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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-216361

Resumo

O objetivo do presente estudo foi avaliar a adição da Kisspeptina (Kp) no processo in vitro de seleção espermática, quanto à viabilidade dos espermatozoides bovinos e taxas de produção embrionária. Para isso foram utilizados 980 ovócitos provenientes de ovários de abatedouro-frigorífico e 75 palhetas de sêmen comercial bovino. Os tratamentos foram realizados nos espermatozoides durante a etapa de seleção espermática in vitro pelo método de centrifugação com gradientes descontínuos de Percoll® 90% e 45% de acordo com os seguintes tratamentos: Controle (n = 182), Kp 10-5 M (n = 198), Kp 10-6 M (n = 200), Kp 10-7 M (n = 206) e antagonista P-234 50 µM (n = 194), com as diluições realizadas nos dois gradientes respeitando-se as devidas concentrações. Os espermatozoides foram analisados no momento pré e pós seleção espermática para motilidade e vigor, e submetidos à coloração pelas sondas JC-1, IP e FITC-PSA, para avaliar o potencial mitocondrial, integridade de membrana plasmática e integridade do acrossoma em microscópio de varredura a laser confocal LSM 510 meta. Posterior aos tratamentos, os espermatozoides foram utilizados normalmente nos procedimentos de PIVE. No D2 e D7 foram realizadas análises de produção, baseadas nas taxas de clivagem e blastocistos, respectivamente. Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade pelo guided analisys do SAS, posteriormente utilizado o proc GLIMMIX para avaliação do modelo experimental e posteriormente ao teste de Tukey-Kramer para comparação de médias. Diferenças foram consideradas quando P < 0,05. Os resultados de motilidade e vigor e taxas de produção embrionária foram semelhantes (P > 0,05) entre todos os tratamentos propostos. A taxa de clivagem (n=846) foi maior que 82% e a porcentagem de produção de blastocistos (n=331) foi maior que 29%. Quanto ao potencial mitocondrial, os grupos Kp 10-6 e Kp 10-7 (92,6%) foram superiores (P < 0,05) aos grupos Controle (89,8%) e P-234 (83,8%), sendo este último inferior (P < 0,05) a todos os outros tratamentos. Na avaliação da integridade de membrana plasmática e integridade do acrossoma (IMP/IA), os tratamentos com adição de Kp foram semelhantes (P > 0,05) entre si Kp 10-5 (88,9%/90,9%), Kp 10-6 (90,7%/91,8%) e Kp 10-7 (90,2%/91,4%) e ao antagonista P-234 (90,5%/90,8%), respectivamente. Apenas o tratamento Kp 10-6 apresentou resultado superior (P < 0,05) ao grupo Controle (87,9%/89,1%). Ao correlacionar as variáveis analisadas pela microscopia confocal, foi observada uma correlação significativa e positiva entre alto potencial mitocondrial e integridade de membrana plasmática (r = 0,80; P < 0,0001), integridade de acrossoma e alto potencial mitocondrial (r = 0,80; P < 0,0001), integridade de membrana plasmática e integridade de acrossoma (r = 0,84; P < 0,0001). Finalmente, pode-se concluir que a concentração equilibrada da Kp proporcionou maior viabilidade aos espermatozoides bovinos referente ao potencial mitocondrial, integridade acrossômica e de membrana plasmática. Já o antagonista P-234 apresentou efeito prejudicial referente ao potencial mitocondrial.

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The aim of the present study was to evaluate the addition of Kisspeptin (Kp) in the in vitro process of spermatic selection, regarding the viability of bovine spermatozoa and embryo production rates. For this, 980 oocytes were obtained from slaughterhouse ovaries and 75 commercial bovine semen straws were used. The treatments were performed on the spermatozoa during the in vitro spermatic selection stage by the centrifugation method with 90% and 45% Percoll® discontinuous gradients according to each proposed treatment: Control (n = 182), Kp 10-5 M (n = 198 ), Kp 10-6 M (n = 200), Kp 10-7 M (n = 206) and 50 M P-234 antagonist (n = 194), with the dilutions carried out on both gradients respected concentrations. The spermatozoa were analyzed before and after spermatic selection for motility and vigor, and were submitted to staining with fluorescent probes JC-1, IP and FITC-PSA, to evaluate the mitochondrial potential, plasma membrane integrity and acrosome integrity under confocal laser scanning microscope LSM 510 meta. After the treatments, spermatozoa were normally used in IVEP procedures. The production analyzes were performed on D2 and D7, based respectively on cleavage and blastocysts rates. The data were submitted to the normality and homogeneity test by guided analysis SAS, after were used the proc GLIMMIX procedure to evaluate the experimental model and later the Tukey-Kramer test for comparison of means. Differences are considered when P < 0.05. The results of motility, vigor and production rates were similar (P> 0.05) among all proposed treatments. The cleavage rate (n = 846) was higher than 82% and the percentage of blastocyst production (n = 331) higher than 29% in all treatments. The mitochondrial potential of Kp 10-6 and Kp 10-7 (92.6%) groups was higher (P <0.05) to the Control (89.8%) and P-234 (83.8%) groups, the latter being lower (P <0.05) than all other treatments. Plasma membrane integrity and acrosome integrity (PMI/AI) evaluations showed that treatments with Kp addition were similar, (P> 0.05) Kp 10-5 (88.9%/90.9%), Kp 10-6 (90.7%/91.8%) and Kp 10-7 (90.2%/91.4%) and the P-234 antagonist (90.5%/90.8%), respectively. The Kp 10-6 treatment presented a superior result (P <0.05) to the Control group (87.9%/89.1%). When correlating the variables analyzed by confocal microscopy, a significant and positive correlation was observed between high mitochondrial potential and plasma membrane integrity (r = 0.80; P <0.0001), acrosome integrity and high mitochondrial potential (r = 0 , 80, P <0.0001), plasma membrane integrity and acrosome integrity (r = 0.84, P <0.0001). Finally, it can be concluded that the balanced concentration of Kp provided greater viability to bovine spermatozoa related to mitochondrial potential, acrosome integrity and plasma membrane. The P-234 antagonist presented a detrimental effect on the mitochondrial potential.

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