São Paulo, Brasil, que apresentavam ou não vulvovaginite no exame específico do sistema genital. A caracterização desses microrganismos baseou-se no cultivo e detecção do respectivo DNA pela Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) com os primers para classe Mollicutes (GPO e MGSO), para o gênero Ureaplasma (UGPF e UGPS) e a espécie Acholeplasma laidlawii (UNI e ACH3). A presença de micoplasmas não foi associada com distúrbios do trato reprodutivo dos animais, entretanto todos os isolados obtidos de Ureaplasma spp foram provenientes de animais com distúrbios reprodutivos, sugerindo o possível envolvimento desse agente nas enfermidades da reprodução. A PCR para a espécie Acholeplasma laidlawii detectou somente uma amostra positiva.

Isolamento e PCR para detecção de Mollicutes em muco vaginal e sua associação com problemas reprodutivos em ovinos criados na região de Piedade, São Paulo, Brasil

It was evaluated the presence of Mycoplasma spp, Ureaplasma spp and Acholeplasma laidlawiii in 60 samples of ovine vaginal mucous with the presence or absence of vulvovaginitis in the specific exam of the reproductive tract. The microorganisms were characterized based on bacteriological culture and DNA detection by Polymerase Chain Reaction (PCR) with specific primers to Mollicutes (GPO and MGSO), Ureaplasma (UGPF and UGPS) and Acholeplasma laidlawii (UNI and ACH3). The presence of mycoplasmas could not be associated with reproductive disorders in animals. The PCR to Acholeplasma laidlawii detected only one positive sample. However, all isolations of Ureaplasma spp were from animals presenting reproductive disorders, suggesting a possible involvement of this agent in reproductive diseases.

Pesquisou-se Mycoplasma spp, Ureaplasma spp e Acholeplasma laidlawiii em amostras de muco vaginal de 60 ovinos, criados na região de Piedade no Estado de São Paulo, Brasil, que apresentavam ou não vulvovaginite no exame específico do sistema genital. A caracterização desses microrganismos baseou-se no cultivo e detecção do respectivo DNA pela Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) com os primers para classe Mollicutes (GPO e MGSO), para o gênero Ureaplasma (UGPF e UGPS) e a espécie Acholeplasma laidlawii (UNI e ACH3). A presença de micoplasmas não foi associada com distúrbios do trato reprodutivo dos animais, entretanto todos os isolados obtidos de Ureaplasma spp foram provenientes de animais com distúrbios reprodutivos, sugerindo o possível envolvimento desse agente nas enfermidades da reprodução. A PCR para a espécie Acholeplasma laidlawii detectou somente uma amostra positiva.

Epidemiological survey on Mycoplasma gallisepticum and M. synoviae by multiplex PCR in commercial poultry / Investigação epidemiológica de Mycoplasma gallisepticum e M. synoviae por PCR Multiplex em estabelecimentos comerciais de aves

Mycoplasmas are important avian pathogens, which cause respiratory and joint diseases that result in large economic losses in Brazilian and world-wide poultry industry. This investigation regarding the main species of mycoplasmas, Mycoplasma gallisepticum (MG) and M. synoviae (MS), responsible for the above mentioned conditions, was carried out through PCR Multiplex analysis. One thousand and forty-six (1,046) samples of tracheal swabs and piped embryos were collected from 33 farms with laying hens, breeders, broilers or hatchery, located in the Brazilian states of São Paulo, Paraná and Pernambuco, where respiratory problems or drops in egg production had occurred. The MG and MS prevalence on the farms was 72.7 percent. These results indicated (1) high dissemination of mycoplasmas in the evaluated farms, with predominance of MS, either as single infectious agent or associated with other mycoplasmas in 20 farms (60.6 percent), and (2) an increase of MS and decrease of MG infection in Brazilian commercial poultry.(AU)

Os Micoplasmas são importantes patógenos aviários que causam doenças respiratórias e de articulações que resultam em grandes perdas econômicas para a indústria avícola brasileira e mundial. O estudo das principais espécies de Mycoplasma, Mycoplasma gallisepticum (MG) e M. synoviae (MS), responsáveis pelas doenças mencionadas acima, foram analisadas pela técnica de PCR Multiplex. Foram colhidas 1046 amostras de suabe traqueal e embriões bicados de 33 estabelecimentos de aves de postura, matrizes, frangos de corte e um incubatório, localizados nos Estados brasileiros de São Paulo, Paraná e Pernambuco, as quais apresentavam problemas respiratórios ou queda na produção de ovos. A prevalência de MS e MG nas granjas foi de 72,7 por cento. Os resultados indicaram uma alta disseminação de Mycoplasma nas granjas avaliadas, com predominância de MS, como um único agente infeccioso ou associado com outros micoplasmas em 20 granjas (60,6 por cento). Assim, este estudo indicou o aumento da incidência de MS e a redução de MG nas granjas comerciais no Brasil.(AU)

A review of the occurrence of hemoplasmas (hemotrophic mycoplasmas) in Brazil

Recent studies have been conducted in Brazil using molecular techniques for the detection of hemotrophic mycoplasmas in several mammals. In domestic cats, Mycoplasma haemofelis, 'Candidatus M. haemominutum', and 'Candidatus M. turicensis' infections have been identified. These species have also been found in free-ranging and captive neotropical felid species. Two canine hemoplasmas, Mycoplasma haemocanis and 'Candidatus Mycoplasma haematoparvum', have been identified in dogs. In commercial swine populations, Mycoplasma suis was found to be highly prevalent, especially in sows. Moreover, novel mycoplasma species have been identified in Brazilian commercial pigs and domestic dogs. A hemoplasma infection in a human patient infected with the human immunodeficiency virus (HIV) was also recently documented. In conclusion, hemoplasma species are common and important infectious agents in Brazil. Further studies should be conducted to better understand their impact on pets, production animals, and wildlife fauna, as well as their role as zoonotic agents, particularly in immunocompromised patients.

Estudos recentes utilizando técnicas moleculares para a detecção de micoplasmas hemotróficos em diferentes mamíferos têm sido conduzidos no Brasil. Em gatos domésticos, infecções por Mycoplasma haemofelis, 'Candidatus M. haemominutum' e 'Candidatus M. turicensis' foram identificadas. Estas espécies também foram encontradas em felídeos neotropicais de vida livre e de cativeiro. Dois hemoplasmas caninos, Mycoplasma haemocanis e 'Candidatus Mycoplasma haematoparvum', foram identificados em cães domésticos. Em populações comerciais de suínos, Mycoplasma suis possui alta prevalência, especialmente em porcas. Além disso, novas espécies de hemoplasmas foram detectadas em suínos comercias e cães. Infecção por um hemoplasma em um paciente humano infectado com o vírus da imunodeficiência humana (HIV) foi recentemente documentada. Em conclusão, espécies de hemoplasmas são comuns e importantes agentes de infecções no Brasil. Estudos futuros devem ser conduzidos para melhor entender seu impacto em cães e gatos, animais de produção e na fauna silvestre, e também para determinar o seu papel como agentes zoonóticos, particularmente em pacientes imunocomprometidos.

Isolates of Ureplasma diversum genotyped by single-enzyme amplified length polymorphism

Isolates of Ureaplasma diversum recovered from bovines with reproductive disorders and healthy ones of four premises were compared by SE-AFLP. Twenty-eight SE-AFLP profiles without monomorphic fragments were obtained. The ureaplasma studied were divided in clusters A and B. Cluster A was divided in subclusters A1 and A2, while A1 was divided in subclusters A1a and A1b. Cluster B grouped only the reference strains. The clusters obtained were not associated with the reproductive disorders. The dendrogram obtained showed high heterogeneity among the studied ureaplasmas and indicated a low genomic stability as detected in other species of microorganisms of class Mollicutes.

Cepas de referência e 30 estirpes de Ureaplasma diversum isoladas do muco vaginal de bovinos apresentando ou não distúrbios reprodutivos, de quatro diferentes propriedades, foram comparadas por meio da metodologia da SE-AFLP (single-enzyme amplified fragment length polymorphism). Foram obtidos 28 perfis, com ausência de fragmentos monomórficos. No dendrograma, as amostras foram divididas em grupos A e B. O grupo A foi subdividido em A1 e A2 e o A1 dividiu-se em A1a e A1b. As amostras de referência formaram o grupo B. Não houve diferenciação entre as estirpes isoladas de animais doentes ou sadios. Evidenciou-se grande heterogeneidade entre os ureaplasmas estudados indicando baixa estabilidade genômica, como detectado em outras espécies dos microrganismos da classe Mollicutes.

Immunoblot profiles of sera from laboratory rats naturally infected with Mycoplasma pulmonis and technicians exposed to infected animal facilities

Mycoplasma pulmonis have been isolated in about 10(5) CFU/mL from tracheal aspirates of rats from conventional animal facilities in São Paulo. The mycoplasma transmission by aerosol may happen from an infected rat to a healthy one at distances up to 120 cm. This condition also favors the technicians contamination. As this infection is unknown in humans, in this study the immunoblot profiles to M. pulmonis of sera from rats were compared to those presented by animal facility technicians. About 32 proteins from 11 to 230 kDa (kilodaltons) were recognized by the sera from rats naturally infected with M. pulmonis. Sera from technicians responsible for the cleaning and sanitation of cages of infected animals for more than seven years recognized about 10 proteins of this bacteria. Sera from individuals with shorter working time or that had never been exposed to such environment recognized few proteins. Proteins about 117 and 95 kDa were recognized by human and rat sera and by the negative controls. Although a positive human serum against M. pulmonis is unknown, this study established a temporary profile of protein recognition of human serum against such mycoplasma.

Mycoplasma pulmonis foi isolado em aproximadamente 10(5) UFC/mL do lavado traqueal de ratos mantidos em biotérios convencionais da cidade de São Paulo. A transmissão do micoplasma por aerossol pode ocorrer entre os animais em até 120 cm. Esta condição favorece a sua transmissão para os bioteristas que também são expostos a este microrganismo. Como esta colonização é desconhecida em humanos, as imunoeletroforeses dos soros destes indivíduos foram comparados à com os dos ratos. Aproximadamente 32 proteínas de 11 a 230 kDa foram reconhecidas pelo soros dos ratos naturalmente infectados com M. pulmonis. Os soros dos bioteristas que estão envolvidos por mais de 7 anos na higenização das caixas com animais infectados reconheceram cerca de 10 proteínas deste microrganismo. O soro de indivíduos com menos tempo de serviço neste ambiente ou aqueles que nunca estiveram em biotérios reconhecerem poucas proteínas. As proteínas de aproxi-madamente 117 and 95 kDa foram reconhecidas pelo soro de ratos, humanos e soros controle negativos. Embora desconhece-se um soro humano positivo contra M. pulmonis, este estudo apresenta o perfil imunoeletroforético dos indivíduos expostos a este microrganismo.