A L-arginina na produção in vitro de embriões bovinos: perspectivas para o futuro / L-arginine in the in vitro production of bovine embryos: perspectives for the future

A L-arginina (L-arg) é o principal precursor da síntese do NO, contudo, é precursora também da síntese de creatina, agmatina, ureia, síntese proteica, L-ornitina, poliaminas, L-prolina e L-glutamato. Nesta breve revisão, vamos falar de alguns resultados que estão sendo obtidos sobre o papel da L-arg na capacitação de espermatozoides bovinos e seu impacto na produção in vitro de embriões. Estudos in vitro mostraram que a adição de L-arg ao meio de capacitação espermática está associada a um aumento na produção de NO, que se correlaciona com aumento da motilidade e vigor, integridade da membrana plasmática e acrossomal, atividade mitocondrial, capacitação espermática, peroxidação lipídica, bem como com a produção de blastocistos. Além disso, a adição da L-arg ao meio de capacitação in vitro, altera o perfil de proteínas importantes ligadas ao processo de capacitação, fertilização e desenvolvimento embrionário inicial. Estes efeitos da L-arg são GMPc dependentes e independentes. Na maturação in vitro, entretanto, embora já tenham sido encontrados bons resultados com o uso do L-arg, mais estudos são necessários para determinar a concentração ideal a ser adicionada ao meio de maturação in vitro e seu impacto na produção de blastocistos. Visto que a pré-capacitação de espermatozoides induzida pela heparina em presença de L-arg foi o método mais eficiente na produção in vitro de embriões, sugerimos sua utilização. Mais pesquisas sobre o metabolismo da L-arg no espermatozoide e CCOs de bovinos durante eventos ligados à fertilização são necessários para se identificar novas vias que atuem nestas etapas in vitro visando o aumento da percentagem e qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro.

L-arginine (L-arg) is the main source of NO synthesis; however, it is also a precursor of the synthesis of creatine, agmatine, urea, protein synthesis, L-ornithine, polyamines, L-proline, and Lglutamate. In this brief review, we will discuss some results obtained previously about the role of L-arg in the capacitation of bovine sperm and its impact on in vitro embryo production. In vitro studies have shown that the addition of L-arg to the sperm capacitation medium is associated with an increase in NO production, which in controlled levels is related to an increased motility and vigor, plasma and acrosomal membrane integrity, mitochondrial activity, sperm capacitation, peroxidation lipids, as well as with the blastocyst production. Furthermore, the addition of L-arg to the in vitro capacitation medium alters the profile of important proteins linked to the capacitation process, fertilization, and early embryonic development. These effects of L-arg are cGMP dependent and independent. In in vitro maturation, however, although good results have already been found with the use of L-arg, further studies are needed to determine the ideal concentration to be added to the in vitro maturation medium and its impact on the production of blastocysts. Since heparin-induced pre-capacitation of spermatozoa in the presence of L-arg was the most efficient method for in vitro embryo production, we suggest its use. More research on L-arg metabolism in bovine sperm and OCCs during events related to fertilization is needed to identify new pathways that act in these in vitro steps aiming to increase the percentage and quality of bovine embryos produced in vitro.

The role of Kisspeptin in bovine in vitro embryo production / Efeito da Kisspeptina na produção in vitro de embriões bovinos

The aim of this study was to investigate the effect of Kisspeptin (Kp) on the medium used in different stages of in vitro production of bovine embryo (IVEP), evaluating cleavage (CR) and blastocyst (BR) rates. The study was divided into three experiments that analyzed, respectively, the action of Kp on in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF), and in vitro culture (IVC) of bovine embryos. In experiment 1, the oocytes were matured in IVM medium and distributed into the following treatments: maturation (IVM Control, n = 102), maturation with addition of 10-7 M Kp (Kp 10-7 IVM, n = 90), and hormone-free maturation luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH) with the addition of 10-7M Kp (No hormones + Kp 10-7, n = 84), following maturation to normal stages of IVEP. In experiment 2, the oocytes were fertilized in IVF medium, in the following treatments: TALP-FERT without Kp (Control IVF, n = 103) and TALP-FERT with the addition of 10-7M Kp (Kp 10-7 IVF, n = 119), usually following the other steps. Finally, in the third experiment, the oocytes passed through all phases and were divided into IVC in two treatments: SOF medium without Kp (Control IVC, n = 109) and SOF medium with the addition of 10-7M Kp (Kp 10-7, N = 106). The data were analyzed by PROC GLIMMIX of the SAS program. In experiment 1, the means of CR and BR were similar (P > 0.05) between treatments (IVM Control76.47% and 37.25%, Kp 10-7 MIV80% and 33.33%, and No hormones + Kp 10-770.24% and 30.95%, respectively). In experiment 2, the means of CR were similar for the IVF Control and Kp 10-7 IVF groups (P > 0.05), 76.70% and 86.55% respectively. But, the mean of the BR of the group Kp 10-7 IVF was 38.66%, which was higher (P 0.05) were similar between the IVC Control and Kp 10-7 IVC groups (CR 83.50% and 78.30%, and BR 26.60% and 23.60%, respectively)...

Objetivou-se com esse estudoinvestigar o efeito da Kisspeptina (Kp) nos meios base utilizados nas etapas da Produção in vitro de Embriões (PIVE) bovinos, avaliando as taxas de clivagem (TC) e blastocistos (TB). O estudo foi dividido em três experimentos, sendo respectivamente analisado em cada um a ação da Kp na maturação in vitro (MIV), fertilização in vitro (FIV) e cultivo in vitro (CIV) de embriões bovinos. No experimento 1 os oócitos foram maturados em meio base MIV, distribuídos nos seguintes tratamentos: maturação (Controle MIV, n=102), maturação com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 MIV, n=90) e maturação sem hormônios LH e FSH com adição de 10-7M de Kp-10 (Sem hormônios + Kp 10-7, n=84), seguindo após a maturação para as etapas normais da PIVE. No experimento 2 os oócitos foram fecundados em meio base da FIV, nos seguintes tratamentos:TALP-FERT sem Kp (Controle FIV, n = 103) e TALP-FERT com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 FIV, n = 119), seguindo normalmente pelas outras etapas. Finalmente, no terceiro experimento os oócitos passaram por todas as fases e foram divididos no CIV em 2 tratamentos: meio SOF sem Kp (Controle CIV, n = 109) e meio SOF com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 3, n = 106). Os dados foram analisados pelo PROC GLIMMIX do programa SAS. No experimento 1 as médias das TC e TB foram semelhantes (P > 0,05) entre os tratamentos Controle MIV 76,47% e 37,25%, Kp 10-7 MIV 80% e 33,33% e Sem hormônios + Kp 10- 7 70,24% e 30,95%, respectivamente. No experimento 2 as médias das TC foram semelhantes para os grupos Controle FIV e Kp 10-7 FIV (P > 0,05), sendo 76,70% e 86,55%, respectivamente. Porém, a média da TB do grupo Kp 10-7 FIV 38,66%, foi superior (P 0,05) também foram similares entre os tratamentos Controle CIV e Kp 10-7 CIV...

The role of Kisspeptin in bovine in vitro embryo production / Efeito da Kisspeptina na produção in vitro de embriões bovinos

The aim of this study was to investigate the effect of Kisspeptin (Kp) on the medium used in different stages of in vitro production of bovine embryo (IVEP), evaluating cleavage (CR) and blastocyst (BR) rates. The study was divided into three experiments that analyzed, respectively, the action of Kp on in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF), and in vitro culture (IVC) of bovine embryos. In experiment 1, the oocytes were matured in IVM medium and distributed into the following treatments: maturation (IVM Control, n = 102), maturation with addition of 10-7 M Kp (Kp 10-7 IVM, n = 90), and hormone-free maturation luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH) with the addition of 10-7M Kp (No hormones + Kp 10-7, n = 84), following maturation to normal stages of IVEP. In experiment 2, the oocytes were fertilized in IVF medium, in the following treatments: TALP-FERT without Kp (Control IVF, n = 103) and TALP-FERT with the addition of 10-7M Kp (Kp 10-7 IVF, n = 119), usually following the other steps. Finally, in the third experiment, the oocytes passed through all phases and were divided into IVC in two treatments: SOF medium without Kp (Control IVC, n = 109) and SOF medium with the addition of 10-7M Kp (Kp 10-7, N = 106). The data were analyzed by PROC GLIMMIX of the SAS program. In experiment 1, the means of CR and BR were similar (P > 0.05) between treatments (IVM Control76.47% and 37.25%, Kp 10-7 MIV80% and 33.33%, and No hormones + Kp 10-770.24% and 30.95%, respectively). In experiment 2, the means of CR were similar for the IVF Control and Kp 10-7 IVF groups (P > 0.05), 76.70% and 86.55% respectively. But, the mean of the BR of the group Kp 10-7 IVF was 38.66%, which was higher (P < 0.05) than that of the FIV Control group, which was 31.07%. In the third experiment, the means of CR and BR (P > 0.05) were similar between the IVC Control and Kp 10-7 IVC groups (CR 83.50% and 78.30%, and BR 26.60% and 23.60%, respectively)...(AU)

Objetivou-se com esse estudoinvestigar o efeito da Kisspeptina (Kp) nos meios base utilizados nas etapas da Produção in vitro de Embriões (PIVE) bovinos, avaliando as taxas de clivagem (TC) e blastocistos (TB). O estudo foi dividido em três experimentos, sendo respectivamente analisado em cada um a ação da Kp na maturação in vitro (MIV), fertilização in vitro (FIV) e cultivo in vitro (CIV) de embriões bovinos. No experimento 1 os oócitos foram maturados em meio base MIV, distribuídos nos seguintes tratamentos: maturação (Controle MIV, n=102), maturação com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 MIV, n=90) e maturação sem hormônios LH e FSH com adição de 10-7M de Kp-10 (Sem hormônios + Kp 10-7, n=84), seguindo após a maturação para as etapas normais da PIVE. No experimento 2 os oócitos foram fecundados em meio base da FIV, nos seguintes tratamentos:TALP-FERT sem Kp (Controle FIV, n = 103) e TALP-FERT com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 FIV, n = 119), seguindo normalmente pelas outras etapas. Finalmente, no terceiro experimento os oócitos passaram por todas as fases e foram divididos no CIV em 2 tratamentos: meio SOF sem Kp (Controle CIV, n = 109) e meio SOF com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 3, n = 106). Os dados foram analisados pelo PROC GLIMMIX do programa SAS. No experimento 1 as médias das TC e TB foram semelhantes (P > 0,05) entre os tratamentos Controle MIV 76,47% e 37,25%, Kp 10-7 MIV 80% e 33,33% e Sem hormônios + Kp 10- 7 70,24% e 30,95%, respectivamente. No experimento 2 as médias das TC foram semelhantes para os grupos Controle FIV e Kp 10-7 FIV (P > 0,05), sendo 76,70% e 86,55%, respectivamente. Porém, a média da TB do grupo Kp 10-7 FIV 38,66%, foi superior (P < 0,05) ao grupo controle FIV 31,07%. No terceiro experimento as médias das TC e TB (P > 0,05) também foram similares entre os tratamentos Controle CIV e Kp 10-7 CIV...(AU)

QUALIDADE E COMPETÊNCIA OOCITÁRIA EM DUAS RAÇAS ZEBUÍNAS SUBMETIDAS À ASPIRAÇÃO FOLICULAR (OPU) EM DIFERENTES DIAS DO CICLO ESTRAL

de FREITAS, Rosano Ramos. Universidade Federal do Acre, dezembro de 2021. Qualidade e competência oocitária e embrionária em duas raças zebuínas submetidas à aspiração folicular (OPU) em diferentes dias do ciclo estral. Orientador: Rafael Augusto Satrapa. A inseminação artificial (IA) e a transferência de embriões (produzidos in vivo ou in vitro) têm contribuído de forma significativa para o melhoramento genético de nosso rebanho bovino. O momento da aspiração folicular guiada por ultrassonografia pode influenciar na quantidade e qualidade oocitária e, consequentemente, embrionária. Considerando a alta variabilidade dos resultados inerentes à produção in vitro de embriões (PIVE), objetivou-se com o presente trabalho comparar a qualidade morfológica, relacionada à competência e qualidade oocitária e embrionária de oócitos e embriões PIVE oriundos de folículos aspirados por ultrassonografia (ovum pick up OPU) antes do estabelecimento da dominância folicular. O experimento foi realizado entre os anos de 2018 e 2020, com vacas Gir (n=12) e Nelore (n=12) que foram submetidas à sincronização da ovulação por meio do protocolo progesterona-estrógeno-prostaglandina-estrógeno (PEPE). As OPUs foram realizadas no D2, dois dias após a ovulação, no início da primeira onda de crescimento folicular; D5, cinco dias após a ovulação, durante a dominância folicular; D8, oito dias após a ovulação, no início da segunda onda folicular; formando assim três grupos experimentais (4 vacas/grupo), onde todas as fêmeas passaram pelos três momentos (cross-over). Após a OPU, seguiu-se a seleção dos oócitos e as etapas da PIVE. Ao final do cultivo embrionário, os blastocistos foram transferidos para receptoras previamente sincronizadas. Não houve efeito do momento de aspiração (D2, D5 e D8) no número de oócitos recuperados de vacas Gir classificados em GI (33, 30, 21, respectivamente), GII (35, 31 e 30, respectivamente), GIII (56, 53 e 41, respectivamente) e GIV (18, 15 e 10, respectivamente). O mesmo foi observado na raça Nelore, GI (45, 35, 33, respectivamente), GII (50, 32 e 36, respectivamente), GIII (46, 34 e 27, respectivamente) e GIV (7, 6 e 7, respectivamente). Não se observou diferença significativa na taxa de produção de blastocisto na raça Gir (41,22%, 54/131; 29,77%, 39/131 e 29,01%, 38/131, respectivamente; p-valor= 0,98), nem na raça Nelore (40,49%, 66/163; 29,45%, 48/163 e 30,06%, 49/163, respectivamente; p-valor= 0,98). Também não houve diferença significativa na taxa de gestação tanto na raça Gir (44,83%, 26/58; 29,31%, 17/58 e 25,86%, 15/58, respectivamente) quanto na Nelore (39,76%, 33/83; 28,92%, 24/83 e 31,33%, 26/83, respectivamente). Além disso, não houve diferença significativa na taxa de gestação entre as raças Gir e Nelore (44,27%, 58/131 e 50,92%, 83/163, respectivamente; p-valor= 0,75). Concluiu-se que não houve diferença na quantidade e qualidade de oócitos aspirados em diferentes dias do ciclo estral (D2, D5 e D8), bem como também não foi observada diferença nas taxas de produção de embriões e prenhez de vacas doadoras da raça Gir e Nelore.

de FREITAS, Rosano Ramos. Federal University of Acre, December 2021. Oocyte and embryonic quality and competence in two Zebu breeds submitted to follicular aspiration (OPU) on different days of the estrous cycle. Advisor: Rafael Augusto Satrapa. Artificial insemination (AI) and embryo transfer (obtained in vivo or in vitro) have significantly contributed to the genetic improvement of our bovine herd. The timing of ultrasound-guided follicular aspiration can influence oocyte quantity and quality and, consequently, embryonic quality. Considering the high variability of the results inherent to in vitro embryo production (IVP), the aim of this study is to compare the morphological quality, related to oocyte and embryo competence and quality of oocytes and IVP embryos from follicles aspirated by ultrasonography (ovum pick up - OPU) before the establishment of follicular dominance. The experiment was carried out between 2018 and 2020, with Gyr (n=12) and Nellore (n=12) cows that underwent ovulation synchronization using the progesterone-estrogen-prostaglandin-estrogen (PEPE) protocol. OPUs were performed on D2, two days after ovulation, at the beginning of the first wave of follicular growth; D5, five days after ovulation, during follicular dominance; D8, eight days after ovulation, at the beginning of the second follicular wave; thus, forming three experimental groups (4 cows/group), where all females passed through the three moments (cross-over). After OPU, the selection of oocytes and the steps of IVP followed. At the end of embryo culture, the blastocysts were transferred to previously synchronized recipients. There was no effect of the moment of aspiration (D2, D5 and D8) on the number of oocytes recovered from Gyr cows classified as GI (33, 30 and 21, respectively), GII (35, 31 and 30, respectively), GIII (56, 53 and 41, respectively) and GIV (18, 15 and 10, respectively). The same was observed in the Nellore breed, GI (45, 35 and 33, respectively), GII (50, 32 and 36, respectively), GIII (46, 34 and 27, respectively) and GIV (7, 6 and 7, respectively). There was no significant difference in the rate of blastocyst production in the Gir breed (41.22%, 54/131; 29.77%, 39/131 and 29.01%, 38/131, respectively; p-value= 0.98), nor in the Nelore breed (40.49%, 66/163; 29.45%, 48/163 and 30.06%, 49/163, respectively; p-value= 0.98). There was also no significant difference in the pregnancy rate both in the Gir breed (44.83%, 26/58; 29.31%, 17/58 and 25.86%, 15/58, respectively) and in the Nellore (39.76%, 33/83; 28.92%, 24/83 and 31.33%, 26/83, respectively). Furthermore, there was no significant difference in the pregnancy rate between the Gir and Nelore breeds (44.27%, 58/131 and 50.92%, 83/163, respectively; p-value= 0.75). We concluded that there was no difference in the quantity and quality of oocytes aspirated on different days of the estrous cycle (D2, D5 and D8), as well as no difference was observed in the rates of embryo production and pregnancy of Gyr and Nellore donor cows.

Studies on in vitro bovine embryos during their transport / Estudo sobre o cultivo in vitro de embriões bovinos durante o transporte

The Brazilian livestock is based on the use and in the improvement of reproductive biotechnologies. Researches that aims to solve problems such as the distance between laboratories and the large cattle producing farms are necessary. The objective of this study was to evaluate the effectiveness of a culture system during long periods of transportation on bovine embryos produced in vitro. The oocytes obtained from slaughterhouse cows ovaries, passed through in vitro production of embryos procedures such as: maturation, fertilization and embryo culture and subsequently were allocated into the transportation system to compose the treatments: Tcontrol - control embryos kept in the incubator; T48 - embryos removed from the culture medium on the 5th day and transportation simulated for 48 hours; T24 - embryos removed from the culture medium on the 6th day and transportation simulated for 24 hours. After the treatments, the embryos were evaluated for blastocyst on the 7th day and hatching rate on the 9th day. The experimental design was completely randomized. No differences were found (P> 0.05) for blastocyst rate (31, 33 and 35%) and hatching rate (74, 78 and 80%), respectively, for Tcontrol, T48 and T24 treatments. It was concluded that the culture system during transport, up to 48 hours, was efficient when considering the embryonic viability, inferring that the transportation environment simulated atmosphere and temperature conditions of the laboratory in a satisfactory manner

A pecuária brasileira é, em parte, sustentada pela utilização e aperfeiçoamento de biotecnologias da reprodução. Pesquisas que buscam solucionar problemas como a distância existente entre os laboratórios e as grandes fazendas produtoras de gado são necessárias. O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia de um sistema de cultivo durante períodos longos de transporte de embriões bovinos produzidos in vitro. Os oócitos, obtidos de ovários de vacas de abatedouro, passaram pelos procedimentos de produção de embriões in vitro, e no quinto dia do cultivo, foram alocados no sistema de transporte para compor os tratamentos: Tcontrole embriões controle mantidos na incubadora; T48 - embriões retirados do meio de cultivo no 5º dia e simulado o transporte por 48 horas; T24 - embriões retirados do meio de cultivo no 6º dia e simulado o transporte por 24 horas. Após os tratamentos, os embriões foram avaliados quanto à taxa de blastocistos no 7º dia e a taxa eclosão no 9º dia. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com três tratamentos e cinco repetições cada. Não foram observadas diferenças (P> 0,05) na taxa de blastocisto (31, 33 e 35%) e na taxa de eclosão (74, 78 e 80%), respectivamente para os tratamentos Tcontrole, T48 e T24. Concluiu-se que o sistema de cultivo durante o transporte, por até 48 horas, foi eficiente quanto à viabilidade embrionária inferindo que o ambiente de transporte simulou as condições de atmosfera e de temperatura do laboratório de forma satisfatória

Studies on in vitro bovine embryos during their transport / Estudo sobre o cultivo in vitro de embriões bovinos durante o transporte

The Brazilian livestock is based on the use and in the improvement of reproductive biotechnologies. Researches that aims to solve problems such as the distance between laboratories and the large cattle producing farms are necessary. The objective of this study was to evaluate the effectiveness of a culture system during long periods of transportation on bovine embryos produced in vitro. The oocytes obtained from slaughterhouse cows ovaries, passed through in vitro production of embryos procedures such as: maturation, fertilization and embryo culture and subsequently were allocated into the transportation system to compose the treatments: Tcontrol - control embryos kept in the incubator; T48 - embryos removed from the culture medium on the 5th day and transportation simulated for 48 hours; T24 - embryos removed from the culture medium on the 6th day and transportation simulated for 24 hours. After the treatments, the embryos were evaluated for blastocyst on the 7th day and hatching rate on the 9th day. The experimental design was completely randomized. No differences were found (P> 0.05) for blastocyst rate (31, 33 and 35%) and hatching rate (74, 78 and 80%), respectively, for Tcontrol, T48 and T24 treatments. It was concluded that the culture system during transport, up to 48 hours, was efficient when considering the embryonic viability, inferring that the transportation environment simulated atmosphere and temperature conditions of the laboratory in a satisfactory manner(AU)

A pecuária brasileira é, em parte, sustentada pela utilização e aperfeiçoamento de biotecnologias da reprodução. Pesquisas que buscam solucionar problemas como a distância existente entre os laboratórios e as grandes fazendas produtoras de gado são necessárias. O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia de um sistema de cultivo durante períodos longos de transporte de embriões bovinos produzidos in vitro. Os oócitos, obtidos de ovários de vacas de abatedouro, passaram pelos procedimentos de produção de embriões in vitro, e no quinto dia do cultivo, foram alocados no sistema de transporte para compor os tratamentos: Tcontrole embriões controle mantidos na incubadora; T48 - embriões retirados do meio de cultivo no 5º dia e simulado o transporte por 48 horas; T24 - embriões retirados do meio de cultivo no 6º dia e simulado o transporte por 24 horas. Após os tratamentos, os embriões foram avaliados quanto à taxa de blastocistos no 7º dia e a taxa eclosão no 9º dia. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com três tratamentos e cinco repetições cada. Não foram observadas diferenças (P> 0,05) na taxa de blastocisto (31, 33 e 35%) e na taxa de eclosão (74, 78 e 80%), respectivamente para os tratamentos Tcontrole, T48 e T24. Concluiu-se que o sistema de cultivo durante o transporte, por até 48 horas, foi eficiente quanto à viabilidade embrionária inferindo que o ambiente de transporte simulou as condições de atmosfera e de temperatura do laboratório de forma satisfatória(AU)

PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS SUPLEMENTADA COM ANTIOXIDANTES: EFEITOS NO DESENVOLVIMENTO EMBRI-ONÁRIO E NA TAXA DE PRENHEZ

No primeiro experimento foram utilizados oócitos de ovários de abatedouro distribuídos em seis grupos: 1) Maturação e Cultivo in vitro sem adição de antioxidantes (Ct-Ct); 2) Maturação com 2 M de quercetina (Qc-Ct); 3) Cultivo com 2 M de quercetina (Ct-Qc); 4) Maturação e Cultivo com 2 M de quercetina (Qc-Qc); 5) Maturação com 100 M de cisteamina e Cultivo com de 2 M de quercetina (Cis-Qc) e 6) Maturação com cisteamina (Cis-Ct). Com base no primeiro experimento, os oócitos provenientes de Ovum pick up foram avaliados nos grupos Cis-Qc e Cis-Ct. Os resultados do experimento 1 e 2 para os grupos Cis-Qc e Cis-Ct foram confrontados. A análise estatística considerou significância de 5% nas avaliações. O percentual médio de desenvolvimento dos embriões foi similar entre os grupos Qc-Ct, Ct-Qc, Cis-Qc e Cis-Ct (49,55±5.1), porém superiores aos grupos Ct-Ct e Qc-Qc (42,4±6.1). A taxa média de blastocistos eclodidos foi similar entre os grupos Ct-Ct, Qc-Ct, CisQc e Cis-Ct (60,9±6.3), e estes superior grupo Qc-Qc (54,7±9.7). Para o número médio de células dos blastocistos o grupo Cis-Ct (145±25) foi superior os grupos Cis-Qc, Ct-Ct e Qc-Ct (128±25) e estes superiores os grupos Ct-Qc e Qc-Qc (109±32). No experimento 2 a taxa de clivagem não diferiu entre Cis-Ct (88,8±3.9) e Cis-Qc (87,7±4.5). Mas o percentual de blastocistos foi superior para Cis-Qc (64,6±9.8) em relação a Cis-Ct (56,4±3.6). Enquanto a taxa de prenhez do grupo 2 Cis-Ct (45,1±2.5) foi superior ao Cis-Qc (38,5±3.5). O percentual de blastocisto do experimento 2 (56,4±3.6 e 64,6±9.8%) foram superiores aos do experimento 1 (48,9±3.6 e 52,2±5.1%) para os grupos Cis-Ct e Cis-Qc, respectivamente. Em conclusão, a produção in vitro de embriões suplementada com antioxidante dependendo do grupo foi positiva, mas este benefício não foi confirmado na taxa de prenhez com o uso da quercetina no cultivo in vitro

In the first experiment we used oocytes from ovaries of slaughterhouse distributed in six groups: 1) Maturation and cultivation without the addition of antioxidants (Ct-Ct); 2) Maturation with 2 M of quercetin (Qc-Ct); 3) Cultivation with 2 M of quercetin (Ct-Qc); 4) Maturation and cultivation with 2 M of quercetin (Qc-Qc); 5) Maturation with 100 M of cysteamine and cultivation with of 2 M of quercetin (CisQc) and 6) Maturation with cysteamine (Cis-Ct). Based in experiment 1, the oocytes of Ovum pick up (OPU) were evaluated in Cis-and Cis-Qc CT. for experiment 3 were assessed the results of experiment 1 and 2 for groups Cis-and Cis-Ct Qc. Statistical analysis significance of 5% was considered in reviews. The percentage of embryos was superior to Qc-Ct, Ct-Qc, Cis-and Cis-Ct Qc (49,55±5.1), about Ct-Ct and QcQc (42.4±6.1). The hatching rate was similar to Ct-Ct, Qc-Ct, Cis-and Cis-Ct Qc (60,9±6.3), however the Group Qc-Qc (54,7±9.7). Had the lowest rate of hatching, followed by the Ct-Qc (57.3 ± 11.0). The number of cells in the embryos of the Group Cis-Ct (145±25) was superior to the Cis-Qc groups, Ct-Ct and Qc-Ct (media 128 ± 25). The embryos of Ct-Qc groups and Qc-Qc (media 109 ± 32) had the fewest cell. The rate of cleavage in the oocytes OPU did not differ between Cis-Ct (88.8±3.9) and Cis-Qc (87.7 ± 4.5). But the percentae of blastocyst was superior to Cis-Qc (64.6 ± 9.8) for the Cis-Ct (56.4 ± 3.6). However, the rate of pregnancy blastocyst Cis group- 4 Ct (45.1±2.5) were higher than those of Cis-Qc (38.5±3.5). The percentage of blastocyst OPU oocytes (56.4 ± 3.6 and 64.6 ± 9.8%) were higher than those of slaughterhouse (48.9 ± 3.6 and 52.2 ± 5.1%) independent of the groups evaluated (Cis-and Cis-Qc Ct), respectively. In conclusion, the in vitro production of embryos supplemented with antioxidant depending on the Group was positive, but this benefit has not been confirmed pregnant rate with the use of quercetin on in vitro cultivation.

ADIÇÃO DE KISSPEPTINA NO MEIO DE FERTILIZAÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

Objetivou-se avaliar diferentes concentrações de Kisspeptina (Kp) e o seu efeito na fertilização in vitro de embriões bovinos quanto à qualidade e taxas de desenvolvimento embrionário inicial. No Experimento 1 foi determinada a concentração mínima de Kp a ser utilizada no meio FIV, a partir dos tratamentos: controle (n=240); Kp 10-5 M (n=223); Kp 10-6 M (n=225) e Kp 10-7 M (n=245). No Experimento 2, os ovócitos, foram distribuídos em quatro tratamentos: controle (n=362); Kp 10-1 M (n=425), Kp 10-7 M (n=304), e antagonista P234 4x10-6 M (n=424). Os espermatozoides foram capacitados por gradiente descontínuo de Percoll®, e co-incubados com os ovócitos por 16 a 18h em estufa de cultura a 38,5°C com 5% de CO2. Após esse período, os zigotos foram incubados em Fluido Sintético de Oviduto (SOF) durante sete dias nas mesmas condições. A taxa de clivagem foi avaliada 48h após a fertilização e a taxa de blastocistos e estágio de desenvolvimento/qualidade no sétimo dia. Foi adotado um escore numérico de 1 a 4 para avaliação do estágio de desenvolvimento, onde 1 corresponde a blastocisto inicial, 2 blastocisto, 3 blastocisto expandido e 4 blastocisto eclodido. A qualidade foi avaliada por microscopia confocal 3D, e os dados analisados pelo PROC GLIMMIX/SAS e teste de Kruskal-Wallis. No Experimento 1, não houve diferença entre os tratamentos para taxas de clivagem e blastocistos respectivamente: controle (82,0%/34,2%); Kp 10-5 M (81,6%/26,9%); Kp 10-6 M (80,8%/29,3%) e Kp 10-7 M (80,8%/29,4%) (P > 0,05). No Experimento 2, as médias das taxas de clivagem e blastocisto foram semelhantes entre os tratamentos: controle (85,1%/38,1%), Kp 10-1 M (82,6%/33,6%), Kp 10-7 M (83,6%/34,9%) e P234 (81,4%/31,6%) (P > 0,05). Foram produzidos 514 embriões, com as seguintes médias de escore de desenvolvimento: controle 2,89; Kp 10-1 M 3,04; Kp 10- 7 M 2,79 e P234 2,63, sem diferença estatística entre os mesmos (P > 0,05). Quanto à qualidade, foram avaliados 360 embriões, n=30/tratamento/corante. Os parâmetros observados foram produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), necrose, apoptose e potencial mitocondrial. Cada embrião forneceu de 3 a 8 imagens (n=1.492) com intensidade de fluorescência em pixels. O grupo controle apresentou maior porcentagem de ROS: controle 3,76%; Kp 10-1 M 0,25%; Kp 10-7 M 2,95% e P234 0,91% (P < 0,05). A porcentagem de degeneração celular foi semelhante entre os tratamentos: controle 1,51%; Kp 10-1 M 1,73%; Kp 10-7 M 4,71% e P234 1,98% (P > 0,05). A média de apoptose, foi semelhante entre os tratamentos: controle 2,79%; Kp 10-7 M 1,67% e P234 6,11% (P > 0,05). O potencial mitocondrial teve maior porcentagem no grupo P234: controle 0,51%; Kp 10-1 M 0,26%; Kp 10-7 M 0,22% e P234 1,43% (P < 0,05). A adição de kp-10 no meio de fertilização não interferiu nas taxas de clivagem e blastocisto, bem como no estágio de desenvolvimento embrionário. A Kp não teve efeito na apoptose, necrose, nem tampouco no potencial mitocondrial. Por outro lado, a Kp diminuiu os níveis intracelulares de ROS, sugerindo o seu envolvimento no controle antioxidante.

The aim was to evaluate the different concentrations of Kisspeptin (Kp) and its effect in the process of in vitro fertilization of bovine embryos about the quality and production rates. In Experiment 1 the minimum concentration of Kp was determined to be used at medium FIV, starting from the treatments: control (n=240); Kp 10-5 M (n=223); Kp 10-6 M (n=225) and Kp 10-7 M (n=245). In Experiment 2, the oocytes were distributed in four treatments: control (n=362); Kp 10-1 M (n=425), Kp 10-7 M (n=304), and antagonist P234 4x10-6 M (n=424). The sperms were enabled by Percoll® discontinuous gradient, and coincubated with the oocytes from 16 to 18 hours in stove culture at 38.5°C with 5% of CO2. After this period, the zygotes were incubated in Synthetic Oviduct Fluid (SOF) during 7 days in the same conditions. The rate of cleavage was evaluated 48 hours after fertilization and the rate of blastocysts and development stage/quality on the seventh day. A numerical score was adopted from 1 to 4 for evaluation of the development stage, as 1 corresponds to initial blastocyst, 2 blastocyst, 3 expanded blastocyst and 4 hatched blastocyst. The quality was evaluated by 3D confocal microscopy, and the analyzed data by PROC GLIMMIX/SAS and Kruskal-Wallis test. In Experiment 1, there wasnt difference between the treatments rates of cleavage and blastocysts respectively: control (82,0%/34,2%); Kp 10-5 M (81,6%/26,9%); Kp 10-6 M (80,8%/29,3%) and Kp 10-7 M (80,8%/29,4%) (P > 0,05). In Experiment 2, the averages from the rates of cleavage and blastocysts were similar between the treatments: control (85,1%/38,1%), Kp 10-1 M (82,6%/33,6%), Kp 10-7 M (83,6%/34,9%) and P234 (81,4%/31,6%) (P > 0,05). A total of 514 embryos were produced, with the following averages of development score: control 2,89; Kp 10-1 M 3,04; Kp 10-7 M 2,79 and P234 2,63, without statistical difference among them (P > 0,05). About the quality, 360 embryos were evaluated, n=30/treatment/coloring. The parameters observed were production of reactive oxygen species (ROS), necrosis, apoptosis and mitochondrial potential. Each embryo supplied from 3 to 8 images (n=1.492) with fluorescence intensity in pixels. The control group presented bigger percentage of ROS: control 3,76%; Kp 10-1 M 0,25%; Kp 10-7 M 2,95% and P234 0,91% (P < 0,05). The percentage of cellular degeneration was similar between the treatments: control 1,51%; Kp 10-1 M 1,73%; Kp 10-7 M 4,71% and P234 1,98% (P > 0,05). The average of apoptosis was similar between the treatments: control 2,79%; Kp 10-7 M 1,67% and P234 6,11% (P > 0,05). The mitochondrial potential had bigger percentage in the group P234: control 0,51%; Kp 10-1 M 0,26%; Kp 10-7 M 0,22% and P234 1,43% (P < 0,05). The addition of kp-10 amid fertilization didnt interfere in the rates of cleavage and blastocyst, as well as in the embryonic development stage. The Kp didnt have effect in the apoptosis, necrosis, nor even in the mitochondrial potential. On the other hand, the Kp decreased the intracellular levels of ROS, suggesting its involvement in the antioxidant control.

INFLUÊNCIA DA KISSPEPTINA NA ETAPA DE SELEÇÃO ESPERMÁTICA PARA A PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

O objetivo do presente estudo foi avaliar a adição da Kisspeptina (Kp) no processo in vitro de seleção espermática, quanto à viabilidade dos espermatozoides bovinos e taxas de produção embrionária. Para isso foram utilizados 980 ovócitos provenientes de ovários de abatedouro-frigorífico e 75 palhetas de sêmen comercial bovino. Os tratamentos foram realizados nos espermatozoides durante a etapa de seleção espermática in vitro pelo método de centrifugação com gradientes descontínuos de Percoll® 90% e 45% de acordo com os seguintes tratamentos: Controle (n = 182), Kp 10-5 M (n = 198), Kp 10-6 M (n = 200), Kp 10-7 M (n = 206) e antagonista P-234 50 µM (n = 194), com as diluições realizadas nos dois gradientes respeitando-se as devidas concentrações. Os espermatozoides foram analisados no momento pré e pós seleção espermática para motilidade e vigor, e submetidos à coloração pelas sondas JC-1, IP e FITC-PSA, para avaliar o potencial mitocondrial, integridade de membrana plasmática e integridade do acrossoma em microscópio de varredura a laser confocal LSM 510 meta. Posterior aos tratamentos, os espermatozoides foram utilizados normalmente nos procedimentos de PIVE. No D2 e D7 foram realizadas análises de produção, baseadas nas taxas de clivagem e blastocistos, respectivamente. Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade pelo guided analisys do SAS, posteriormente utilizado o proc GLIMMIX para avaliação do modelo experimental e posteriormente ao teste de Tukey-Kramer para comparação de médias. Diferenças foram consideradas quando P < 0,05. Os resultados de motilidade e vigor e taxas de produção embrionária foram semelhantes (P > 0,05) entre todos os tratamentos propostos. A taxa de clivagem (n=846) foi maior que 82% e a porcentagem de produção de blastocistos (n=331) foi maior que 29%. Quanto ao potencial mitocondrial, os grupos Kp 10-6 e Kp 10-7 (92,6%) foram superiores (P < 0,05) aos grupos Controle (89,8%) e P-234 (83,8%), sendo este último inferior (P < 0,05) a todos os outros tratamentos. Na avaliação da integridade de membrana plasmática e integridade do acrossoma (IMP/IA), os tratamentos com adição de Kp foram semelhantes (P > 0,05) entre si Kp 10-5 (88,9%/90,9%), Kp 10-6 (90,7%/91,8%) e Kp 10-7 (90,2%/91,4%) e ao antagonista P-234 (90,5%/90,8%), respectivamente. Apenas o tratamento Kp 10-6 apresentou resultado superior (P < 0,05) ao grupo Controle (87,9%/89,1%). Ao correlacionar as variáveis analisadas pela microscopia confocal, foi observada uma correlação significativa e positiva entre alto potencial mitocondrial e integridade de membrana plasmática (r = 0,80; P < 0,0001), integridade de acrossoma e alto potencial mitocondrial (r = 0,80; P < 0,0001), integridade de membrana plasmática e integridade de acrossoma (r = 0,84; P < 0,0001). Finalmente, pode-se concluir que a concentração equilibrada da Kp proporcionou maior viabilidade aos espermatozoides bovinos referente ao potencial mitocondrial, integridade acrossômica e de membrana plasmática. Já o antagonista P-234 apresentou efeito prejudicial referente ao potencial mitocondrial.

The aim of the present study was to evaluate the addition of Kisspeptin (Kp) in the in vitro process of spermatic selection, regarding the viability of bovine spermatozoa and embryo production rates. For this, 980 oocytes were obtained from slaughterhouse ovaries and 75 commercial bovine semen straws were used. The treatments were performed on the spermatozoa during the in vitro spermatic selection stage by the centrifugation method with 90% and 45% Percoll® discontinuous gradients according to each proposed treatment: Control (n = 182), Kp 10-5 M (n = 198 ), Kp 10-6 M (n = 200), Kp 10-7 M (n = 206) and 50 M P-234 antagonist (n = 194), with the dilutions carried out on both gradients respected concentrations. The spermatozoa were analyzed before and after spermatic selection for motility and vigor, and were submitted to staining with fluorescent probes JC-1, IP and FITC-PSA, to evaluate the mitochondrial potential, plasma membrane integrity and acrosome integrity under confocal laser scanning microscope LSM 510 meta. After the treatments, spermatozoa were normally used in IVEP procedures. The production analyzes were performed on D2 and D7, based respectively on cleavage and blastocysts rates. The data were submitted to the normality and homogeneity test by guided analysis SAS, after were used the proc GLIMMIX procedure to evaluate the experimental model and later the Tukey-Kramer test for comparison of means. Differences are considered when P < 0.05. The results of motility, vigor and production rates were similar (P> 0.05) among all proposed treatments. The cleavage rate (n = 846) was higher than 82% and the percentage of blastocyst production (n = 331) higher than 29% in all treatments. The mitochondrial potential of Kp 10-6 and Kp 10-7 (92.6%) groups was higher (P <0.05) to the Control (89.8%) and P-234 (83.8%) groups, the latter being lower (P <0.05) than all other treatments. Plasma membrane integrity and acrosome integrity (PMI/AI) evaluations showed that treatments with Kp addition were similar, (P> 0.05) Kp 10-5 (88.9%/90.9%), Kp 10-6 (90.7%/91.8%) and Kp 10-7 (90.2%/91.4%) and the P-234 antagonist (90.5%/90.8%), respectively. The Kp 10-6 treatment presented a superior result (P <0.05) to the Control group (87.9%/89.1%). When correlating the variables analyzed by confocal microscopy, a significant and positive correlation was observed between high mitochondrial potential and plasma membrane integrity (r = 0.80; P <0.0001), acrosome integrity and high mitochondrial potential (r = 0 , 80, P <0.0001), plasma membrane integrity and acrosome integrity (r = 0.84, P <0.0001). Finally, it can be concluded that the balanced concentration of Kp provided greater viability to bovine spermatozoa related to mitochondrial potential, acrosome integrity and plasma membrane. The P-234 antagonist presented a detrimental effect on the mitochondrial potential.

Modificações pós traducionais de histonas de embriões bovinos produzidos in vitro em diferentes fases do desenvolvimento Inicial

Modificações pós-traducionais de histonas participam da regulação da expressão gênica durante a embriogênese. A H3K4me3 está envolvida com a permissão da transcrição gênica, enquanto a metilação global da H3K9 está envolvida com a repressão gênica. O objetivo do presente estudo foi caracterizar as modificações H3K4me3 e metilação global da H3K9 durante o desenvolvimento in vitro de embriões bovinos. Os embriões foram produzidos in vitro e acondicionados em diferentes estágios de desenvolvimento para a investigação das referidas modificações de histonas pela análise de Imunofluorescência sob microscopia confocal. Em todas as fases de desenvolvimento investigadas, tanto a H3K4me3 quanto a metilação global da H3K9 estavam presentes. Antes do estágio de blastocisto inicial (Bi) foi observada maior quantidade da metilação global de H3K9 do que de H3K4me3, situação invertida após o referido estágio. No estágio de Bi não foi observada diferença estatística entre as marcas epigenéticas estudadas, sugerindo um estado de preparação dos embriões para um período de grandes modificações e diferenciação celular. Essas marcas podem estar relacionadas com a regulação de pluripotência das células nesse período. A fase de blastocisto em eclosão foi a que apresentou maior atividade de H3K4me3, sugerindo que a eclosão do blastocisto demanda alta atividade gênica. Conclui-se que a H3K4me3 e a metilação global de H3K9 são muito importantes para o desenvolvimento de embriões bovinos pré-implantação. A H3K4 tem comportamento mais dinâmico, apresentando picos importantes nas fases de blastocisto e blastocisto em eclosão.

Post-translational histone modifications participate in the regulation of gene expression during embryogenesis. H3K4me3 is involved with the permission of gene transcription, while the global methylation of H3K9 is involved in gene repression. The aim of the present study was to characterize the H3K4me3 modifications and global methylation of H3K9 during the in vitro development of bovine embryos. The embryos were produced in vitro and conditioned at different stages of development for the investigation of said histone modifications by Immunofluorescence analysis under confocal microscopy. In all stages of development investigated, both H3K4me3 and the global methylation of H3K9 were present. Before the initial blastocyst stage (Bi) a greater amount of the global methylation of H3K9 was observed than of H3K4me3, situation reversed after that stage. In the Bi stage there was no statistical difference between the epigenetic marks studied, suggesting a state of preparation of the embryos for a period of great modifications and cellular differentiation. These tags may be related to the regulation of pluripotency of cells in this period. The hatching blastocyst stage was the one with the highest H3K4me3 activity, suggesting that the blastocyst hatching demands high gene activity. It is concluded that H3K4me3 and the global methylation of H3K9 are very important for the development of pre-implantation bovine embryos. H3K4 has more dynamic behavior, presenting important peaks in the phases of blastocyst and blastocyst in hatching.

EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO COM ÁCIDO TAUROURSODEOXICÓLICO (TUDCA) E/OU COLINA NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES SUÍNOS

Com o intuito de otimizar a técnica da produção in vitro de embriões, diversas substâncias têm sido consideradas como potenciais aditivos aos meios de cultivo. Objetivou-se na presente pesquisa avaliar o efeito da adição de colina e do ácido Tauroursodeoxicólico (TUDCA) durante a maturação de oócitos e o cultivo de embriões produzidos in vitro. No primeiro estudo, oócitos foram puncionados a partir de ovários suínos coletados em abatedouro local. Alocou-se os oócitos selecionados em meio de maturação in vitro (MV) padrão e posteriormente, realizou-se a ativação partenogenética e 1030 prováveis zigotos foram submetidos ao cultivo in vitro (CIV) em meio padrão ou com 2,5mM, 5mM, 7,5mM e 10mM de colina durante 7 dias. No segundo estudo, realizou-se MIV padrão e CIV de 872 prováveis zigotos por 0, D0-D3, D0-D5, D0-D7, D3-D7 e D5-D7 dias com suplementação de colina a 3,73mM. No terceiro estudo, selecionou-se 1141 oócitos que foram alocados em meio de maturação in vitro (MV) padrão ou suplementado com colina a 3,73mM, TUDCA a 50M ou ambos. No quarto estudo, realizou-se MIV padrão e CIV de 1645 prováveis zigotos em meio padrão, ou suplementado com colina a 3,73mM, TUDCA a 50M ou ambos. No quinto estudo, realizou-se MIV padrão e CIV de 1756 prováveis zigotos em meio padrão, ou suplementado com glicose a 7mM, glicose + TUDCA a 50M, glicose + colina a 3,73mM e glicose + TUDCA + colina. No terceiro estudo avaliou-se a taxa de maturação e, em todos os estudos, as taxas de clivagem, blastocistos e eclosão. Nos estudos que avaliaram condições de cultivo, realizou-se imunofluorescência em blastocistos para avaliação do número total de células e proporção de células positivas para CC3 e Sox2. Realizou-se as análises estatísticas por ANOVA e a comparação de médias pelo teste Tukey-Kramer, adotando de 0,05. Os resultados da presente pesquisa mostraram pela primeira vez, que a suplementação do meio de MIV e CIV com colina influencia negativamente o desenvolvimento e a qualidade de embriões pré-implantação, que a suplementação de 10mM de colina por 7 dias ou 3,73mM pelos primeiros 5 dias de cultivo proporcionam maiores danos à qualidade embrionária, prejudicando também o desenvolvimento de embriões induzidos ao estresse por glicose quando suplementada sozinha ou na presença de TUDCA. Ainda, apesar de parecer melhorar o desenvolvimento embrionário, TUDCA não foi capaz de minimizar o impacto da colina.

Aiming to improve the in vitro embryo production technique, many substances have been considered as potential in vitro media additives. Thus, the objective of the present research was to assess the effect of choline and Tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) addition to in vitro maturation (IVM) and in vitro culture (IVC) media of in vitro produced embryos. In the first study, oocytes were punctured from porcine ovaries collected from a local slaughterhouse. Selected oocytes were placed in standard IVM medium, were parthenogenetically activated and 1030 presumable zygotes were subjected to standard IVC or supplemented with 2.5mM, 5mM, 7.5mM or 10mM choline. In the second study, IVM was carried out in standard medium and 872 presumptive zygotes were subjected to IVC in standard medium or supplemented with 3.73mM choline during D0-D3, D0-D5, D0-D7, D3-D7 and D5-D7. In the third study, 1141 selected oocytes were subjected to standard IVM or supplemented with 3.73mM choline, 50M TUDCA or both and IVC was carried out in standard. In the fourth study, IVM was carried out in standard medium and 1645 presumptive zygotes were subjected to IVC in standard medium or supplemented with 3.73mM choline, 50M TUDCA or both. In the fifth study, IVM was carried out in standard medium and 1756 presumptive zygotes were subjected to IVC in standard medium or supplemented with 7mM glucose, glucose + 50M TUDCA, glucose + 3.73mM choline or glucose + TUDCA + choline. In the third study maturation rates were recorded and in all studies cleavage, blastocysts and hatching rates were evaluated. In the studies that assessed culture conditions, immunofluorescence was carried out for evaluating total cell number and CC3 and Sox2 positive cells proportion. Statistical analysis was carried out through one way ANOVA and means comparison by Tukey-Kramer test, adopting as 0.05. Results from the present research showed for the first time, that IVM and IVC media supplementation with choline impairs preimplantation development and embryo quality, that 10mM choline supplementation for 7 days or 3.73mM for the first 5 culture days promote more harm to embryo quality, impairing the development of embryos subjected to stress by glucose when supplemented alone or in the presence of TUDCA. Yet, besides TUDCA seeming to improve embryo development, it was not able to minimize cholines damage

Eficiencia de la transgenesis murina en el institut pasteur de Montevideo / /Murine transgenesis techniques efficiency of institute pasteur Montevideo

Los animales transgénicos son empleados en investigación biomédica para estudiar la función y regulación de los genes, como modelos de enfermedades humanas y para ensayar estrategias terapéuticas. Asimismo, la transgénesis es aplicada en animales productivos para la generación de proteínas recombinantes y la mejora animal, y para la realización de xenotrasplantes. La Unidad de Animales Transgénicos y de Experimentación del Institut Pasteur de Montevideo produce ratones transgénicos a demanda para investigadores locales y de la región. El objetivo de este trabajo es mostrar la eficiencia durante la puesta a punto de alguna de las técnicas empleadas: (i) microinyección pronuclear de ADN (Tg clásica); (ii) transgénesis mediada por lentivirus (LV); y (iii) microinyección de células madre embrionarias (ESC) en blastocistos. Los parámetros evaluados fueron: sobrevida embrionaria 30 min post-inyección, tasa de preñez, de nacimiento, de transgénesis y tasa global de transgénesis. La sobrevida embrionaria resultó en 54,6%, 78,8% y 87,8% para Tg clásica, ESC y LV, respectivamente. El número de embriones GFP (proteína verde fluorescente) + inyectados con LV resultó 42,6%. La tasa de preñez fue 54,8% y 25,0%; la tasa de nacimiento fue 21,3% y 24,0%; la tasa de transgénesis fue 4,5% y 24,1%; y la tasa de transgénesis global fue 0,2% y 0,8%, para Tg clásica y ESC, respectivamente. En suma, se produjeron 21 animales fundadores por Tg clásica, 7 animales quiméricos por inyección de ESC, y más de un 50% de embriones resultaron GFP+ con la técnica de inyección de LV. Las técnicas empleadas resultaron efectivas para obtener los modelos transgénicos solicitados. CEUA Nº 01-012.

Transgenic animals are used in biomedical research to study gene function and regulation, as human disease models, and to test therapeutic strategies. Moreover, transgenic farm animals are used for recombinant protein production, sanitary improvement, and xenotransplantation. The Transgenic and Experimental Animal Unit of Institut Pasteur Montevideo produces transgenic mice for local and regional researchers. The objective of this work is to show the efficiency of transgenesis techniques during their set up at the unit: (i) DNA pronuclear microinjection (classical Tg); (ii) lentiviral-mediated transgenesis (LV); and (iii) embryonic stem cell (ESC) microinjection in blastocysts. The parameters evaluated were: embryo survival 30 min post-injection, pregnancy rate, birth rate, transgenesis rate, and global transgenesis rate. Embryo survival was 54.6%, 78.8% and 87.8% for classical Tg, ESC and LV, respectively. The number of GFP+ embryos injected with LV was 42.6%. Pregnancy rate was 54.8% and 25.0%; birth rate was 21.3% and 24.0%; transgenesis rate was 4.5% and 24.1%; and global transgenesis rate was 0.2% and 0.8%, for classical Tg and ESC, respectively. In total, 21 founder animals were produced by classical Tg, 7 chimeric animals by ESC injection, and more than 50% GFP+ embryos were obtained using LV injection. The techniques used at the unit were effective to obtain the required transgenic models.

Eficiencia de la transgenesis murina en el institut pasteur de Montevideo / /Murine transgenesis techniques efficiency of institute pasteur Montevideo

Los animales transgénicos son empleados en investigación biomédica para estudiar la función y regulación de los genes, como modelos de enfermedades humanas y para ensayar estrategias terapéuticas. Asimismo, la transgénesis es aplicada en animales productivos para la generación de proteínas recombinantes y la mejora animal, y para la realización de xenotrasplantes. La Unidad de Animales Transgénicos y de Experimentación del Institut Pasteur de Montevideo produce ratones transgénicos a demanda para investigadores locales y de la región. El objetivo de este trabajo es mostrar la eficiencia durante la puesta a punto de alguna de las técnicas empleadas: (i) microinyección pronuclear de ADN (Tg clásica); (ii) transgénesis mediada por lentivirus (LV); y (iii) microinyección de células madre embrionarias (ESC) en blastocistos. Los parámetros evaluados fueron: sobrevida embrionaria 30 min post-inyección, tasa de preñez, de nacimiento, de transgénesis y tasa global de transgénesis. La sobrevida embrionaria resultó en 54,6%, 78,8% y 87,8% para Tg clásica, ESC y LV, respectivamente. El número de embriones GFP (proteína verde fluorescente) + inyectados con LV resultó 42,6%. La tasa de preñez fue 54,8% y 25,0%; la tasa de nacimiento fue 21,3% y 24,0%; la tasa de transgénesis fue 4,5% y 24,1%; y la tasa de transgénesis global fue 0,2% y 0,8%, para Tg clásica y ESC, respectivamente. En suma, se produjeron 21 animales fundadores por Tg clásica, 7 animales quiméricos por inyección de ESC, y más de un 50% de embriones resultaron GFP+ con la técnica de inyección de LV. Las técnicas empleadas resultaron efectivas para obtener los modelos transgénicos solicitados. CEUA Nº 01-012.(AU)

Transgenic animals are used in biomedical research to study gene function and regulation, as human disease models, and to test therapeutic strategies. Moreover, transgenic farm animals are used for recombinant protein production, sanitary improvement, and xenotransplantation. The Transgenic and Experimental Animal Unit of Institut Pasteur Montevideo produces transgenic mice for local and regional researchers. The objective of this work is to show the efficiency of transgenesis techniques during their set up at the unit: (i) DNA pronuclear microinjection (classical Tg); (ii) lentiviral-mediated transgenesis (LV); and (iii) embryonic stem cell (ESC) microinjection in blastocysts. The parameters evaluated were: embryo survival 30 min post-injection, pregnancy rate, birth rate, transgenesis rate, and global transgenesis rate. Embryo survival was 54.6%, 78.8% and 87.8% for classical Tg, ESC and LV, respectively. The number of GFP+ embryos injected with LV was 42.6%. Pregnancy rate was 54.8% and 25.0%; birth rate was 21.3% and 24.0%; transgenesis rate was 4.5% and 24.1%; and global transgenesis rate was 0.2% and 0.8%, for classical Tg and ESC, respectively. In total, 21 founder animals were produced by classical Tg, 7 chimeric animals by ESC injection, and more than 50% GFP+ embryos were obtained using LV injection. The techniques used at the unit were effective to obtain the required transgenic models.(AU)

Metabolismo lipídico e estresse celular durante a maturação oocitária e o desenvolvimento embrionário in vivo e in vitro em bovinos

Os mecanismos pelos quais a produção in vitro de embriões (PIVE) bovinos gera embriões com excessivo acúmulo lipídico, com elevado estresse celular e com reduzida criotolerância ainda são desconhecidos. Também permanece desconhecido quando essas alterações acontecem, se acontecem desde a maturação oocitária e o papel que as células do cumulus possuem neste mecanismo. O objetivo do presente trabalho foi estudar e comparar o metabolismo lipídico e homeostase celular, além dos perfis de miRNAs, durante a maturação oocitária e o desenvolvimento embrionário inicial in vivo e in vitro em bovinos. Para isso, o trabalho foi dividido em 4 estudos. No Estudo 1, intitulado A maturação in vitro gera complexos cumulus-oócitos metabolicamente desregulados e estressados em bovinos foram analisadas as células do cumulus e oócitos de complexos cumulus-oócitos (COCs) imaturos e maturados in vivo e in vitro. Foram realizadas análises de quantificação de lipídeos, espécies reativas de oxigênio (EROs), glutationa reduzida (GSH), razão ATP/ADP assim como expressão de mRNAs e miRNAs relacionados com as vias de metabolismo e homeostase celular. A partir dos dados obtidos neste estudo, concluímos que a maturação in vitro (MIV) provoca aumento de lipídeos no COC, diminuição de GSH e da atividade mitocondrial nos oócitos, acompanhado por uma desregulação massiva das vias relacionadas a metabolismo e homeostase nas células do cumulus da MIV. No Estudo 2, intitulado A proteína ligadora de ácidos graxos 3 (Fatty Acid Binding Protein 3 - FABP3) e as projeções transzonais estão envolvidas no acúmulo lipídico durante a maturação in vitro em oócitos bovinos foi constatado aumento do conteúdo lipídico e da expressão da FABP3 nas células do cumulus da MIV, quando comparado ao sistema in vivo. Ainda, imunolocalizamos a FABP3 dentro das projeções transzonais (TZPs) e verificamos um aumento concomitante da FABP3 e dos lipídeos oocitários nas primeiras 9 horas da MIV. Mediante a remoção das TZPs às 9 horas da MIV e consequente diminuição lipídica observada no oócito, concluímos que existe um possível transporte de ácidos graxos a partir das células do cumulus até o oócito mediante FABP3 e TZPs. No Estudo 3, intitulado Alterações no metabolismo lipídico e homeostase celular entre embriões bovinos produzidos in vivo e in vitro, verificamos que, mesmo utilizando um cultivo in vitro com baixa tensão de oxigênio e sem soro, os blastocistos da PIVE possuem maiores níveis de lipídeos e EROs que aqueles produzidos in vivo. Além disso, constatamos que essas alterações nos lipídeos durante a PIVE não estão acompanhadas de alterações de expressão, porém, existe um aumento na expressão de genes relacionados com estresse. No último estudo, O sistema in vitro altera o perfil de miRNAs durante a maturação oocitária e desenvolvimento embrionário inicial em bovino, constatamos as diferenças no perfil de miRNAs e nas vias reguladas por estes nas células do cumulus e oócitos maturados in vivo e in vitro e em blastocistos produzidos in vivo e in vitro. Verificamos uma maior regulação por miRNAs durante a maturação nas células do cumulus comparado ao oócito. Além do mais, tanto no COC quanto nos blastocistos, os miRNAs mostraram regular vias importantes do metabolismo, comunicação celular e vias de sinalização importantes para a maturação e desenvolvimento embrionário inicial. Conjuntamente, este trabalho permitiu elucidar as diferenças que a PIVE provoca no metabolismo e homeostase celular e na expressão de miRNAs.

The mechanism through which in vitro embryo production (IVEP) generates embryos with higher lipid accumulation, overstressed and with reduced cryotolerance is unknown. It is also unknown when these alterations take place, if occurs since the oocyte maturation and the role of cumulus cells in this mechanism are also unknown. The aim of the present work was to study and compare the lipid metabolism and cellular homeostasis, as well as the miRNAs profile during oocyte maturation and early in vivo and in vitro embryo development in bovines. For that, the present work was divided in 4 studies. In Study 1, entitled In vitro maturation generates metabolically disrupted and overstressed cumulus-oocyte complexes in bovines cumulus cells and oocytes from immature and in vivo and in vitro matured cumulus-cells complexes (COC) were analyzed. Analysis of lipid stores, oxygen reactive species (ROS), reduced glutathione and ATP/ADP ratio quantification, as well as mRNAs and miRNAs involved with metabolism and cellular homeostasis pathways were performed. From the obtained data in this study, we concluded that in vitro maturation (IVM) leads to an increase of lipids in the COC, a decrease of oocyte GSH and mitochondrial activity, as well as a massive deregulation in metabolism and homeostasis related pathways in MIV cumuls cells. In Study 2, Fatty Acid Binding Protein 3 and transzonal projections are involved on lipid accumulation during in vitro maturation in bovine oocytes we observed an increase of lipid accumulation and FABP3 expression in MIV cumulus cells when compared to the in vivo system. Furthermore, we immunolocalized the FABP3 inside the transzonal projections (TZPs) and verified a concomitant increase of FABP3 and oocyte lipids on the first 9 hours of MIV. By removing the TZPs at 9 hours of MIV and by the consequent lipid decrease observed in the oocyte, we concluded that there is a possible traffic of fatty acids from the cumulus cells to the oocyte mediated by FABP3 and TZPs. In Study 3, entitled Alterations in lipid metabolism and cellular homeostasis between in vivo and in vitro produced bovine embryos, we observed that, even though under serum free and low oxygen tension used during in vitro culture was used, IVP blastocysts had higher lipid and ROS levels than the counterparts produced in vivo. Moreover, we found that these lipid alterations during IVP are not followed by corresponding genes expression alterations, however, there is an increase of the expression of stress related genes. In the last study, in vitro system alters miRNAs profile during oocyte maturation and early embryo development in bovines, we observed differences in miRNAs profiles and in pathways modulated by them in in vivo and in vitro matured cumulus cells and oocytes and in in vivo and in vitro produced blastocysts. We observed an intense miRNAs regulation during maturation in cumulus cells when compared to the oocyte. Furthermore, in both COC and blastocysts, miRNAs regulated important metabolism, cellular communication pathways, as well as important signaling pathways for maturation and early embryo development. Taken together, the findings of the present work allowed us to elucidate the differences caused by IVEP on cell metabolism and homeostasis as well as on miRNAs expression.

Produção in vitro de embriões caprinos: efeito da melatonina nos meios de cultivo embrionário

A produção in vitro de embriões caprinos ainda não é considerada uma biotecnologia rotineiramente efetiva. Um dos fatores mais importante e que dificulta a evolução no processo de todo o processo da PIV é o estresse oxidativo. A proposta adotada neste estudo foi avaliar os efeitos da adição de melatonina em meios de maturação e cultivo in vitro no desenvolvimento de embriões caprinos e na qualidade dos blastocistos oriundos de oocitos de cabras pré-púberes. O objetivo do primeiro estudo foi avaliar o efeito da melatonina no meio de cultura in vitro de embriões partenogenéticos através da taxa de desenvolvimento de blastocistos e vitrificação. Foi utilizado um meio de maturação e de cultivo in vitro e convencional com e sem melatonina (10-9 mol L-1). Os oocitos com células do Cumulus oophorus foram maturados in vitro naqueles meios de maturação por 27 h e então ativados. Estas células ativadas foram cultivadas nos respectivos meios de cultivo por oito dias e então aferidos as taxas de blastocistos. O método de vitrificação foi utilizado de acordo com Mermillod et al., 1998. A adição da melatonina a 10-9 mol L 1 aos meios de maturação e de cultivo in vitro não apresentou melhora na taxa de blastocistos produzidos. Na segunda parte deste estudo objetivou-se avaliar o efeito da melatonina no meio de cultura in vitro, porém em embriões fertilizados artificialmente, por meio da taxa de desenvolvimento de blastocistos. Utilizou-se um meio convencional para MIV com ou sem adição de melatonina a 10-9 mol L-1. Após a MIV, os oocitos maturados foram inseminados com semen a fresco, e os espermatozoides foram capacitados em meio de capacitação contendo heparina. Os possíveis zigotos foram separados e uma parte foi cultivado em meio de cultura padrão com adição da melatonina a 10-9 mol L-1. Ambos foram cultivados durante oito dias e a taxa de blastocisto foi aferida. Os resultados desta segunda etapa mostraram que ao utilizar melatonina a 10-9 mol L-1 adicionada ao meio de maturação in vitro convencional melhoraram quanto ao número de células fertilizadas (34,57% vs. 17,39%, p<0,05), embora, não houve melhora na taxa de clivagem e no número de blastocistos produzidos. A conclusão mostra que a melatonina a 10-9 mol L-1 adicionada tanto em MIV, quanto em CIV, não melhora o desenvolvimento e a produção dos embriões in vitro, embora possa aumentar a taxa fertilização in vitro.

The in vitro production of goat embryos is not considered a routinely effective biotechnology. There are a number of factors that hinder the progress in the process of maturation, fertilization, cultivation and freezing. One of the most important factors that cause deleterious effects throughout the IVP process is the oxidative stress. The proposal of this study in order to prevent and to control that stress condition was to supplement the in vitro maturation (IVM) and in vitro culture media (IVC) with melatonin evaluating it effects on the development of goat embryos and quality of embryos derived from prepubertal goats oocytes. The aim of the first experiment was to evaluate the effect of melatonin supplementation in the in vitro culture on development of parthenogenetic embryos. It was used two in vitro maturation media [conventional maturation media (CM) and CM + 10-9 M melatonin] and two in vitro culture media [conventional cultivation media (CC) and CC + 10-9 M melatonin. The oocytes with cumulus cells were randomly distributed in the IVM and then activated by ionomycin method followed by 6-DMAP. Afterwards, presumptive zygotes were randomly distributed in the IVC media and cultured for eight days. Supplementation of 10-9 M melatonin to the IVM and IVC media showed no improvement in the parthenogenetic blastocyst rate. The blastocyst rate diminished when melatonin was added in vitro culture medium. The second study was also evaluate the effect of melatonin in vitro culture medium, but using in vitro fertilization over the blastocyst development rate. We used a conventional medium (CM) to in vitro maturation media and other CM was supplemented with melatonin at 10-9 M. After IVM, the matured oocytes were inseminated with fresh semen, and then, that spermatozoa were capacitated and cultured for eight days. There was an in vitro culture media used and other one added with melatonin (10-9 M). The results of this second study demonstrated that the use of melatonin at 10-9 M added to the in vitro conventional maturation medium presented a beneficial effect on the number of fertilized cells (34.57 % vs. 17.39%, p<0.05). However, this addition there was no improvement in the cleavage rate nor the blastocyst rate. We concluded that melatonin at 10-9 M added in both IVM medium and IVC medium do not improve the development of embryos. However, it can be a gain in the in vitro fertilization rate when melatonin is added in the IVM medium.

Survival rates of mouse blastocyst vitrified in dimethylformamide based solutions associated with ethylene glicol or 1-2 propanediol

The aim of this study was to determine the effect of dimethylformamide (DF) associated with ethylene glycol (EG) or 1-2 propanediol (PROH) during vitrification, on the in vitro development of mouse blastocysts. Cryoprotectant toxicity was evaluated exposing embryos into three different equilibrium solutions (ES) composed by DF, EG or PROH mixtures (10% v/v of each) in mPBS + 0.5% PVA at different interval times (1, 3 and 10min). In a second experiment, embryos were exposed to the same ES (either 1 or 3min), following for the three respectively vitrification solutions (VS) (20% v/v of each) for 30s. After 72 hours of in vitro culture, embryo hatching and expansion rates were similar for the ES1 and ES2 equilibration solutions during the time interval of 1 or 3min. However embryos exposed for 10 min to the DF equilibration solutions, had lower survival rates than EG-PROH solution (P 0.01). Furthermore, survival rates for embryos exposed to DF-PROH (ES+VS) were lower than embryos exposed to the other solutions (P 0.01). Blastocyst vitrification was performed with the three ES+VS (for 1min and 30s, respectively), using glass micropipettes (GMP). Survival rates were lower for blastocysts vitrified with DF solutions (3%-3/108 and 17.1%-19/111) (P 0.01) than with PROH+EG vitrification solutions (69%-73/105). In conclusion, DF as a cryoprotectant into vitrification solutions have deleterious effects on the in vitro developmental competence of vitrified mouse blastocysts.

O objetivo deste estudo foi determinar o efeito da dimetilformamida (DF) associada com etileno glycol (EG) ou 1-2 propanediol (PROH) durante a vitrificação, no desenvolvimento in vitro de blastocistos murinos. A toxicidade dos crioprotetores foi avaliada ao expor os embriões as três soluções de equilíbrio (ES) compostas pelas misturas de DF, EG ou PROH (10% v/v de cada) em mPBS + 0,5% PVA, em diferentes intervalos de tempo (1, 3 e 10min). Em um segundo experimento, os embriões foram expostos as mesmas ES (durante 1 e 3min), seguido da exposição as três respectivas soluções de vitrificação (VS) (20% v/v de cada) durante 30seg. Após 72 horas de cultivo in vitro, as taxas de expansão e eclosão dos embriões expostos durante os períodos de 1 e 3min às soluções de equilíbrio ES1 e ES2 foram semelhantes. No entanto, os embriões expostos durante 10min às soluções de equilíbrio com DF apresentaram taxas de sobrevivência inferiores à solução de EG-PROH (P 0,01). Além disso, as taxas de sobrevivência dos embriões expostos à DF-PROH (ES+VS) foram menores que as dos embriões expostos as outras soluções (P 0,01). A vitrificação dos blastocistos foi realizada após a exposição dos embriões nas três ES+VS (por 1min e 30seg, respectivamente), usando micropipetas de vidro (GMP). As taxas de sobrevivência foram menores nos blastocistos vitrificados nas soluções compostas por DF (3%-3/108 e 17,1%-19/111), em relação à solução EG-PROH (69%-73/105) (P 0,01). Em conclusão, a DF adicionada como crioprotetor às soluções de vitrificação apresenta efeitos deletérios na capacidade de desenvolvimento in vitro dos blastocistos murinos vitrificados.

Survival rates of mouse blastocyst vitrified in dimethylformamide based solutions associated with ethylene glicol or 1-2 propanediol

The aim of this study was to determine the effect of dimethylformamide (DF) associated with ethylene glycol (EG) or 1-2 propanediol (PROH) during vitrification, on the in vitro development of mouse blastocysts. Cryoprotectant toxicity was evaluated exposing embryos into three different equilibrium solutions (ES) composed by DF, EG or PROH mixtures (10% v/v of each) in mPBS + 0.5% PVA at different interval times (1, 3 and 10min). In a second experiment, embryos were exposed to the same ES (either 1 or 3min), following for the three respectively vitrification solutions (VS) (20% v/v of each) for 30s. After 72 hours of in vitro culture, embryo hatching and expansion rates were similar for the ES1 and ES2 equilibration solutions during the time interval of 1 or 3min. However embryos exposed for 10 min to the DF equilibration solutions, had lower survival rates than EG-PROH solution (P 0.01). Furthermore, survival rates for embryos exposed to DF-PROH (ES+VS) were lower than embryos exposed to the other solutions (P 0.01). Blastocyst vitrification was performed with the three ES+VS (for 1min and 30s, respectively), using glass micropipettes (GMP). Survival rates were lower for blastocysts vitrified with DF solutions (3%-3/108 and 17.1%-19/111) (P 0.01) than with PROH+EG vitrification solutions (69%-73/105). In conclusion, DF as a cryoprotectant into vitrification solutions have deleterious effects on the in vitro developmental competence of vitrified mouse blastocysts.

O objetivo deste estudo foi determinar o efeito da dimetilformamida (DF) associada com etileno glycol (EG) ou 1-2 propanediol (PROH) durante a vitrificação, no desenvolvimento in vitro de blastocistos murinos. A toxicidade dos crioprotetores foi avaliada ao expor os embriões as três soluções de equilíbrio (ES) compostas pelas misturas de DF, EG ou PROH (10% v/v de cada) em mPBS + 0,5% PVA, em diferentes intervalos de tempo (1, 3 e 10min). Em um segundo experimento, os embriões foram expostos as mesmas ES (durante 1 e 3min), seguido da exposição as três respectivas soluções de vitrificação (VS) (20% v/v de cada) durante 30seg. Após 72 horas de cultivo in vitro, as taxas de expansão e eclosão dos embriões expostos durante os períodos de 1 e 3min às soluções de equilíbrio ES1 e ES2 foram semelhantes. No entanto, os embriões expostos durante 10min às soluções de equilíbrio com DF apresentaram taxas de sobrevivência inferiores à solução de EG-PROH (P 0,01). Além disso, as taxas de sobrevivência dos embriões expostos à DF-PROH (ES+VS) foram menores que as dos embriões expostos as outras soluções (P 0,01). A vitrificação dos blastocistos foi realizada após a exposição dos embriões nas três ES+VS (por 1min e 30seg, respectivamente), usando micropipetas de vidro (GMP). As taxas de sobrevivência foram menores nos blastocistos vitrificados nas soluções compostas por DF (3%-3/108 e 17,1%-19/111), em relação à solução EG-PROH (69%-73/105) (P 0,01). Em conclusão, a DF adicionada como crioprotetor às soluções de vitrificação apresenta efeitos deletérios na capacidade de desenvolvimento in vitro dos blastocistos murinos vitrificados.

Survival rates of mouse blastocyst vitrified in dimethylformamide based solutions associated with ethylene glicol or 1-2 propanediol

The aim of this study was to determine the effect of dimethylformamide (DF) associated with ethylene glycol (EG) or 1-2 propanediol (PROH) during vitrification, on the in vitro development of mouse blastocysts. Cryoprotectant toxicity was evaluated exposing embryos into three different equilibrium solutions (ES) composed by DF, EG or PROH mixtures (10% v/v of each) in mPBS + 0.5% PVA at different interval times (1, 3 and 10min). In a second experiment, embryos were exposed to the same ES (either 1 or 3min), following for the three respectively vitrification solutions (VS) (20% v/v of each) for 30s. After 72 hours of in vitro culture, embryo hatching and expansion rates were similar for the ES1 and ES2 equilibration solutions during the time interval of 1 or 3min. However embryos exposed for 10 min to the DF equilibration solutions, had lower survival rates than EG-PROH solution (P 0.01). Furthermore, survival rates for embryos exposed to DF-PROH (ES+VS) were lower than embryos exposed to the other solutions (P 0.01). Blastocyst vitrification was performed with the three ES+VS (for 1min and 30s, respectively), using glass micropipettes (GMP). Survival rates were lower for blastocysts vitrified with DF solutions (3%-3/108 and 17.1%-19/111) (P 0.01) than with PROH+EG vitrification solutions (69%-73/105). In conclusion, DF as a cryoprotectant into vitrification solutions have deleterious effects on the in vitro developmental competence of vitrified mouse blastocysts.

O objetivo deste estudo foi determinar o efeito da dimetilformamida (DF) associada com etileno glycol (EG) ou 1-2 propanediol (PROH) durante a vitrificação, no desenvolvimento in vitro de blastocistos murinos. A toxicidade dos crioprotetores foi avaliada ao expor os embriões as três soluções de equilíbrio (ES) compostas pelas misturas de DF, EG ou PROH (10% v/v de cada) em mPBS + 0,5% PVA, em diferentes intervalos de tempo (1, 3 e 10min). Em um segundo experimento, os embriões foram expostos as mesmas ES (durante 1 e 3min), seguido da exposição as três respectivas soluções de vitrificação (VS) (20% v/v de cada) durante 30seg. Após 72 horas de cultivo in vitro, as taxas de expansão e eclosão dos embriões expostos durante os períodos de 1 e 3min às soluções de equilíbrio ES1 e ES2 foram semelhantes. No entanto, os embriões expostos durante 10min às soluções de equilíbrio com DF apresentaram taxas de sobrevivência inferiores à solução de EG-PROH (P 0,01). Além disso, as taxas de sobrevivência dos embriões expostos à DF-PROH (ES+VS) foram menores que as dos embriões expostos as outras soluções (P 0,01). A vitrificação dos blastocistos foi realizada após a exposição dos embriões nas três ES+VS (por 1min e 30seg, respectivamente), usando micropipetas de vidro (GMP). As taxas de sobrevivência foram menores nos blastocistos vitrificados nas soluções compostas por DF (3%-3/108 e 17,1%-19/111), em relação à solução EG-PROH (69%-73/105) (P 0,01). Em conclusão, a DF adicionada como crioprotetor às soluções de vitrificação apresenta efeitos deletérios na capacidade de desenvolvimento in vitro dos blastocistos murinos vitrificados.

AÇÕES DA Binder of SPerm Protein 1 (BSP1) SOBRE A FUNCIONALIDADE DE ESPERMATOZOIDES BOVINOS: REAÇÃO ACROSSÔMICA, TAXA DE CLIVAGEM E PRODUÇÃO in vitro DE BLASTOCISTOS

A Binder of Sperm Protein 1 (BSP1) é uma proteína produzida pelas vesículas seminais dos animais, que ajuda no processo de fertilização do oócito promovendo a capacitação espermática, mediando a sua ligação com o epitélio do oviduto e aumentando sua motilidade no oviduto. As taxas de reação de acrossoma dos espermatozoides foram determinadas ao serem incubados com BSP1 purificado, e com e sem a presença de heparina, como controles. A porcentagem de reação de acrossoma foi maior (p<0.05) no controle 1 (44.5%) comparado com os tratamentos restantes (BSP1: 10 µg/mL: 24.5%; 20 µg/mL: 25.5%; 40 µg/mL: 26.0%), sendo menor esta taxa (p>0.05) quando os espermatozoides só foram incubados no meio Fert-TALP sem heparina (14.5%). As taxas de clivagem e de blastocistos foram avaliadas nos dias dois e sete respectivamente, depois de fertilizar oócitos em um meio que continha BSP1. Foram recuperados 1274 COCs e incubados durante 18 horas com sêmen ejaculado congelado- descongelado em meio Fert-TALP, que continha: só heparina, 10, 20 ou 40 µg/mL de BSP1. As taxas de clivagem e de blastocistos (34.1 ± 4.4 vs 40.8 ± 5.0%) foram similares (p>0.05) quando se fez a incubação com 10 µg/mL de BSP1 e heparina, respectivamente. Porém, as concentrações de 20 e 40 µg/mL diminuíram a formação de blastocistos (22.4 ± 2.9 e 19.3 ± 4.1%) em relação com a heparina (40.8 ± 5.1%; p < 0.02). Posteriormente foram incubados COCs (n= 2239), com sêmen ejaculado congelado-descongelado que foi selecionado por um gradiente de Percoll® 45%-90% que continha: só heparina, 10, 20 ou 40 µg/mL de BPS1 e foi realizado um controle 2 de Percoll® sem heparina nem BSP1. A taxa de clivagem foi similar (p > 0.05) para a incubação com as concentrações de 10, 20 e 40 µg/mL de BSP1 (67.7±3.0, 68.7±3.5, 75.2±3.8). Porém, estas taxas foram similares quando só foi usada heparina e quando se incubou com 40 µg/mL de BSP1 (78.9±1.7 vs 75.2±3.8%). Para as taxas de blastocistos encontrou-se que foram similares (p > 0.05) quando se fez a seleção com heparina (44.1±4.3%) e com 40 µg/mL de BSP1 (30.0±3.3%). Finalmente, foram recuperados 1213 complexos cumulus-oócitos e incubados com espermatozoides epididimários congelados-descongelados em meio Fert-TALP, que continham: só heparina, sem heparina, e 10, 20 ou 40 µg/mL de BSP1. As taxas de clivagem e de blastocistos foram similares após as incubações com e sem heparina, mas a concentração de 40 µg/mL de BSP1 produziu maiores taxas de clivagem (79.0 ± 1.1%) que o controle 1 (68.5 ± 1.3%; p < 0.05). Quanto às taxas de blastocistos, encontraram-se maiores taxas quando foram usadas as concentrações de 20 e 40 µg/mL de BSP1 (35.6 ± 2.5 e 41.1 ± 2.0%) que com (24.7 ± 3.2; p < 0.05) e sem heparina (27.3 ± 1.6%; p < 0.0003). Em conclusão, a BSP1 adicionada ao meio de fertilização e ao gradiente de Percoll® quando usado o sêmen ejaculado, e ao meio de fertilização quando usados espermatozoides epididimários, permitiu clivagem e desenvolvimento próprio, sem a necessidade do uso de heparina.

The Binder of Sperm Protein 1 (BSP1) is a protein produced by seminal vesicles of animals. It helps into the fertilization process of oocytes, promoting sperm capacitation, mediating the ligation from itself with the oviduct epithelium, and increasing the motility in the oviduct. When spermatozoa with purified BSP1 were incubated, acrosomal reaction rates were determined with and without the presence of heparin, as controls. The percentage of acrosomal reaction was higher (p <0.05) in control 1 (44.5%) compared with the other treatments (BSP1:10 g/mL: 24.5%; 20 g/mL: 25.5%; 40 g/mL: 26.0 %), and lower the rate (p> 0.05) when sperm were incubated only in Fert-TALP medium without heparin (14.5%). Cleavage and blastocyst rates were evaluated on days two and seven respectively, after fertilize oocytes in a medium containing BSP1. 1274 cumulus-oocyte complexes were recovered and incubated for 18 hours with frozen-thawed ejaculated semen in a Fert-TALP medium, containing: only heparin, 10, 20 or 40 g/mL of BSP1. Cleavage and blastocyst rates (34.1 ± 4.4 vs 40.8 ± 5.0%) were similar (p> 0.05) when incubation was made with 10 g/mL of BSP1 and heparin, respectively. However, the concentrations of 20 and 40 g/mL decreased the formation of blastocysts (22.4 ± 2.9 and 19.3 ± 4.1%) compared with heparin (40.8 ± 5.1%, p <0.02). Subsequently, cumulus-oocyte complexes (n = 2239) were incubated with frozen-thawed ejaculated semen. Spermatozoa were selected by a gradient of 45% -90% Percoll® containing: only heparin, 10, 20, 40 g/mL of BSP1 and there was a control 2 of Percoll® without heparin or BSP1. Cleavage rate was similar (p> 0.05) for the incubation with concentrations of 10, 20 and 40 g/mL of BPS1 (67.7 ± 3.0, 68.7 ± 3.5, 75.2 ± 3.8, respectively). However, these rates were similar when it was used just heparin and when oocytes were incubated with 40 g/mL of BSP1 (78.9 ± 1.7 vs 75.2 ± 3.8%). For blastocyst rates was found that they were similar (p> 0.05) when the selection was made with heparin (44.1 ± 4.3%) and 40 g/mL of BSP1 (30.0 ± 3.3%). Finally, 1213 cumulus-oocyte complexes were recovered and incubated with freeze-thawed epididymal semen in Fert-TALP medium, which contained: only heparin, with heparin, and 10, 20 or 40 g/mL of BSP1. Cleavage and blastocyst rates were similar after incubation with and without heparin, but the concentration of 40 g/mL of BSP1 produced higher cleavages rates (79.0 ± 1.1%) than control 1 (68.5 ± 1.3%, p <0.05). About blastocyst rates, there were rates significantly higher when concentrations of 20 and 40 g/mL of BSP1 were used (35.6 ± 2.5 and 41.1 ± 2.0%) than with (24.7 ± 3.2; p <0.05) and without heparin (27.3 ± 1.6%; p <0.0003). In conclusion, BSP1 allowed proper cleavage and development, when the protein was added to the fertilization medium and the Percoll® gradient using ejaculated semen, and to the fertilization medium when used epididymal sperm, without requiring the use of heparin.