Avaliação da infecção do vírus influenza em astrócitos como um fator de risco para os transtornos do neurodesenvolvimento

O vírus Influenza pertence à família Orthomyxoviridae. Há quatro tipos de vírus da Influenza: A, B, C e D. O tipo A é o responsável pelos grandes eventos pandêmicos e epidemias sazonais, sendo considerado mais virulento e geneticamente variável, possuindo a capacidade de atingir um grande espectro de reservatórios animais, entre mamíferos e aves. A infecção do vírus Influenza ocorre a partir do contato do vírus com a mucosa do trato respiratório superior, onde ocorre a ligação, entrada do vírus e consequentemente a infecção do hospedeiro. Evidências mostram que essa infecção pode mostrar alterações no cérebro como morfologia neuronal hipocampal prejudicada e habilidades cognitivas, problemas no córtex. Além disso, foi observado que infecções por Influenzadurante a gestação podem gerar sequelas neurocomportamentais e psicológicas, inflamação placentária, problemas no desenvolvimento cerebral no feto, com respostas de citocinas associadas a infecção e a neuroinflamação. Os astrócitos têm papel muito importante no sistema nervoso central dando suporte para o neurônio, regulando homeostase e por isso, entender sua morfologia, funcionalidade e perfil molecular antes e depois da infecção foi importante para entendermos o papel do vírus Influenza nessas células. Neste trabalho conseguimos observar que os astrócitos sofrem alterações na sua estrutura, fazendo com que as células fiquem arredondadas, sem estrutura estrelada e ramificada após a infecção pelo vírus Influenza, tendo a possibilidade de gerar problemas na sua funcionalidade e consequentemente problemas do neurodesenvolvimento.

The Influenza virus belongs to the Orthomyxoviridae family. There are four types of Influenza viruses: A, B, C and D. Type A is responsible for the great pandemic events and seasonal epidemics, being considered more virulent and genetically variable, possessing the capacity to reach a large spectrum of animal reservoirs, among mammals and birds. Influenza virus infection occurs from the contact of the virus with the mucous membrane of the upper respiratory tract, where bonding occurs, virus entry and consequently infection of the host. Evidence shows that this infection can show alterations in the brain such as impaired hippocampal neuronal morphology and cognitive abilities, problems in the cortex. Furthermore, it has been observed that Influenza infections during pregnancy can generate neurobehavioral and psychological sequelae, placental inflammation, problems in brain development in the fetus, with cytokine responses associated with infection and neuroinflammation. The astrocytes have a very important role in the central nervous system giving support to the neuron, regulating homeostasis and therefore, understanding their morphology, functionality and molecular profile before and after infection was important to understand the role of the Influenza virus in these cells. In this work we were able to observe that the astrocytes suffer alterations in their structure, making the cells rounded, without a stellate and branched structure after infection by the Influenza virus, with the possibility of generating problems in their functionality and consequently problems of neurodevelopment.

Estudo dos efeitos morfológicos, comportamentais e epigenéticos da administração de doxorrubicina no período da infância de ratos Wistar, tratados ou não com resveratrol ou curcumina, e avaliados em idade adulta

As antraciclinas são potentes agentes quimioterápicos que revolucionaram o manejo do câncer infantil. Elas formam a base de uma série de protocolos terapêuticos usados para tratar tumores sólidos e hematológicos em crianças. Efeitos físicos e psicológicos adversos de longo prazo acompanham a sobrevivência de muitas das crianças curadas e submetidas a protocolos quimioterapêuticos e podem não se manifestar até a idade adulta, afetando diversos aspectos da função cognitiva, incluindo alterações de atenção, memória, velocidade de processamento, intelecto, desempenho acadêmico e saúde emocional. Objetivo: O presente estudo busca investigar a ocorrência da disfunção cognitiva em ratos adultos tratados com doxorrubicina (DOX) durante a infância, em associação ou não com o resveratrol (RSV), um polifenol natural que possui efeitos nootrópicos, ou com a curcumina (CUR), um pigmento amarelo extraído da Curcuma longa, que possui ação antioxidante e anti-inflamatória, analisando-se os possíveis efeitos morfológicos, comportamentais e epigenéticos de tais administrações. Métodos: Foram utilizados ratos Wistar machos, com duas semanas de idade, injetados com DOX (2,5 mg/kg, uma vez por semana, via intraperitoneal - IP, durante três semanas e 0,1 mL/kg/dia de água destilada por via oral - VO), em associação ou não com RSV (10 mg/kg/dia, durante o mesmo período, VO), ou com CUR (100 mg/kg/dia, durante o mesmo período, VO). Os animais do grupo controle receberam uma injeção semanal de solução fisiológica a 0,9% por via IP (mesmo volume) e água destilada diariamente (VO). Durante o período experimental, foram realizados estudos comportamentais, incluindo o teste de campo aberto, o teste de reconhecimento de novos objetos e o teste do labirinto de Barnes. Os encéfalos foram coletados e analisados pela técnica de coloração com hematoxilina-eosina e por imuno-histoquímica para a GFAP (glial fibrillary acidic protein) em astrócitos; para o marcador de micróglia Iba1 e para o marcador de apoptose caspase-3. As áreas analisadas incluíram o córtex frontal, o hipocampo (CA1, CA2 e CA3) e o hipotálamo. A análise morfométrica demonstrou que os ratos injetados com DOX apresentaram maior expressão de GFAP, Iba1 e caspase 3 em todas as áreas analisadas e que, tanto o RSV, quanto a CUR, foram capazes de diminuir tais expressões. A administração de DOX durante a infância foi capaz de causar prejuízos à memória espacial, e às memórias de curto e de longo prazo na vida adulta dos animais. Tais alterações foram prevenidas pela CUR, mas não pelo RSV. A DOX, em associação ou não com RSV e CUR, também demonstrou interferir, a longo prazo, na atividade de enzimas modificadoras da metilação (SET1A, SUV39, EZH2, KDM5B, KDM4A e KDM6B) e da acetilação de histonas (HAT1, SIRT1 e PCAF) na região do hipocampo destes animais. Os resultados sugerem que a astrogliose, a microgliose e a apoptose apresentadas na idade adulta estão relacionadas com o uso de DOX durante a infância e que o tratamento com RSV ou CUR foi capaz de minimizar tais alterações. No entanto, só a CUR demonstrou exercer efeito protetor em relação aos déficits de memória induzidos pela quimioterapia. Conclusão: Por fim, as alterações encontradas em importantes enzimas moduladoras da metilação e da acetilação de histonas na região do hipocampo sugerem que tais alterações morfológicas e comportamentais podem ser influenciadas por fatores epigenéticos e que o RSV e a CUR podem exercer ações protetivas aos danos tardios induzidos pela quimioterapia na infância.

Anthracyclines are potent chemotherapeutic agents that have revolutionized childhood cancer management. They form the backbone of a range of therapeutic treatments used to treat solid, hematologic tumors in children. Long-term adverse physical and psychological effects accompany cured children following chemotherapeutic protocols and may not manifest until adulthood, affecting several aspects of cognitive function, including changes in attention, memory, processing speed, intellect, performance academic and emotional health. The present study aims to investigate the occurrence of cognitive dysfunction in adult rats treated with doxorubicin (DOX) during childhood, in association or not with resveratrol (RSV), a natural polyphenol that has nootropic effects, or with curcumin (CUR), a yellow pigment extracted from Curcuma longa, which has antioxidant and anti-inflammatory actions, analyzing the morphological, behavioral, and epigenetic effects of such administrations. Two-week-old male Wistar rats injected with DOX (2.5 mg / kg, once a week, intraperitoneally - IP, for three weeks and 0.1 mL / kg / day of distilled water by oral - VO), in association or not with RSV (10 mg / kg / day, during the same period, VO), or with CUR (100 mg / kg / day, during the same period, VO). The animals in the control group received a weekly injection of 0.9% saline solution via IP (same volume) and daily distilled water (VO). During the experimental period, behavioral studies were carried out, including the open field test, the new object recognition test, and the Barnes maze test. The brains were collected and analyzed by the hematoxylin-eosin staining technique and by immunohistochemistry for GFAP (glial fibrilary acidic protein) in astrocytes; for the microglia marker Iba1 and for the apoptosis marker caspase-3. Areas investigated included the frontal cortex, the hippocampus (CA1, CA2 and CA3) and the hypothalamus. Morphometric analysis showed that rats injected with DOX presented increased expression of GFAP, Iba1 and caspase 3 in all areas and that both RSV and CUR were able to prevent such increases. The administration of DOX during childhood was able to impair spatial memory, and short- and long-term memories during adult life. Such deficits were prevented by CUR administration, but not with RSV. DOX, in association or not with RSV and CUR also affected, in the long term, the activity of methylation modifying enzymes (SET1A, SUV39, EZH2, KDM5B, KDM4A and KDM6B) and of acetylation enzymes (HAT, SIRT1 and PCAF) for histones in the hippocampus of these animals. The results suggest that astrogliosis, microgliosis and apoptosis in adulthood are related to the use of DOX during childhood and that treatment with RSV or CUR was able to minimize changes. However, only CUR presented a protective effect in relation to chemotherapy-induced memory deficits. Finally, changes found in important histone methylation and acetylation modulating enzymes in the hippocampus suggest that morphological and behavioral changes may be influenced by epigenetic factors and that RSV and CUR may exert preventive actions against late changes induced by childhood chemotherapy.

Estudos dos efeitos morfológicos e comportamentais da administração de doxorrubicina associada à curcumina e ao resveratrol em ratos wistar

A doxorrubicina (DOX) é conhecida por causar prejuízos cognitivos em pacientes submetidos a longos períodos de quimioterapia (déficits conhecidos como chemobrain). Existe, assim, urgente necessidade por estratégias terapêuticas capazes de permitir o retorno dos sobreviventes de câncer a sua prévia qualidade de vida. A curcumina (CUR), pigmento de coloração amarela extraído de rizomas de cúrcuma (Curcuma longa L.), e o resveratrol (RSV), um polifenol natural, possuem atividades antioxidantes e anti-inflamatórias. Objetivo: O objetivo deste estudo foi o de investigar os efeitos comportamentais e morfológicos da administração de CUR e RSV em associação com a DOX, a fim de verificar se tais substâncias podiam aliviar a neurotoxicidade descrita para a DOX. Métodos: Ratos Wistar, machos adultos, foram divididos em 4 grupos: DOX (2,5 mg/kg/semana por 4 semanas, via intraperitoneal - i.p.), DOX+RSV (DOX, 2,5 mg/kg/semana por 4 semanas, i.p.; RSV, 10 mg/kg/dia por 28 dias, gavagem), DOX+CUR (DOX, 2,5 mg/kg/semana por 4 semanas, i.p.; CUR, 100 mg/kg/dia por 28 dias, gavagem) e controle (CTR, solução salina a 0,9%, i.p.). Foram realizadas análises comportamentais (campo aberto e teste de reconhecimento de novos objetos - NORT). Os encéfalos foram coletados e processados para a análise histopatológica pelas técnicas de coloração luxol fast blue e hematoxilina-eosina e imuno-histoquímica para expressão de GFAP (proteína glial fibrilar ácida) em astrócitos e de Iba1 (molécula adaptadora de ligação de cálcio ionizado 1) na micróglia. Resultados: Os ratos injetados com DOX apresentaram comprometimento da memória de curto e longo prazo, como visto no NORT às 3 e 24 horas após a habituação, e aumento da expressão de GFAP e de Iba1, respectivamente, em astrócitos e na micróglia do córtex frontal, hipotálamo e hipocampo. Tais déficits cognitivos foram revertidos pela CUR em ambos os períodos e pelo RSV às 24 horas. A astrogliose e a microgliose induzidas pela DOX foram revertidas pelo RSV, assim como pela CUR. Não foram observados sinais de desmielinização e de perda neuronal em qualquer grupo. Conclusão: Dessa forma, a CUR e o RSV se mostraram capazes de reverter a perda de memória, a astrogliose e a microgliose induzidas pela quimioterapia com DOX.

ABSTRACT Doxorubicin (DOX) is known to cause cognitive impairments in patients submitted to long-term chemotherapy (deficits also known as chemobrain). Therefore, there is an urgent need for therapeutic strategies capable of returning cancer survivors back to their previous quality of life. The present study investigated whether resveratrol (RSV) or curcumin (CUR) administration could affect mnemonic function and brain morphological changes following DOX administration in rats. Male Wistar rats were divided into 4 groups: DOX group (2.5 mg/kg/week for 4 weeks, i.p., plus distilled water for 28 days, oral gavage - OG), DOX+RSV group (DOX, 2.5 mg/kg/week for 4 weeks, i.p., plus RSV, 10 mg/kg/day for 28 days, OG), DOX+CUR group (DOX, 2.5 mg/kg/week for 4 weeks, i.p., plus CUR, 100 mg/kg/day for 28 days, OG) and control (CTR) group (0.9% saline solution/week for 4 weeks, i.p., plus distilled water for 28 days, OG). Behavioral analyses (open field - OF - and the novel object recognition test - NORT) were performed. Brains were collected and analyzed by hematoxylin-eosin and luxol fast blue staining techniques and by immunohistochemistry for GFAP (glial fibrillary acidic protein) expression in astrocytes and Iba1 (ionized calcium-binding adaptor molecule 1) expression in microglia. DOX-injected rats presented short-term and long-term memory impairments as seen in the NORT at 3 and 24 hours after habituation and increased GFAP and Iba1 expression, respectively, in astrocytes and microglia of the frontal cortex, hypothalamus and hippocampus. Such cognitive deficits were reverted by CUR at both periods and by RSV at 24 hours. DOXinduced astrogliosis and microgliosis were reverted by RSV and CUR. No signs of demyelination or neuronal loss were found in any group. Thus, CUR and RSV reverted memory loss, astrogliosis and microgliosis induced by DOX monotherapy.

TERAPIA COM OZÔNIO NO CONTROLE DE LESÕES CEREBRAIS EM RATOS NEONATOS COM HIDROCEFALIA EXPERIMENTAL

Hidrocefalia é uma doença neurológica comum em neonatos e que está associada à destruição de axônios periventriculares decorrente de processos isquêmicos, oxidativos e inflamatórios consequentes à dilatação ventricular. Nos casos onde a derivação liquórica é inviabilizada, tratamentos conservativos são usados como teraria neuroprotetora. A terapia com ozônio (O3) tem sido associada a efeitos neuroprotetores por controlar processos oxidativos, inflamatórios e degenerativos em lesões isquêmicas ou associadas à idade. O objetivo deste estudo foi investigar, os efeitos da ozonioterapia no comportamento, desenvolvimento motor e astrogliose reativa em encéfalos de ratos jovens com hidrocefalia. Trinta e dois ratos foram separados aleatoriamente em quatro grupos de oito animais sendo: grupo controle (C); grupo controle + O3 (CO3); grupo hidrocefálico não tratado (HNT); grupo hidrocefálico tratado com O3 (HTO3). Os animais dos grupos HNT e HTO3 foram induzidos à hidrocefalia com sete dias de idade por injeção de caulim a 10% na cisterna magna. Com 14 dias de idade, os grupos CO3 e HTO3 receberam quatro tratamentos de O3 medicinal na dose de 0,1mg/kg, na concentração de 5µg/mL via intraperitoneal. Os ratos foram pesados diariamente e expostos a testes de comportamento até o final do experimento. Todos os animais foram submetidos à eutanásia com 28 dias de vida, e seus encéfalos retirados e processados para análise histológica e imunoistoquímica do corpo caloso e matriz germinativa. Ratos do grupo HNT apresentaram pior desempenho em teste de comportamento de campo aberto quando comparados aos ratos C e CO3 (P =0,0202). Além disso, esses animais apresentaram ganho de peso tardio comparado aos demais grupos. Os animais HTO3 obtiveram desempenho semelhante ao grupo C nos testes de campo aberto e maior ganho de peso quando comparado ao grupo HNT. Na avaliação histológica convencional observou-se que a hidrocefalia produziu redução da população de células neurais e sinais sugestivos de morte nas células remanescentes nas estruturas encefálicas estudadas, além de evidências de lesões nas fibras nervosas, com sinais de edema e esgarçamento. Após estudo por imunoistoquímica para GFAP, foi observado também que a hidrocefalia causou reação astrocitária nessas mesmas estruturas. Todas as lesões observadas foram atenuadas após o tratamento com administração de O3. Esses achados indicam que a ozonioterapia possui potencial ação neuroprotetora mediada em parte, pela regulação da reação astrocitária.

Hydrocephalus is a common neurological disease in neonates and is associated with the destruction of periventricular axons due to ischemic, oxidative and inflammatory processes resulting from ventricular dilation. In cases where the ventricular shunt is not viable, conservative treatments are used as would be neuroprotective. Ozone therapy (O3) has been associated with neuroprotective effects by controlling oxidative, inflammatory and degenerative processes in ischemic or agerelated injuries. The objective of this study was to investigate, the effects of ozone therapy on behavior, motor development and reactive astrogliosis in young rats with hydrocephalus. Thirty-two rats were randomly divided into four groups of eight animals: control group (C); control group + O3 (CO3); untreated hydrocephalic group (HNT); hydrocephalic group treated with O3 (HTO3). The animals of the groups HNT and HTO3 were induced to hydrocephalus at seven days of age by injection of 10% kaolin in the cisterna magna. At 14 days of age, the CO3 and HTO3 groups received four treatments of medicinal O3 at a dose of 0.1mg / kg, at a concentration of 5µg / mL intraperitoneally. The rats were weighed daily and exposed to behavioral tests until the end of the experiment. All animals were euthanized at 28 days of age, and their brains removed and processed for histological and immunohistochemical analysis of the corpus callosum and germinal matrix. Rats from the HNT group showed worse performance in the open field behavior test when compared to C and CO3 rats (P = 0.0202). In addition, these animals showed late weight gain compared to the other groups. The HTO3 animals obtained similar performance to group C in the open field tests and greater weight gain when compared to the HNT group. In the conventional histological evaluation, it was noted that hydrocephalus produced a reduction in the cell population and signs suggestive of death in the remaining cells in the brain structures studied, in addition to evidence of damage to nerve fibers, with signs of edema and fraying. After immunohistochemistry study for GFAP, it was also observed that hydrocephalus caused an astrocytic reaction in these same structures. All lesions observed were alleviated after treatment with O3 administration. These findings indicate that ozone therapy may have a potential neuroprotective action mediated in part by regulation of the astrocytic reaction.

EFEITOS MORFOLÓGICOS DA ADMINISTRAÇÃO DE CURTA DURAÇÃO DO METOTREXATO SOBRE O SISTEMA NERVOSO CENTRAL DE RATOS

O metotrexato (MTX), uma droga antifolato, é amplamente utilizado em protocolos quimioterápicos para tumores cerebrais primários e metastáticos e algumas doenças autoimunes. Sua eficácia para tumores, porém, é limitada pela alta incidência de complicações neurológicas no sistema nervoso central (SNC), embora o mecanismo patogênico e o(s) alvo(s) celular(es) da neurotoxicidade do MTX ainda sejam desconhecidos. Este estudo teve como objetivo observar a resposta astrocitária à administração sistêmica de curto prazo de MTX em ratos adultos. Ratos Wistar machos receberam 5 ou 10 mg/kg/dia de MTX por via intraperitoneal por 4 dias consecutivos (respectivamente, grupos MTX5 e MTX10) ou o mesmo volume de solução salina a 0,9% (controle). No 5º dia, amostras de encéfalo foram coletadas e processadas para as colorações de hematoxilina-eosina e de luxol fast blue, bem como para investigação imuno-histoquímica da proteína ácida fibrilar glial (GFAP) e análise morfométrica no córtex frontal, hipocampo, hipotálamo e camadas molecular/granular do cerebelo. Os níveis encefálicos das citocinas pró-inflamatórias TNF- e IL-1 foram determinados por ELISA. Nenhum sinal de perda neuronal ou de desmielinização foi observado nos diferentes grupos. O aumento da expressão de GFAP foi encontrado em todas as áreas dos grupos MTX, sendo ligeiramente maior no grupo MTX10. Os níveis encefálicos de ambas citocinas diminuíram no grupo MTX5 em relação aos controles. No grupo MTX10, o TNF- diminuiu, embora a IL-1 estivesse aumentada em comparação ao controle. A administração do MTX induziu a astrogliose em várias áreas do encéfalo. No grupo MTX5, aparentemente ocorreu na presença de citocinas pró-inflamatórias diminuídas.

Methotrexate (MTX), an antifolate drug, is widely used in chemotherapeutic protocols for metastatic and primary brain tumors and some autoimmune diseases. Its efficacy for brain tumors is limited by the high incidence of central nervous system (CNS) complications, although the mechanism and cellular target(s) of its neurotoxicity are still unclear. This investigation aimed to observe astrocytic response to systemic short-term MTX administration in adult rats. Male Wistar rats received 5 or 10 mg/kg/day of MTX by intraperitoneal route for 4 consecutive days (respectively, MTX5 and MTX10 groups) or the same volume of 0.9% saline solution (control group). On the 5th day, brain samples were collected for hematoxylin-eosin and luxol fast blue staining techniques, as well as for glial fibrillary acidic protein (GFAP) immunohistochemistry and morphometric analysis in the frontal cortex, hippocampus, hypothalamus and molecular/granular layers of the cerebellum. Brain levels of the proinflammatory cytokines TNF- and IL-1 were determined by Elisa. No signs of neuronal loss or demyelination were observed in all groups. Increased GFAP expression was found in all areas from the MTX groups, although it was slightly higher in the MTX10 group compared to the MTX5. Both TNF- and IL-1 levels were decreased in the MTX5 group compared to controls. In the MTX10 group, TNF- decreased, although IL-1 was increased relative to controls. MTX administration induced astrogliosis in several CNS areas. In the MTX5 group, it apparently occurred in the presence of decreased proinflammatory cytokines.

CHEMOBRAIN EM RATOS: ESTUDO DOS EFEITOS MORFOLÓGICOS, OXIDATIVOS, INFLAMATÓRIOS E COMPORTAMENTAIS DA ADMINISTRAÇÃO DO QUIMIOTERÁPICO DOXORRUBICINA

A doxorrubicina (DOX), um agente interativo da topoisomerase, é comumente utilizada no tratamento de vários tipos de câncer. Esta droga é conhecida por causar prejuízos cognitivos em indivíduos submetidos à quimioterapia de longo prazo (déficits também chamados de chemobrain). O presente estudo investigou se alterações morfológicas, oxidativas, inflamatórias e comportamentais poderiam ser induzidas por DOX. Ratos Wistar machos foram injetados com DOX (2,5 mg/kg, uma vez por semana, durante 28 dias, via intraperitoneal IP) ou solução fisiológica a 0,9% (mesmo volume, IP). Durante o período experimental, foram realizados estudos comportamentais, incluindo o teste de campo aberto, o de labirinto em cruz elevada, e os testes de preferência social e de reconhecimento de novo objeto (NORT). Os encéfalos foram coletados e analisados por técnicas de coloração com hematoxilina-eosina e luxol fast blue, bem como por imuno-histoquímica (GFAP expressão de glial fibrilary acidic protein em astrócitos) em diferentes áreas (córtex frontal, estriado, hipocampo, hipotálamo, camadas granular e molecular do cerebelo). Os parâmetros oxidativos foram também avaliados, tais como substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR), óxido nítrico (NO), ferro e ferritina encefálicos, assim como glutationa em seus estados reduzido (GSH) e oxidado (GSSG). Os níveis séricos e encefálicos de TNF-, IL-1, IL-6, IL-8, IL-10 e CXCL1 foram determinados por ELISA. A análise morfométrica mostrou que os ratos injetados com DOX apresentaram maior expressão de GFAP em todas as áreas analisadas. A administração de DOX também aumentou os níveis dos indicadores oxidativos TBARS, NO e GR, mas diminuiu os níveis encefálicos de GSSG e de ferritina, além de causar prejuízos de memória de reconhecimento, como visto no NORT. Não foram encontrados sinais de desmielinização e/ou perda neuronal. Níveis séricos e encefálicos aumentados de IL-6, IL-8 e CXCL1 foram observados no grupo DOX, embora a IL-10 tenha diminuído. Os resultados sugerem que a astrogliose e o estresse oxidativo induzidos pela DOX podem estar associados aos déficits de memória induzidos pela quimioterapia. Como a DOX possui uma pobre penetração por meio da barreira hematoencefálica, propõe-se que a entrada de citocinas séricas inflamatórias no encéfalo possa causar as mudanças encontradas em nosso estudo.

Doxorubicin (DOX), a topoisomerase interactive agent, is commonly used to treat several types of cancer. This drug is known to cause cognitive impairments in individuals submitted to long-term chemotherapy (deficits also called as chemobrain). The present study investigated whether morphological, oxidative, inflammation and behavioral impairments could be induced by DOX. Male Wistar rats were injected with DOX (2.5 mg/kg, once every week for 28 days, intraperitoneal route-IP) or 0.9% saline solution (same volume, IP). During the experimental period, behavioral studies were performed, including the open field test, the elevated plus maze, tests for social preference ande the novel object recognition task (NORT). Brains were collected and analyzed by hematoxylin-eosin and luxol fast blue staining techniques and by immunohistochemistry (GFAP- glial fibrillary acidic protein expression in astrocytes) in different areas (frontal cortex, striatum, hippocampus, hypothalamus, granular and molecular layers of the cerebellum). Oxidative parameters were also assessed, such as thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR), nitric oxide (NO), brain iron and ferritin levels, as well as glutathione in its reduced (GSH) and oxidized (GSSG) states. Serum and brain levels of TNF-, IL-1, IL-6, IL-8, IL-10 and CXCL1 were determined by ELISA. Morphometric analysis showed that DOX-injected rats presented increased GFAP expression in all analyzed areas. DOX administration also increased the levels of the oxidative indicators TBARS, NO and GR, but decreased GSSG and brain ferritin levels, and caused memory impairments as seen in the NORT. No signs of demyelination and/or neuronal loss were found. Increased serum and brain levels of IL-6, IL-8 and CXCL1 were noted in the DOX group, although IL-10 decreased. Results suggest that astrogliosis and oxidative stress induced by DOX may be linked to chemotherapy-induced memory deficits. As DOX has a poor penetration across the blood-brain barrier, it is proposed that the entry of serum inflammatory cytokines into the brain may cause the changes found in our study.

Redução da expressão astrocitária de proteína glial fibrilar ácida em cães tratados com dexametasona

Glial fibrillary acidic protein (GFAP) is the most important marker of astrocytes, that are the major glial cells in the nervous tissue and exhibit receptors to several steroid hormones, which have an apparent influence in their genic expression. The aim of this study was to evaluate if dexamethasone (DX) administration in therapeutic protocols to dogs would be capable of affecting the astrocytic expression of the protein. Samples from the pons and the spinal cord of dogs, treated (n=6) or not (n=6) with DX, were submitted to GFAP immunohistochemical staining and astrocytic reactivity was determined by colorimetry in a computer system for image analysis. Difference statistically significant was noted for the mean areas stained with GFAP in the pons of dogs treated and non-treated with DX, as well as in the spinal cord of dogs which previously received or not DX, with clear tendency of drug-induced reduction in the astrocyte expression of this protein. GFAP expression in the spinal cord was greater than in the pons, regardless the use of DX or not.

A proteína glial fibrilar ácida (GFAP) constitui o principal marcador dos astrócitos, as células gliais mais numerosas do tecido nervoso e que exibem receptores a diversos hormônios esteroidais, os quais exercem aparente influência sobre a expressão gênica das mesmas. O objetivo do presente estudo foi o de avaliar se a administração de dexametasona (DX) em protocolos terapêuticos para cães seria capaz de afetar a expressão astrocitária dessa proteína. Para tal, amostras da ponte e da medula espinhal torácica de cães, tratados (n=6) ou não (n=6) com DX, foram submetidas à marcação imuno-histoquímica para a GFAP e a reatividade astrocitária foi determinada por colorimetria em um sistema computacional de análise de imagens. Diferença estatisticamente significativa foi constatada para as médias das áreas marcadas para GFAP na ponte de cães tratados e não-tratados com DX, assim como na medula espinhal torácica dos que haviam recebido previamente o corticoide ou não, com clara tendência, induzida pela droga, de redução da expressão astrocitária da proteína. Além disso, a expressão de GFAP na medula espinhal foi maior que na ponte, independentemente do emprego de DX ou não.

Redução da expressão astrocitária de proteína glial fibrilar ácida em cães tratados com dexametasona

Glial fibrillary acidic protein (GFAP) is the most important marker of astrocytes, that are the major glial cells in the nervous tissue and exhibit receptors to several steroid hormones, which have an apparent influence in their genic expression. The aim of this study was to evaluate if dexamethasone (DX) administration in therapeutic protocols to dogs would be capable of affecting the astrocytic expression of the protein. Samples from the pons and the spinal cord of dogs, treated (n=6) or not (n=6) with DX, were submitted to GFAP immunohistochemical staining and astrocytic reactivity was determined by colorimetry in a computer system for image analysis. Difference statistically significant was noted for the mean areas stained with GFAP in the pons of dogs treated and non-treated with DX, as well as in the spinal cord of dogs which previously received or not DX, with clear tendency of drug-induced reduction in the astrocyte expression of this protein. GFAP expression in the spinal cord was greater than in the pons, regardless the use of DX or not.

A proteína glial fibrilar ácida (GFAP) constitui o principal marcador dos astrócitos, as células gliais mais numerosas do tecido nervoso e que exibem receptores a diversos hormônios esteroidais, os quais exercem aparente influência sobre a expressão gênica das mesmas. O objetivo do presente estudo foi o de avaliar se a administração de dexametasona (DX) em protocolos terapêuticos para cães seria capaz de afetar a expressão astrocitária dessa proteína. Para tal, amostras da ponte e da medula espinhal torácica de cães, tratados (n=6) ou não (n=6) com DX, foram submetidas à marcação imuno-histoquímica para a GFAP e a reatividade astrocitária foi determinada por colorimetria em um sistema computacional de análise de imagens. Diferença estatisticamente significativa foi constatada para as médias das áreas marcadas para GFAP na ponte de cães tratados e não-tratados com DX, assim como na medula espinhal torácica dos que haviam recebido previamente o corticoide ou não, com clara tendência, induzida pela droga, de redução da expressão astrocitária da proteína. Além disso, a expressão de GFAP na medula espinhal foi maior que na ponte, independentemente do emprego de DX ou não.

Resposta astrocitária de expressão da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) ante a administração de drogas empregadas no tratamento da dor neuropática

Uma grande variedade de drogas é utilizada em situações de dor aguda, crônica e neuropática. Os efeitos pelos quais certos analgésicos agem sobre as células do sistema nervoso central, incluindo astrócitos, não são totalmente compreendidos. Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi o de observar, após administração de doses de curta duração de fluoxetina, dipirona, carbamazepina, amantidina e quetamina S, a expressão da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) no córtex frontal, hipotálamo e substância cinzenta periaquedutal (PAG). Para isso, ratos Wistar foram divididos em 6 grupos com 6 animais cada: Grupo 1: Solução salina 0,9% - 1ml, via intraperitoneal (IP), Grupo 2: fluoxetina-10 mg/kg (IP), Grupo 3: carbamazepina, 40 mg/kg (IP), Grupo 4: dipirona, 200 mg/kg (IP), Grupo 5: amantadina, 100 mg/kg (IP) e Grupo 6: cloridrato de quetamina S, 100 mg/kg (IP). Após 10 dias, foi realizada a colheita das amostras de encéfalo para estudo imuno-histoquímico para a GFAP. Nossos resultados demonstram que todas as drogas administradas aumentaram a expressão da GFAP no hipotálamo e no córtex frontal em relação ao grupo salina. Na PAG, apenas a amantadina, a fluoxetina e quetamina aumentaram essa expressão. Pode-se concluir que todas as drogas tiveram capacidade de alterar a expressão de GFAP, que variou de acordo com a região observada. Mais estudos devem ser feitos a fim de esclarecer os efeitos desses analgésicos em astrócitos, tanto na ausência como na presença de estímulos nocivos.

A wide variety of drugs are used in situations of acute, chronic and neuropathic pain. The effects by which certain analgesics act on central nervous system cells, including astrocytes, are not fully understood. Thus, the objective of the present study was to observe the expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in the frontal cortex, hypothalamus and periaquedutal gray (PAG) after administration of short doses of fluoxetine, dipyrone, carbamazepine, amantidine and ketamine S. For this, Wistar rats were divided into 6 groups with 6 animals each: Group 1: Saline solution 0.9% - 1 ml, intraperitoneal (IP), Group 2: fluoxetine 10 mg / kg (PI), Group 3: carbamazepine 100 mg / kg (IP) and Group 6: ketamine hydrochloride S, 100 mg / kg (IP), Group 4: dipyrone, 200 mg / kg (IP). After 10 days, brain samples were collected for immunohistochemical study for GFAP. Our results demonstrate that all drugs administered increased GFAP expression in the hypothalamus and frontal cortex in relation to saline group. At PAG, only amantadine, fluoxetine and ketamine increased this expression. We can conclude that all drugs were able to alter the expression of GFAP, which varied according to the region observed. Further studies should be done to clarify the effects of these analgesics on astrocytes, both in the absence and presence of noxious stimuli.

Estudo comportamental e da expressão astrocitária de GFAP em ratos submetidos ao LPS e tratados com maropitant

O maropitant é um antagonista do receptor de NK-1 e um antiemético amplamente utilizado em cães e gatos. Diversas evidências sugerem que o maropitant possui efeitos anti-inflamatórios e ansiolíticos. Os astrócitos possuem receptores NK-1 e se caracterizam pela presença de prolongamentos dotados de filamentos intermediários, cujo componente básico é a proteína glial fibrilar ácida (GFAP), principal marcador para este tipo celular. O objetivo do presente estudo foi o de analisar se o maropitant tem o potencial de alterar a expressão astrocitária de GFAP e o comportamento de ratos expostos ao modelo de comportamento doentio induzido pelo LPS. Foram utilizados 40 ratos Wistar machos, divididos nos seguintes grupos: SAL - solução salina 0,9% (IP), MAR - maropitant (20mg/kg,IP), LPS - LPS (100 µg/kg,IP), LPS + MAR - LPS + maropitant. Os animais foram submetidos aos testes comportamentais de campo aberto, que avaliam, principalmente, a atividade motora e exploratória, em que foram aferidos os parâmetros: frequência locomotora, grooming, rearing e contagem de bolos fecais. Os animais também foram submetidos ao teste claro-escuro, que avalia principalmente a ansiedade, em que foram aferidos os parâmetros: tempo de permanência nos compartimentos claro e escuro, rearing e frequência locomotora. Foi realizada a coleta do encéfalo para análise imuno-histoquímica da expressão astrocitária de GFAP. Nossos resultados demonstram que o maropitant teve capacidade de agir no comportamento ansioso nos testes de campo aberto e claro/escuro, porém não suprimiu o comportamento doentio no grupo tratado com LPS. A expressão de GFAP diminuiu no grupo LPS+MAR em relação ao grupo LPS, demonstrando que o maropitant conseguiu reduzir a ativação astrocitária causada pelo LPS. Pode-se concluir que o maropitant foi capaz de atenuar a astrogliose induzida pelo LPS e promoveu redução da defecação, porém não alterou o comportamento doentio causado pelo LPS.

Maropitant is an NK-1 receptor antagonist and an anti-emetic widely used in dogs and cats. Several evidences suggest that maropitant has anti-inflammatory and anxiolytic effects. Astrocytes are the most numerous glial cells present in the CNS, have NK-1 receptors and are characterized by the presence of extensions filled with intermediate filaments whose main component is the glial fibrillary acidic protein (GFAP), which serves as the main marker for this cellular type. Considering this, the objective of this study was to demonstrate if maropitant had the potential of altering the astrocytic expression of GFAP and the behavior of rats exposed to LPS model. Forty male Wistar rats were divided into the following groups: SAL - saline solution 0.9% (IP), MAR - maropitant (20mg / kg, IP), LPS (100 g / kg, IP) and LPS+MAR. The animals were submitted to the behavioral tests of the open field, which evaluated mainly motor and exploratory activity, and the parameters were evaluated: locomotor frequency, grooming, rearing and defecation. The animals were also submitted to the light-dark test, which evaluated the anxiety mainly, and the parameters were evaluated: time spent in the light and dark compartments, rearing and locomotor frequency. Brain samples were collected for the immunohistochemical analysis of the astrocytic expression of GFAP. Our results demonstrate that maropitant was able to act on anxious behavior in the open field and light / dark tests, but did not suppress the sickness behavior in the group treated with LPS. GFAP expression decreased in the LPS+MAR group in relation to the LPS group demonstrating that maropitant was able to reduce the astrocytic activation caused by LPS. It can be concluded that the maropitant was able to attenuate the astrogliosis induced by LPS and promoted reduction of defecation, however, it potentiated the sickness behavior caused by LPS.

Estudo transgeracional da expressão astrocitária de GFAP após dieta hipercalórica em ratas

Sabe-se que a obesidade tem tomado proporções alarmantes em todo o mundo nas últimas décadas, sendo considerada um problema grave de saúde e um fator de risco para o diabetes, a hipertensão arterial sistêmica, alguns tipos de câncer, certas desordens reprodutivas e distúrbios metabólicos. Neste estudo, objetivou-se observar a resposta astrocitária transgeracional em diferentes áreas do sistema nervoso central (SNC) por meio da expressão da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) após uma dieta hipercalórica (HD) em ratas. Observou-se que ratas alimentadas com HD altamente palatável (Ensure ®) durante a puberdade (23-65 dias de idade) apresentaram aumento significativo da expressão de GFAP em todas as áreas do SNC avaliadas, quando comparadas às ratas que receberam dieta normocalórica (ND) na geração F0. Ao analisar-se a reação astrocitária após desafio com lipopolissacarídio (LPS) na geração F1, foram observadas alterações fenotípicas adaptativas, com redução da área de processos astrocitários nas diferentes áreas do SNC analisadas após desafio com LPS nos machos nascidos das mães que receberam HD em relação àqueles originários de mães alimentadas com ND.

It is known that obesity has taken alarming proportions in the whole world for the past decades, been considered a severe health problem and a potencial risk for diabetes, sistemic arterial hypertension, some types of cancer and certain reproductive and metabolic disorders. In this study, the goal was to observe the astrocytic transgenerational response in different areas of the central nervous system (CNS) through the expression of the glial fibrillary acidic protein (GFAP) after a hypercaloric diet (HD) in rats. Is was observed that the rats that were fed with highly palatable HD (Ensure ®) during puberty (23-65 days old) presented a significant increase of GFAP expression in all SNC evaluated areas, when compared to rats that received a normocaloric diet (ND) in generation F0. While analyzing the astrocytic reaction after the challenge with lipopolysaccharides (LPS) in generation F1, adaptive phenotypic changes were observed, with a reduction of the area of astrocytic processes in the different SNC areas analyzed after the challenge with LPS on males born from mothers that received HD in relation to those from mothers that were fed with ND.

Expressão astrocitária da proteína fibrilar glial ácida (GFAP) e concentrações plasmáticas de TNF- e IL-1 em ratos tratados com amitriptilina, gabapentina, metadona e morfina

Citocinas pró-inflamatórias e células gliais, principalmente micróglia, têm sido implicadas na sensibilização da dor persistente. Menos conhecido é o papel dos astrócitos nessa regulação. O objetivo do estudo foi o de medir os níveis plasmáticos de IL-1 e TNF- e a expressão do marcador astrocitário GFAP, após administração, em ratos saudáveis, de doses terapêuticas de curta duração de algumas drogas comumente utilizadas no tratamento da dor neuropática. Ratos Wistar machos foram divididos em cinco (5) grupos, recebendo por nove (9) dias- (1) amitriptilina (Amt- 10 mg/kg/dia, por gavagem solução); (2) gabapentina (Gb- 60 mg/kg/dia, por gavagem); (3) metadona (Me- 4,5 mg/kg/dia, via intraperitoneal - IP); (4) morfina (Mo- 10 mg/kg/dia, IP); ou (5) salina a 0.9%, IP). Amostras do encéfalo foram coletadas para estudo imuno-histoquímico da expressão astrocitária de GFAP no tronco encefálico e núcleo accumbens (NAc). A área das células GFAP-positivas foi calculada com uso do programa Metamorph e os níveis plasmáticos de citocinas foram determinados por ELISA. Enquanto os níveis de TNF- diminuíram nos grupos tratados com Mo, Me e Gb, a IL-1 diminuiu apenas com a Me. A expressão astrocitária de GFAP diminuiu no tronco encefálico com todas as drogas, enquanto aumentou no NAc com Amt, Me e Mo.

Pro-inflammatory cytokines and glial cells, especially microglial cells, have been implicated in persistent pain sensitization. Less is known about the role of astrocytes in its regulation. The aim of this study was to measure, after the administration of short-term therapeutic doses of some commonly used neuropathic pain relievers in healthy rats, the plasma levels of IL-1 and TNF- and the expression of the astrocytic biomarker GFAP. Male Wistar rats were divided into 5 groups, receiving for 9 days- (1) amitriptyline (Amt- 10 mg/kg/day, by gavage); (2) gabapentin (Gb - 60 mg/kg/day, by gavage; (3) methadone (Me- 4,5 mg/kg/day, intraperitoneal route- IP); (4) morphine (Mo- 10 mg/kg/day, IP); or (5) 0.9% saline solution, IP. Brain samples were collected for immunohistochemical study for GFAP expression in the brainstem and nucleus accumbens (NAc). The area of GFAP-positive cells was calculated using Metamorph software and plasma levels of IL-1 and TNF- were measured by ELISA. Plasma TNF- levels were decreased in the groups treated with Mo, Me and Gb, but not in the Amt-treated group. IL-1 decreased only in rats treated with Me. The astrocytic expression of GFAP was decreased in the brainstem with all drugs, while it was increased in the NAc with Amt, Me and Mo.

Privação alimentar materna na geração F0 e dieta hipercalórica na geração F1 reduzem a expressão de GFAP em diversas áreas do SNC após desafio imunológico da geração F2

No presente estudo, foram analisados os efeitos da privação alimentar na gestação da geração F0 combinada com a dieta hipercalórica (HD) na puberdade da geração F1 sobre o comportamento dos astrócitos das gerações F1 e F2. O comportamento dos astrócitos foi investigado pela análise imuno-histoquímica da expressão da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) em diversas áreas do sistema nervoso central (SNC) incluindo córtex frontal, parietal, núcleo accumbens, núcleos periventricular e arqueado do hipotálamo, ponte e camadas molecular e granular do cerebelo das gerações F1 e F2. Além disso, foram observados os efeitos da ativação imunológica pelo LPS na geração F2. Na geração F1, foi observado um aumento da expressão de GFAP nos ratos fêmeas que receberam HD na puberdade em relação àqueles que receberam dieta normocalórica (ND) no mesmo período. Nos machos da geração F2, foi observada uma significativa redução da expressão de GFAP em ambos os grupos cujas mães receberam HD, tratados ou não com LPS, em comparação aos grupos cujas mães receberam ND, com ou sem LPS. Esses dados sugerem que a atenuação do efeito do LPS pode ter ocorrido pelo efeito transgeracional provocado tanto pela privação alimentar durante o período gestacional na geração F0, quanto pela HD na puberdade da geração F1.

In the present study, the effects of maternal food restriction in the pregnancy of F0 generation combined with hypercaloric diet (HD) in the puberty of F1 generation on astrocyte behavior of F1 and F2 generation were investigated. The astrocyte behavior was examined by assessing the expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) by immunohistochemistry in astrocytes of several central nervous system (CNS) areas including frontal cortex, parietal cortex, nucleus accumbens, periventricular and arcuate nucleus, pons and cerebellar areas (molecular cell layer and granular cell layer) of F1 and F2 generations. In addition, the effects of immune activation by LPS in the F2 generation were observed. In the F1 generation, it was observed a larger GFAP expression in female rats that received HD on puberty than those that received normocaloric diet at the same time. In the male F2 generation, it was observed a significant reduced GFAP expression in both groups of dams generation fed with HD, treated or not with LPS, in relation to F2 generation of dams fed with normocaloric diet, treated or not with LPS. These data suggest that this attenuation of LPS effect can be occurred by a transgenerational effect of both, maternal food deprivation in pregnancy of F0 generation and HD diet in puberty of F1 generation

Efeitos da propentofilina no comportamento em campo aberto, na trave elevada e na resposta astrocitária após injeção de droga gliotóxica no tronco encefálico

A propentofilina (PPF) é uma xantina que deprime a ativação das células gliais, cujas respostas contribuem para o dano neural durante inflamação. A injeção de brometo de etídio (EB) no sistema nervoso central induz a perda oligodendroglial e astrocitária, resultando em desmielinização, neuroinflamação e ruptura da barreira hematoencefálica. Os astrócitos sobreviventes apresentam vigorosa reação ao redor da lesão com aumento da imunorreatividade à proteína glial fibrilar ácida (GFAP). Este estudo objetivou avaliar o efeito da PPF sobre a resposta astrocitária após injúria gliotóxica. Ratos Wistar foram injetados com EB na cisterna basal e tratados ou não com PPF (12.5mg/kg/dia, intraperitoneal). Amostras do tronco encefálico foram coletadas dos 15 aos 31 dias pós-injeção de EB e processadas para estudo ultraestrutural e imuno-histoquímico para GFAP. Os resultados demonstram que a PPF reduziu a ativação astrocitária até o 21o dia, sugerindo que essa droga pode atuar na redução da cicatriz glial após injúria.

Propentofylline (PPF) is a xanthine derivative with pharmacological effects that are distinct from those of classic methylxanthines. It depresses the activation of microglial cells and astrocytes, which is associated with neuronal damage during neural inflammation and hypoxia. Our previous studies showed that PPF improved remyelination following gliotoxic lesions that were induced by ethidium bromide (EB). In the present study, the long-term effects of PPF on open field behavior in rats with EB-induced focal demyelination were examined. The effects of PPF were first evaluated in naive rats that were not subjected to EB lesions. Behavior in the beam walking test was also evaluated during chronic PPF treatment because impairments in motor coordination can interfere with behavior in the open field. The results showed that PPF treatment in unlesioned rats decreased general activity and caused motor impairment in the beam walking test. Gliotoxic EB injections increased general activity in rats that were treated with PPF compared with rats that received saline solution. Motor incoordination was also attenuated in PPF-treated rats. These results indicate that PPF reversed the effects of EB lesions on behavior in the open field and beam walking test.

Efeitos transgeracionais da dieta materna: influência da restrição alimentar e da dieta hipercalórica no fenótipo de ratos

O desenvolvimento da prole é influenciado de muitas maneiras pela geração parental, incluindo não apenas a transmissão de DNA, mas também suas marcas epigenéticas, ambientais e comportamentais. Dentre os fatores implicados no controle epigenético, está a dieta. O histórico alimentar das fêmeas, incluindo infância e adolescência, também pode impactar em mudanças fenotípicas da futura prole. Neste trabalho, demonstramos que ratos nascidos de mães alimentadas com dieta hipercalórica (HD) líquida e altamente palatável (Ensure ®), durante a puberdade (23-65 dias de idade), apresentaram alterações fenotípicas adaptativas tardias, como tendência a sobrepeso na idade adulta, pelo aumento de gordura retroperitoneal (RPF) e do número e área de adipócitos hipodérmicos, e dos níveis plasmáticos de fator de necrose tumoral (TNF-alfa), ocorrendo, porém, redução da área de processos astrocitários no hipotálamo. Curiosamente, esses animais também apresentaram resposta diferenciada do sistema nervoso central (SNC) ao desafio por lipopolissacarídeo (LPS), sendo mais resistentes a desenvolver comportamento doentio. Também demonstramos que ratos de duas gerações (F1 e F2) com dieta normal, cujas avós (geração F0) foram submetidas a 40% de restrição alimentar entre os dias 15 -18 da gestação, apresentaram alterações hipotalâmicas fenotípicas, na prole, compatíveis com maior sensibilidade à neuroinflamação, indicando claramente a tendência desses em acumular gordura subcutânea, principalmente na geração F2.

The development of the offspring is affected in many ways by the parental generation, comprising not only transmission of DNA, but also their epigenetic marks, environmental and behavioral. Diet is one of the factors related to epigenetic control. The dietary history of females, including childhood and adolescence, it can also impact on phenotypic changes in future offspring. In this study we demonstrate that rats born to mothers fed with liquid and highly palatable hypercaloric diet (Ensure ®) during puberty (23-65 days old) presented delayed adaptive phenotypic alterations, such as tendency to overweight in adulthood caused by increase of retroperitoneal fat and the number and area of hypodermic adipocytes, and plasma levels of tumor necrosis factor (TNF-alpha), but reducing the area of astrocytic processes in the hypothalamus. Interestingly, these animals also presented different responses in the central nervous system (CNS) related to challenge by lipopolysaccharide (LPS), being more resistant to developing sickness behavior. We also demonstrated that rats of two generations (F1 and F2) on a normal diet, which the grandparents (F0 generation) were submitted to 40% food restriction between 15 -18 days of gestation showed phenotypic changes in hypothalamic offspring compatible with higher sensitivity neuroinflammation and clearly indicating the trend of accumulating subcutaneous fat mainly in the F2 generation.

The review of the methods to obtain non-neuronal cells to study glial influence on Amyotrophic Lateral Sclerosis pathophysiology at molecular level in vitro / Revisão dos métodos de obtenção de células não neuronais para o estudo da fisiopatologia da Esclerose Lateral Amiotrófica ao nível molecular in vitro

PURPOSE: Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that displays a rapid evolution. Current treatments have failed to revert clinical symptoms because the mechanisms involved in the death of motoneuron are still unknown. Recent publications have put non-neuronal cells, particularly, astrocyte and microglia, in the scenario of pathophisiology of the disease. Animal models for ALS, particularly transgenic mice expressing the human SOD1 gene with a G93A mutation (hSOD1), are available and display the phenotype of the disease at cellular and clinical levels. However, it is a lack of detailed information regarding the methods to study the disease in vitro to better understand the contribution of non-neuronal cells in the onset and progression of the pathology. METHODS: Colonies of Swiss mice and transgenic mice expressing hSOD1 mutation as well as non-transgenic controls (wild-type) were amplified after a genotyping evaluation. Disease progression was followed behaviorally and mortality was registered. Highly purified primary cultures of astrocytes and microglia from mouse spinal cord were obtained. Cells were identified by means of GFAP and CD11B immunocytochemistry. The purity of astroglial and microglial cell cultures was also accompanied by means of Western blot and RT-PCR analyses employing a number of markers. RESULTS: The disease onset was about 105 days and the majority of transgenic mice displayed the disease symptoms by 125 days of age and reached the endpoint 20 days later. A substantial motor weakens was registered in the transgenic mice compared to wild-type at the end point. Immunocytochemical, biochemical and RT-PCR analyses demonstrated a highly purified primary cultures of spinal cord astrocytes and microglia. CONCLUSION: It is possible to achieve highly purified primary cultures of spinal cord astrocytes and microglia to be employed in cellular and molecular analyses of the influence of such non-neuronal cells in the pathophysiology of ALS.

OBJETIVO: A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa fatal com evolução rápida. Os tratamentos atualmente disponíveis falham em reverter os sintomas porque os mecanismos envolvidos na morte do neurônio motor ainda não são conhecidos. Publicações recentes colocam as células não neuronais, particularmente o astrócito e a microglia, no cenário da fisiopatologia da doença. Modelos animais para a ELA, particularmente os camundongos transgênicos que expressam o gene da SOD1 humana (hSOD1) mutante estão disponíveis e mostram o fenótipo da doença ao nível celular e clínico. Entretanto, informações detalhadas são escassas sobre os métodos de estudo da doença in vitro para a melhor compreensão da participação das células não neuronais no início e na progressão da patologia. MÉTODOS: Colônias de camundongos Swiss e camundongos transgênicos que expressam a hSOD1 mutante assim como os controles não transgênicos (selvagem) foram amplificadas após avaliação genotípica. A progressão da doença foi acompanhada pelo comportamento e a mortalidade foi registrada. Culturas primárias altamente purificadas de astrócitos e microglia da medula espinal dos camundongos foram obtidas. As células foram identificadas pela immunocitoquímica da GFAP e CD11B. A pureza das culturas de astrócitos e microglia foi acompanhada pelas análises do Western blot e RT-PCR empregando-se marcadores específicos. RESULTADOS: Os primeiros sinais da doença ocorreram por volta dos 105 dias de vida e a maioria dos camundongos transgênicos já estava com a doença manifestada aos 125 dias de idade e alcançaram o estágio terminal aproximadamente 20 dias depois. Fraqueza substancial da força muscular foi registrada nos animais transgênicos comparados com os animais selvagens. Análises imuncitoquímica, bioquímica e pelo RT-PCR demonstraram culturas primárias altamente purificadas de astrócito e microglia da medula espinal dos camundongos. CONCLUSÃO: É possível obter culturas purificadas de astrócitos e microglia da medula espinal do camundongo a ser empregadas em análises celulares e moleculares da influência destas células não neuronais na fisiopatologia da ELA.

Geração de células pluripotentes induzidas de pacientes com transtorno do espectro autista

Transtorno do espectro autista (TEA) é um quadro complexo do neurodesenvolvimento associado com elevado prejuízo funcional, onde os pacientes apresentam alterações comportamentais, déficit de comunicação e problemas de sociabilização. A incidência do TEA é muito elevada e vem crescendo constantemente nos últimos anos. Atualmente a prevalência é de 1 em cada 50 crianças nos EUA, sendo os meninos mais afetados que as meninas (4:1). O diagnóstico dos pacientes com TEA é feito clinicamente e ocorre geralmente com a idade de aproximadamente três anos, idade que os sintomas ficam mais evidentes. As causas biológicas e genéticas do autismo vem sendo estudadas em modelos animais e em material biológico humano, como sangue (genéticas) e cérebro postmortem. Apesar de valiosos, esses modelos não permitem estudos das células neurais humanas em funcionamento. A geração de células neurais funcionais a partir das células previamente reprogramadas mudou esse cenário e abriu portas para gerar modelos celulares e estudar as doenças in vitro. Esse trabalho teve como objetivo modelar o TEA in vitro, a partir de neurônios e astrócitos derivados de célulastronco pluripotentes induzidas obtidas a partir das células-tronco de dente decíduo esfoliado (SHED) de pacientes com transtorno autista. Em nossos resultados observamos que neurônios autistas apresentam uma significativa diminuição na expressão de genes sinápticos quando comparados com neurônios não-autistas (controle). Além disso, ensaios funcionais de eletrofisiologia revelaram que neurônios autistas têm um número menor de picos de estimulação (spikes) por segundo, indicando neurônios possivelmente menos ativos. Em tempo, experimentos de co-cultura de neurônios e astrócitos revelaram que astrócitos autistas podem interferir na maturação e complexidade morfológica dos neurônios controle, e o inverso também foi observado, onde astrócitos de controles podem resgatar o fenótipo de neurônios autistas, sendo que um aumento significativo no nível de marcadores sinápticos, mudanças na morfologia com neurônios de pacientes mais maduros e complexos foi observado quando cultivados sobre astrócitos controles. Nossos dados indicam que os astrócitos influenciam na maturação, na complexidade e funcionalidade dos neurônios, mostrados aqui pela primeira vez para o autismo idiopático. Além disso, com este trabalho podemos afirmar que é possível modelar o autismo idiopático in vitro e estudar formas de resgate fenotípico das células afetadas na patologia visando futuras terapias para esses pacientes. A tecnologia das células reprogramadas e modelagem de doenças abre portas para novas descobertas no campo do autismo.

Autism spectrum disorder (ASD) is a group of neurodevelopmental disorders characterized by qualitative impairment communication, social interaction and restricted and repetitive patterns of behavior. The prevalence of 1 in every 50 children in The United States has been reported with a tendency to increase in recent years. Patient ASD diagnosis typically occurs by the age of 3 years and affects more boys than girls (4:1). The biological and genetic causes of autism has been studied in animal models, in human biological material such as blood and in post-mortem brain tissues. Although valuable, these models do not allow study of living human neural cells. The generation of functional neural cells from reprogrammed cells previously changed this scenario and opened doors to generate cellular models in vitro and to study diseases as autism. This study aimed to model ASD in vitro to study neurons and astrocytes derived from induced pluripotent stem cells from mesenchymal stem cells from dental pulp (SHED) from patients with idiopathic autism. In our results we found that neurons derived from patients with ASD show a significant decrease in synaptic genes compared with controls. Functional electrophysiology tests were performed and we were able to observe a smaller number of spike per second in neurons derived from patients, indicating that neurons from ASD patients has less activity than control neurons. In our co-culture assay between neurons and astrocytes we observed that astrocytes derived from patients may interfere in the maturation and morphological complexity of neurons derived from controls. On the other hand, when we grow ASD neurons on astrocytes from controls we can observe a significant increase in the level of synaptic markers, changes in morphology where we observe more mature and complex neurons. These data indicate that astrocytes influence in the maturity, complexity and functionality of neurons, data never shown before for ASD patients. With these results we can say that it is possible to model idiopathic autism in vitro. The iPSC technology and disease modeling opens doors to new discoveries and therapies for ASD patients.

The review of the methods to obtain non-neuronal cells to study glial influence on Amyotrophic Lateral Sclerosis pathophysiology at molecular level in vitro

PURPOSE: Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that displays a rapid evolution. Current treatments have failed to revert clinical symptoms because the mechanisms involved in the death of motoneuron are still unknown. Recent publications have put non-neuronal cells, particularly, astrocyte and microglia, in the scenario of pathophisiology of the disease. Animal models for ALS, particularly transgenic mice expressing the human SOD1 gene with a G93A mutation (hSOD1), are available and display the phenotype of the disease at cellular and clinical levels. However, it is a lack of detailed information regarding the methods to study the disease in vitro to better understand the contribution of non-neuronal cells in the onset and progression of the pathology. METHODS: Colonies of Swiss mice and transgenic mice expressing hSOD1 mutation as well as non-transgenic controls (wild-type) were amplified after a genotyping evaluation. Disease progression was followed behaviorally and mortality was registered. Highly purified primary cultures of astrocytes and microglia from mouse spinal cord were obtained. Cells were identified by means of GFAP and CD11B immunocytochemistry. The purity of astroglial and microglial cell cultures was also accompanied by means of Western blot and RT-PCR analyses employing a number of markers. RESULTS: The disease onset was about 105 days and the majority of transgenic mice displayed the disease symptoms by 125 days of age and reached the endpoint 20 days later. A substantial motor weakens was registered in the transgenic mice compared to wild-type at the end point. Immunocytochemical, biochemical and RT-PCR analyses demonstrated a highly purified primary cultures of spinal cord astrocytes and microglia. CONCLUSION: It is possible to achieve highly purified primary cultures of spinal cord astrocytes and microglia to be employed in cellular and molecular analyses of the influence of such non-neuronal cells in the pathophysiology of ALS.

OBJETIVO: A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa fatal com evolução rápida. Os tratamentos atualmente disponíveis falham em reverter os sintomas porque os mecanismos envolvidos na morte do neurônio motor ainda não são conhecidos. Publicações recentes colocam as células não neuronais, particularmente o astrócito e a microglia, no cenário da fisiopatologia da doença. Modelos animais para a ELA, particularmente os camundongos transgênicos que expressam o gene da SOD1 humana (hSOD1) mutante estão disponíveis e mostram o fenótipo da doença ao nível celular e clínico. Entretanto, informações detalhadas são escassas sobre os métodos de estudo da doença in vitro para a melhor compreensão da participação das células não neuronais no início e na progressão da patologia. MÉTODOS: Colônias de camundongos Swiss e camundongos transgênicos que expressam a hSOD1 mutante assim como os controles não transgênicos (selvagem) foram amplificadas após avaliação genotípica. A progressão da doença foi acompanhada pelo comportamento e a mortalidade foi registrada. Culturas primárias altamente purificadas de astrócitos e microglia da medula espinal dos camundongos foram obtidas. As células foram identificadas pela immunocitoquímica da GFAP e CD11B. A pureza das culturas de astrócitos e microglia foi acompanhada pelas análises do Western blot e RT-PCR empregando-se marcadores específicos. RESULTADOS: Os primeiros sinais da doença ocorreram por volta dos 105 dias de vida e a maioria dos camundongos transgênicos já estava com a doença manifestada aos 125 dias de idade e alcançaram o estágio terminal aproximadamente 20 dias depois. Fraqueza substancial da força muscular foi registrada nos animais transgênicos comparados com os animais selvagens. Análises imuncitoquímica, bioquímica e pelo RT-PCR demonstraram culturas primárias altamente purificadas de astrócito e microglia da medula espinal dos camundongos. CONCLUSÃO: É possível obter culturas purificadas de astrócitos e microglia da medula espinal do camundongo a ser empregadas em análises celulares e moleculares da influência destas células não neuronais na fisiopatologia da ELA.

O alcalóide monocrotalina, extraído de "Crotalaria retusa", atua diretamente em culturas primárias de astrócitos alterando a expressão GFAP, a morfologia e o crescimento celular

Casos de intoxicações com plantas do gênero Crotalaria (Leguminosae) em humanos, e principalmente em animais, tem sido amplamente descritos, com o comprometimento do SNC em animais mais sensíveis, como equídeos. Esse estudo objetivou investigar os efeitos diretos do alcalóide pirrolizidínico Monocrotalina (MCT), principal toxina da C. retusa, em culturas primárias de astrócitos corticais de ratos. Foram testadas concentrações entre 0,1-500µM da MCT no período de 24 e 72h. O teste do MTT revelou que a MCT não mostrou toxicidade em astrócitos. A coloração de Rosenfeld permitiu evidenciar que os astrócitos tratados com 10-500µM MCT por 72h, apresentaram o corpo celular contraído e desenvolveram finos prolongamentos de tamanho variável; este efeito foi dose-dependente, e verificado em até cerca de 80% das células tratadas com 500µM MCT. Modificações na expressão da GFAP foram verificadas por marcação imunocitoquímica e western blot, especialmente após 72h de tratamento: a MCT induziu, de forma dose dependente, modificação na distribuição da GFAP, que ficou mais localiza na região peri-nuclear, e uma redução de cerca de 40% nos níveis de expressão dessa proteína foi verificada em todas as concentrações testadas. A coloração da cromatina nuclear com Hoechst-33258 revelou que a presença de astrócitos com núcleos picnóticos ou múltiplos nas culturas tratadas com 1-500µM MCT. Estes resu

Immunohistochemical detection of GFAP and TGF ?1 in C57Bl6 mice during acute vesicular stomatitis virus encephalitis

Activation of astrocytes or astrogliosis is a prominent component of the inflammatory response and an indicator of injury in the brain. These astrocytes produce a large array of inflammatory mediators, growth and neuroprotective factors. This study was an investigation from astrocyte (GFAP) response and TGF- ?1 involvement during VSV acute encephalitis using immunohistochemistry to verify relation between astrocytes and TGF-?1. Animals developed symptoms around 6th day after VSV inoculation. Viral proteins were mainly detected at olfactory bulb, ventricular cell layer and disseminated to hippocampus, mesencephalon and diecephalon areas and brain stem. Also at 6th day post inoculation GFAP and TGF-?1 staining was observed in good association with virus-detected areas of brain. However, in mice with severe symptoms we observed reduction in the intensity of GFAP labeling at the same areas where TGF-?1 upregulation was observed. These areas show correlation with areas of necrosis and where are astrocytes with degenerative aspect. We observed TGF-?1 staining in damaged astrocytes, suggesting an effort of those cells in controlling inflammation in acute phase of VSV encephalitis.