Levamisole modulates the cell-mediated immunity of matrinxã, Brycon amazonicus / Levamisole modula a imunidade mediada por células de Matrinxã, Brycon amazonicus

The use of immunomodulators is an alternative to improve the immune system of fish and avoid the excessive use of antibiotics. Levamisole is a synthetic anthelmintic which promotes a potent immunostimulation on innate and acquired variables of fish. In order to access the levamisole effects on matrinxã, Brycon amazonicus, fish were fed levamisole at 500 mg kg-1 of diet for seven days. After this period fish were submitted to blood collection. Immunological variables, such as leukocytes respiratory burst, total serum protein, albumin, globulin, albumin:globulin index and hematological variables, such as hematocrit, hemoglobin, red and white blood cell (WBC) and Wintrobe indexes were evaluated. The levamisole administration increased the WBC counts indicating that the immunostimulant modulates the cell-mediated immunity. The increased WBC indicate that the fish fed levamisole were in a better body condition, and probable more resistant to disease due to potential for phagocytosis activation, degranulation of neutrophilic granules, and consequently production of antibodies and immunological memory. Besides, these findings are important for news projects regarding the production of vaccines and deeper understanding of fish cell-mediated immunity.

A utilização de imunoestimulante é uma alternativa para melhorar o sistema imune de peixes e evitar o uso excessivo de antibióticos. O levamisol é um anti-helmíntico sintético que promove uma potente estimulação imunológica em peixes, aumentando variáveis inatas e adquiridas de defesa. A fim de avaliar os efeitos do levamisol sobre matrinxã, Brycon amazonicus, os peixes foram alimentados com 500 mg kg-1 de levamisol na dieta durante sete dias. Após este período os peixes foram submetidos à colheita de sangue. Variáveis imunes, tais como a atividade respiratória de leucócitos, proteína total sérica, albumina, globulina, índice albumina:globulina e os parâmetros hematológicos, tais como hematócrito, hemograma completo, hemoglobina, número de eritrócitos e o volume corpuscular médio dos eritrócitos foram avaliados. A utilização do levamisol aumentou a contagem dos leucócitos do sangue indicando que o imunoestimulante modulou a imunidade mediada por células, entretanto, nenhuma alteração foi observada nas demais variáveis. O aumento dos leucócitos do sangue indica que os peixes alimentados com levamisol estão em uma condição corporal melhor, e em um possível surto terão mais resistência às doenças e potencial para ativação da fagocitose e degranulação de neutrófilos. Além disso, os resultados são importantes para novos projetos sobre a produção de vacinas, e sobre a compreensão mais profunda da imunidade mediada por células em peixes.

Phenoloxidase activity and haemolymph cytology in honeybees challenged with a virus suspension (deformed wings virus DWV) or phosphate buffered suspension (PBS) / Atividade fenoloxidase e citologia de hemolinfa em abelhas infectadas com uma suspensão de vírus (DWV deformed wings) ou suspensão tamponada com fosfato (PBS)

The innate immune system of honeybees mainly consists in antimicrobial peptides, cellular immunity and melanisation. In order to investigate the immune response of honeybees to immune stressors, three stress degrees were tested. Newly emerged bees naturally DWV-infected were collected from a Varroa mite-free apiary and divided into three experimental groups: naturally DWV infected bees, PBS injected bees, and artificially DWV super infected bees. Phenoloxidase activity and haemolymph cellular subtype count were investigated. Phenoloxidase activity was highest (P<0.05) in DWV-superinfected bees, and the haemocyte population differed within the three observed groups. Although, immune responses following DWV infection have still not been completely clarified, this investigation sheds light on the relation between cell immunity and the phenoloxidase activity of DWV-naturally infected honeybees exposed to additional stress such as injury and viral superinfection.(AU)

O sistema imune inato das abelhas consiste principalmente em peptídeos antimicrobianos, imunidade celular e melanização. Para investigar a resposta imune das abelhas a estressores imunológicos, foram testados três graus de estresse. Abelhas recém-emergidas naturalmente infectadas por DWV foram coletadas de um apiário livre de Varroa e divididas em três grupos experimentais: abelhas naturalmente infectadas por DWV, abelhas injetadas com PBS e abelhas superinfectadas artificialmente com DWV. A atividade de fenoloxidase e a contagem de subtipos celulares de hemolinfa foram investigadas. A atividade da fenoloxidase foi maior (P<0,05) nas abelhas super-infectadas com DWV, e a população de hemócitos diferiu entre os três grupos observados. Embora as respostas imunes após a infecção pelo DWV ainda não tenham sido completamente esclarecidas, esta investigação lança luz sobre a relação entre a imunidade celular e a atividade da fenoloxidase das abelhas infectadas naturalmente pelo DWV, expostas a estresse adicional, como lesão e superinfecção viral.(AU)

Levamisole modulates the cell-mediated immunity of matrinxã, Brycon amazonicus / Levamisole modula a imunidade mediada por células de Matrinxã, Brycon amazonicus

The use of immunomodulators is an alternative to improve the immune system of fish and avoid the excessive use of antibiotics. Levamisole is a synthetic anthelmintic which promotes a potent immunostimulation on innate and acquired variables of fish. In order to access the levamisole effects on matrinxã, Brycon amazonicus, fish were fed levamisole at 500 mg kg-1 of diet for seven days. After this period fish were submitted to blood collection. Immunological variables, such as leukocytes respiratory burst, total serum protein, albumin, globulin, albumin:globulin index and hematological variables, such as hematocrit, hemoglobin, red and white blood cell (WBC) and Wintrobe indexes were evaluated. The levamisole administration increased the WBC counts indicating that the immunostimulant modulates the cell-mediated immunity. The increased WBC indicate that the fish fed levamisole were in a better body condition, and probable more resistant to disease due to potential for phagocytosis activation, degranulation of neutrophilic granules, and consequently production of antibodies and immunological memory. Besides, these findings are important for news projects regarding the production of vaccines and deeper understanding of fish cell-mediated immunity.(AU)

A utilização de imunoestimulante é uma alternativa para melhorar o sistema imune de peixes e evitar o uso excessivo de antibióticos. O levamisol é um anti-helmíntico sintético que promove uma potente estimulação imunológica em peixes, aumentando variáveis inatas e adquiridas de defesa. A fim de avaliar os efeitos do levamisol sobre matrinxã, Brycon amazonicus, os peixes foram alimentados com 500 mg kg-1 de levamisol na dieta durante sete dias. Após este período os peixes foram submetidos à colheita de sangue. Variáveis imunes, tais como a atividade respiratória de leucócitos, proteína total sérica, albumina, globulina, índice albumina:globulina e os parâmetros hematológicos, tais como hematócrito, hemograma completo, hemoglobina, número de eritrócitos e o volume corpuscular médio dos eritrócitos foram avaliados. A utilização do levamisol aumentou a contagem dos leucócitos do sangue indicando que o imunoestimulante modulou a imunidade mediada por células, entretanto, nenhuma alteração foi observada nas demais variáveis. O aumento dos leucócitos do sangue indica que os peixes alimentados com levamisol estão em uma condição corporal melhor, e em um possível surto terão mais resistência às doenças e potencial para ativação da fagocitose e degranulação de neutrófilos. Além disso, os resultados são importantes para novos projetos sobre a produção de vacinas, e sobre a compreensão mais profunda da imunidade mediada por células em peixes.(AU)

Evaluation of thymic lymphocyte loss of broiler using Digital Analysis of the Lymphoid Depletion System (ADDL) / Avaliação de perda de linfócitos do timo em frangos usando análise digital do sistema de depleção linfóide (ADDL)

The thymus is a lymphoid organ and usually evaluated for the degree of lymphocyte loss with subjective histological techniques. This study aimed to adapt and to apply of the digital analysis of the lymphoid depletion system (ADDL) in the thymus in order to obtain a more accurate analysis. Glucocorticoid was used to induce immunosuppression in 55 broilers at 21 days of age; other 15 broilers were the control group. After euthanasia of the broilers, postmortem examination was made. Both thymic chains were collected and six lobes were selected for histological examination of the degree of lymphocyte depletion (scores 1 to 5) and for submission to all stages of processing by the ADDL system. The artificial constructed neural networks (ANN) obtained 94.03% of correct classifications. In conclusion, it was possible to adopt objective criteria to evaluate thymic lymphoid depletion with the ADDL system.(AU)

O timo é um órgão linfóide, que é normalmente avaliado para o grau de perda de linfócitos a partir de técnicas histológicas subjetivas. Este trabalho teve como objetivo a adaptação e aplicação do sistema de análise digital de depleção linfóide (ADDL) para o timo, a fim de tornar sua análise mais acurada. Glicocorticóides foram utilizados a fim de induzir imunossupressão em 55 aves de 21 dias de idade. Outras 15 aves formaram o grupo controle. Posteriormente, para cada um dos aves, realizou-se a eutanásia e necropsia. Ambas as cadeias do timo foram coletadas e foram selecionadas seis lóbulos para processamento histológico, análise quanto ao grau de depleção linfocitária (escores de 1-5) e submissão a todas as fases do processamento pelo sistema ADDL. Observou-se que a rede neural artificial (RNA) construída obteve 94,03% de classificações corretas. Em conclusão, foi possível adotar critérios objetivos para avaliar a depleção linfóide tímica utilizando o sistema ADDL.(AU)

Evaluation of thymic lymphocyte loss of broiler using Digital Analysis of the Lymphoid Depletion System (ADDL) / Avaliação de perda de linfócitos do timo em frangos usando análise digital do sistema de depleção linfóide (ADDL)

The thymus is a lymphoid organ and usually evaluated for the degree of lymphocyte loss with subjective histological techniques. This study aimed to adapt and to apply of the digital analysis of the lymphoid depletion system (ADDL) in the thymus in order to obtain a more accurate analysis. Glucocorticoid was used to induce immunosuppression in 55 broilers at 21 days of age; other 15 broilers were the control group. After euthanasia of the broilers, postmortem examination was made. Both thymic chains were collected and six lobes were selected for histological examination of the degree of lymphocyte depletion (scores 1 to 5) and for submission to all stages of processing by the ADDL system. The artificial constructed neural networks (ANN) obtained 94.03% of correct classifications. In conclusion, it was possible to adopt objective criteria to evaluate thymic lymphoid depletion with the ADDL system.(AU)

O timo é um órgão linfóide, que é normalmente avaliado para o grau de perda de linfócitos a partir de técnicas histológicas subjetivas. Este trabalho teve como objetivo a adaptação e aplicação do sistema de análise digital de depleção linfóide (ADDL) para o timo, a fim de tornar sua análise mais acurada. Glicocorticóides foram utilizados a fim de induzir imunossupressão em 55 aves de 21 dias de idade. Outras 15 aves formaram o grupo controle. Posteriormente, para cada um dos aves, realizou-se a eutanásia e necropsia. Ambas as cadeias do timo foram coletadas e foram selecionadas seis lóbulos para processamento histológico, análise quanto ao grau de depleção linfocitária (escores de 1-5) e submissão a todas as fases do processamento pelo sistema ADDL. Observou-se que a rede neural artificial (RNA) construída obteve 94,03% de classificações corretas. Em conclusão, foi possível adotar critérios objetivos para avaliar a depleção linfóide tímica utilizando o sistema ADDL.(AU)

Interação entre vacinas vivas atenuadas para coccidiose e compostos fitogênicos no desempenho de frangos de corte

A coccidiose aviária é considerada a parasitose de maior impacto na avicultura mundial, com um custo global estimado em 3 bilhões de dólares anuais, a doença causada pelos protozoários intracelulares do gênero Eimeria, destrói as células do epitélio intestinal gerando mortalidade e redução do desempenho. Nas últimas décadas, o uso de drogas anticoccidianas tem se mostrado eficiente no controle da doença, entretanto, o crescente surgimento de microrganismos resistentes, a pressão dos consumidores por alimentos isentos de resíduos e a criação de leis que proíbem o uso destas drogas em diversos países tornam necessário o desenvolvimento de novas estratégias de controle. Portanto, este estudo teve como objetivo determinar se as vacinas vivas associadas a compostos fitogênicos fornecidos via ração poderiam melhorar o desempenho, a saúde intestinal, os níveis de globulina e a ação coccidiostática em frangos de até 42 dias de idade, desafiados com Eimeria spp, em comparação com um programa anticoccidiano tradicional. Foram utilizadas 800 aves divididas em cinco tratamentos de oito repetições cada (n = 20): CN - Controle negativo (ausência de aditivos na ração e sem desafio de coccídio); CP - Controle positivo (ausência de aditivos e com desafio de coccídio aos 21 dias); PAA - Programa de aditivos anticoccidianos, incluindo salinomicina e nicarbazina, com desafio de coccidiano aos 21 dias de vida; VAC - Vacinação no dia 1 de vida (Hipracox HIPRA®) contra coccidiose e subsequente desafio com coccidiano aos 21 dias; VAC + BCF - Vacinação (dia 1 de vida), adição de 200 ppm do blend composto fitogênico (BCF) à base de carvacrol e cinamaldeido à dieta, com desafio de coccídio aos 21 dias de vida. As aves do grupo PAA ganharam peso mais significativo e maior peso corporal aos 21 dias do que os grupos CN e 42 dias de idade do que os grupos CN e VAC+BCF. A excreção de oocistos de Eimeria nas excretas das aves foi maior no CP do que no CN, assim como o CP teve contagens mais altas do que CN, PAA e VAC+BCF. Um maior escore médio de lesões intestinais para Eimeria acervulina foi observado em aves VAC e VAC+BCF, enquanto para Eimeria maxima, o maior escore foi encontrado em PC. Níveis séricos mais elevados de proteína total devido ao aumento das globulinas foram observados em aves de PAA e VAC do que CN. Nossos resultados sugerem que a vacinação para coccidiose logo após o nascimento dos pintinhos permite um desempenho semelhante ao programa convencional de controle da coccidiose via dieta.

Avian coccidiosis is considered the parasitic disease with the greatest impact on poultry worldwide, with an estimated global cost of 3 billion dollars annually, the disease caused by intracellular protozoa of the genus Eimeria, destroys the cells of the intestinal epithelium, generating mortality and reduced performance. In the last decades, the use of anticoccidial drugs has been shown to be effective in controlling the disease, however, the growing emergence of resistant microorganisms, the pressure of consumers for residue-free food and the creation of laws that prohibit the use of these drugs in several countries make it necessary to develop new control strategies. Therefore, this study aimed to determine whether live vaccines associated with phytogenic compounds supplied via feed could improve performance, intestinal health, globulin levels, and coccidiostatic action in broilers up to 42 days of age, challenged with Eimeria spp, compared with a traditional anticoccidial program. We used 800 birds divided into five treatments of eight repetitions each (n = 20): NC Negative control (absence of additives in the feed and without coccidian challenge); PC Positive control (absence of additives and with coccidian challenge at 21 days); AAP Anticoccidial additives program, including salinomycin and nicarbazine, with coccidian challenge at 21 days of life; VAC Vaccination on day 1 of life (Hipracox HIPRA®) against coccidiosis and subsequent coccidian challenge at 21 days; VAC+BPC - Vaccination (day 1 of life), the addition of 200 ppm of blend phytogenic compound (BPC) based on carvacrol and cinnamaldehyde to the diet, with coccidian challenge at 21 days of life. The birds in the AAP group more significant weight gain and greater body weight at 21 days than the NC and 42 days of age than the NC and VAC+BPC groups. The excretion of Eimeria oocysts in the excreta of birds was higher in PC than in NC, and in the litter, PC had higher counts than NC, AAP, and VAC+BPC. A higher mean score of intestinal lesions for Eimeria acervulina was observed in VAC and VAC+BPC birds, while for Eimeria maxima, the highest score was found in PC. Higher serum levels of total protein due to the increase in globulins were observed in birds of AAP and VAC than NC. Our findings suggest that vaccination for coccidiosis shortly after the birth of chicks allows performance similar to the conventional coccidiosis control program via diet.

Leukocytes respiratory burst activity as indicator of innate immunity of pacu Piaractus mesopotamicus / Atividade respiratória de leucócitos como indicador de imunidade inata de pacu (Piaractus mesopotamicus)

The present study evaluated the assay to quantify the respiratory burst activity of blood leukocytes of pacu as an indicator of the innate immune system, using the reduction of nitroblue tetrazolium (NBT) to formazan as a measure of the production of reactive oxygen species (ROS). In order to assess the accuracy of the assay, fish were challenged by Aeromonas hydrophila and sampled one week after challenge. The A. hydrophila infection increased the leukocyte respiratory burst activity. The protocol showed a reliable and easy assay, appropriate to determine the respiratory burst activity of blood leukocytes of pacu, a neotropical fish, in the present experimental conditions.(AU)

O presente estudo avaliou o ensaio para quantificar a atividade respiratória dos leucócitos do sangue de pacu como um indicador do sistema imune inato, usando a redução do nitroazul tetrazólio (NBT) a formazan como medida da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs). Para avaliar a precisão do ensaio, peixes foram desafiados por Aeromonas hydrophila e amostrados uma semana após o desafio. A infecção com A. hydrophila aumentou a atividade respiratória dos leucócitos. O protocolo se mostrou confiável e de fácil aplicação, apropriado para determinar a atividade respiratória de leucócitos do sangue do pacu, peixe neotropical, nas condições experimentais apresentadas.(AU)

Effects of levamisole hydrochloride on cellular immune response and flock performance of commercial broilers

Levamisole hydrochloride (Lev.HCl) has been acclaimed to boost immune response particularly in immunocompromised state. Its routine use as an immunomodulator in poultry production is yet to be well embraced, thus its effects of on cellular immunity and flock performance of commercial broilers were evaluated. One hundred and fifty Anak broiler chicks were separated into two groups of 75 each. Broilers in group 1 were sensitized with 150µg of Staphylococcus aureus antigen each at 4 and 5 weeks, while those in group 2 were not sensitized. Each group was further divided into subgroups A, B, and C. Levamisole hydrochloride (40 mg/kg) was administered orally to 1A and 2A at 45 and 46 days of age and to 1B and 2B at 47 and 48 days of age, while 1C and 2C were not treated. At 47 days of age, 12 broilers from all subgroups were challenged with 75µg of S. aureus antigen each at the right wattle. Wattle thickness was measured till 72 hours post challenge (pc) and delayed wattle reaction (DWR) was determined. Tissues were harvested at 72 hours pc for histopathology. Morbidity, mortality and live weights at 8 weeks of age were recorded. DWR peaked at 4 hours pc in 1A (2.22 ± 0.21 mm) and 1B (2.96 ± 0.21 mm) and 24 hours pc in 1C (3.39 ± 0.34 mm), the difference being significant (p<0.05). Inflammatory lesions were observed in wattles of sensitized subgroups and were more severe in 1C. Mortality rates were 4.17% and 29.17% in 1A and 1C respectively. Mean live weights in A and B i.e. 1.57± 0.06 kg and 1.56 ± 0.06 kg respectively, were significantly higher (p<0.0) than 1.43 ± 0.08 kg in C. Levamisole enhanced DTH via an early response, improved broiler liveability, and its anti-inflammatory property was confirmed.(AU)

Effects of levamisole hydrochloride on cellular immune response and flock performance of commercial broilers

Levamisole hydrochloride (Lev.HCl) has been acclaimed to boost immune response particularly in immunocompromised state. Its routine use as an immunomodulator in poultry production is yet to be well embraced, thus its effects of on cellular immunity and flock performance of commercial broilers were evaluated. One hundred and fifty Anak broiler chicks were separated into two groups of 75 each. Broilers in group 1 were sensitized with 150µg of Staphylococcus aureus antigen each at 4 and 5 weeks, while those in group 2 were not sensitized. Each group was further divided into subgroups A, B, and C. Levamisole hydrochloride (40 mg/kg) was administered orally to 1A and 2A at 45 and 46 days of age and to 1B and 2B at 47 and 48 days of age, while 1C and 2C were not treated. At 47 days of age, 12 broilers from all subgroups were challenged with 75µg of S. aureus antigen each at the right wattle. Wattle thickness was measured till 72 hours post challenge (pc) and delayed wattle reaction (DWR) was determined. Tissues were harvested at 72 hours pc for histopathology. Morbidity, mortality and live weights at 8 weeks of age were recorded. DWR peaked at 4 hours pc in 1A (2.22 ± 0.21 mm) and 1B (2.96 ± 0.21 mm) and 24 hours pc in 1C (3.39 ± 0.34 mm), the difference being significant (p 0.05). Inflammatory lesions were observed in wattles of sensitized subgroups and were more severe in 1C. Mortality rates were 4.17% and 29.17% in 1A and 1C respectively. Mean live weights in A and B i.e. 1.57± 0.06 kg and 1.56 ± 0.06 kg respectively, were significantly higher (p 0.0) than 1.43 ± 0.08 kg in C. Levamisole enhanced DTH via an early response, improved broiler liveability, and its anti-inflammatory property was confirmed.

Produção de óxido nítrico em células CD14+ do sangue periférico e baço de cães com leishmaniose visceral

Os cães são o principal hospedeiro-reservatório para a leishmaniose visceral (LV) zoonótica, uma doença vetorial causada por Leishmania infantum. O óxido nítrico (NO) é a principal molécula envolvida na morte do parasita Leishmania, porém não foi quantificada intracelularmente nos macrófagos, e o seu papel na indução da apoptose celular desencadeada na resposta imune contra Leishmania não está esclarecido. Nós quantificamos a frequência de células produtoras de NO e sua concentração no sangue periférico, e em macrófagos do baço de cães sintomáticos com LV. Também avaliamos se o óxido nítrico tem correlação com a carga parasitária e a apoptose no baço. Nos cães com LV foi observado maior porcentagem de células produzindo óxido nítrico no sangue e baço do que a observada nos cães do grupo controle. A porcentagem de células CD14+ e CD14/NO do sangue e baço foi maior nos cães infectados que nos controles saudáveis. As taxas de apoptose tardia também se encontraram aumentadas no sangue e baço dos cães infectados em relação aos controles saudáveis. A porcentagem de células produtoras de NO do baço apresentou uma correlação positiva com a carga parasitária. Não foi observada uma correlação com a produção de NO e a apoptose no sangue e baço dos cães infectados, sugerindo que outros mecanismos efetores devem estar atuando na apoptose. As taxas de apoptose elevadas das células produtoras de NO do sangue periférico e no baço estão afetando a sua produção, favorecendo o aumento da carga parasitária e a evolução da infecção.

Dogs are the main reservoir host for visceral leishmaniasis (VL) Zoonotic, a vector disease caused by Leishmania infantum. Nitric oxide (NO) is the main molecule involved in the death of the parasite Leishmania, however it was not quantified intracellularly in macrophages and their role in induction of apoptosis triggered the immune response against Leishmania is unclear. We quantified the frequency of cells producing NO and its levels in the peripheral blood, spleen and macrophages in symptomatic dogs with VL evaluate whether nitric oxide is correlated with the parasite load in spleen and apoptosis. In dogs with LV was higher percentage of cells observed producing nitric oxide in the blood and spleen than that observed in the control group dogs. The percenta ge of CD14 + and CD14/NO blood and spleen was higher in infected dogs than in healthy controls. The late apoptosis rates are also increased in the blood and spleens of infected dogs compared to healthy controls. The percentage of cells producing NO spleen showed a positive correlation with the parasite load. There is a correlation with the production of NO and apoptosis in the blood and spleens of infected dogs was observed, suggesting that other mechanisms may be acting effectors of apoptosis. The high rates of apoptosis in cells producing NO peripheral blood and spleen are affecting their production, favoring increased parasite load and development of infection.

IMMUNOMODULATION WITH -GLUCAN IN MATRINXÃ (BRYCON AMAZONICUS)

Este estudo foi feito por meio de três experimentos e é apresentado em seis capítulos. No primeiro, apresentamos uma introdução geral sobre o tema da tese e no último as considerações finais. Os capítulos restantes foram escritos como artigos científicos. No primeiro experimento, foi avaliada a resposta imune inata de juvenis de matrinxã Brycon amazonicus alimentados com duas concentrações de -glucano (-G) derivado de S. cerevisiae (0,5% e 1,0%) durante 10 dias. Depois da alimentação, os peixes foram infectados experimentalmente com injeção intraperitoneal (IP) de A. hydrophila. Os peixes foram amostrados antes e 6 h após a infecção (hpi). Os resultados mostraram que o -G (0,5%) aumentou os níveis de cortisol sérico e da lisozima antes da infecção e modulou algumas proteínas de fase aguda na resposta imune do matrinxã. Além disso, observamos que 1,0% de -G na dieta provocou exaustão da resposta imune inata e pode ser prejudicial para a saúde de peixes. O segundo experimento avaliou a inclusão de duas gerações de -G na dieta, com diferentes níveis de pureza: MacroGard (-G 1° 71% puro) e uma nova geração do produto "R&D -glucano" (-G 2° 62% puro). Os peixes foram alimentados por 15 dias com 0,1% de cada tipo de -G e depois desafiados com injeção IP de A. hydrophila. Os peixes foram amostrados antes, 6, 24, e 72 hpi. Com os dados deste experimento foram escritos os capítulos 3 e 4. Os resultados mostraram que o -G 2 ° foi mais eficiente para estimular a resposta humoral e celular do sistema imune inato. No entanto, ambas as gerações de -G aumentaram o cortisol pré-infecção os níveis séricos de lisozima, e o número de neutrófilos e monócitos circulantes. A utilização do -G 2 ° modulou o perfil de proteínas de soro durante a infecção bacteriana. No terceiro experimento, avaliamos o papel do cortisol na ação imunestimulante do -glucano. Neste sentido, peixes foram alimentados por 15 dias com dietas que continham Macrogard -G (0,1%) ou -G (0,1%) + metirapona (MTP). A MTP foi usada para bloquear a produção do cortisol. Em seguida, os peixes foram submetidos a 3 min de exposição aérea como estressor agudo e logo após desafiados com A. hydrophila. Os peixes foram amostrados antes do estresse, 30 min após a exposição ao estressor e 24 hpi. Os resultados mostraram que o -G modulou o perfil de cortisol antes e depois da resposta de estresse e aumentou o número e a atividade dos leucócitos. Observamos um forte efeito modulador do cortisol nos mecanismos humorais e celulares da imunidade inata do matrinxã, pois aumentou os níveis de lisozima e a atividade do sistema complemento, bem como as populações de neutrófilos e monócitos. O nosso resultado sugere que o aumento do cortisol induzido pelo -G é um importante mecanismo para melhorar a resposta imune inata promovida por -G em matrinxã. Finalmente, nós propomos um protocolo de imunestimulação para juvenis de matrinxã pela suplementação com o -G de S. cerevisiae fornecido dias antes das práticas de manejo estressantes. Este protocolo visa reforçar os mecanismos de defesa immune, reduzir surtos de doenças e aumentar a resistência dos peixes, gerando um produto nutricional de alta qualidade e segurança.

This study was performed through three experiments and is presented in six chapters. In the first, we present a general introduction on the subject of the thesis and in the last chapter we present the final considerations and thesis conclusions. The other four chapters were written as scientific papers to be submitted to specialized journals. In the first experiment, we tested the innate immune response of juvenile matrinxã Brycon amazonicus fed with two concentrations of -glucan (-G) derived from Saccharomyces cerevisiae (0.5% and 1.0%) during 10 days. After feeding, we experimentally infected the fish with an intraperitoneal (IP) injection of Aeromonas hydrophila and sampled the animals prior to and 6 h post infection (hpi). The results showed that -glucan (0.5%) improved the pre-infection cortisol and lysozyme serum levels and modulated some acute phase proteins on the acute phase response of fish. In addition, we observed that -glucan (1.0%) led to the exhaustion of innate immune response and can be detrimental to health of fish. In the second experiment, we evaluated two generations of -glucan, with different levels of purity: MacroGard (-G 1° 71% pure) and a new generation R&D -glucan (-G 2° 62% pure). Two groups of fish were supplemented during 15 days with 0.1% of respective generations of -glucan and at the end of trial fish were challenged with IP injection of A. hydrophila. Fish were sampled prior to, 6, 24, and 72 hpi. Data from this experiment is presented in chapters 3 and 4 of this thesis. The results showed that -G 2° was more efficient to stimulate both humoral and cellular innate immune responses in fish. However, both -glucan generations showed an ability to increase pre-infection cortisol and lysozyme serum levels as well as increase the number of circulating neutrophils and monocytes. In addition, the use of -G 2° was observed to modulate the serum protein profile during acute phase response by bacterial infection of fish. In the third experiment, we discussed the role of serum cortisol levels on the immunostimulant effect of -glucan. To this end, we fed fish during 15 days with diets containing -glucan 0.1% only (-G) or -glucan 0.1% + metyrapone 30mg kg-1 fish (-G+MTP). Dietary MTP was used to block the cortisol production. The fish were then submitted to 3 min of air exposure as an acute stressor and, following that, challenged with an IP injection of A. hydrophila. Fish were sampled prior to stress conditions, 30 min after stressor exposure and 24 hpi. The results showed that -G modulated the cortisol profile prior to and after stress response, and increased both the number and activity of leukocytes. Furthermore, cortisol was shown to be a strong modulator of both humoral and cellular innate immune mechanisms, since it increased the lysozyme and complement activity as well as the neutrophils and monocytes populations. Our results suggest that -glucan-induced cortisol level is one important mechanism to improve the innate immune response to -glucans in matrinxã. Finally, we propose a protocol of immunestimulation for juvenile matrinxã. The addition of -glucan derived from the cell wall of Saccharomyces cerevisiae can be offered to the fish before management practices. The proposed protocol aims to strengthen fish defense mechanisms, reduce disease outbreak and enhance fish resistance, generating a nutritional product of high quality and safety.

Estudo prospectivo sobre a dinâmica da evolução clínica e imunológica da infecção canina por Leishmania (Leishmania) infantum chagasi em área endêmica de leishmaniose visceral no estado do Pará

Leishmaniose visceral canina (LVC) é um dos problemas de saúde pública mais importantes da América Latina, pois geralmente precede a doença humana, a leishmaniose visceral americana (LVA), causada pela Leishmania (L.) infantum chagasi. No presente estudo prospectivo analisou-se durante período de dois anos a prevalência, incidência e dinâmica da evolução clínico-imunológica da infecção canina pela L. (L.) i. chagasi em uma coorte de 316 cães mestiços que vivem em área endêmica de LVA no município de Barcarena, Pará, Amazônia Brasil, pelo uso combinado do teste de imunofluorescência indireta (RIFI-IgG) e de hipersensibilidade tardia (RIM), bem como a pesquisa do parasita pela aspiração do linfonodo poplíteo para o diagnóstico da infecção. A reatividade para RIFI e RIM reconheceu três diferentes perfis de resposta imunológica: (I) RIFI (+) / RIM (-) (81 cães), (II) RIFI (-) / RIM (+) (17 cães), e (III) RIFI (+) / RIM (+) (13 cães), proporcionando uma prevalência global da infecção de 35,1% (111/316). Desta forma, a prevalência específica do perfil I (25,6%) foi superior as dos perfis II e III, 5,4% e 4,1%, respectivamente. Além disso, a frequência destes perfis entre 111 cães infectados mostrou que a taxa de 73% do perfil I também foi maior do que os dos perfis II (15,3%) e III (11,7%). A prevalência da infecção de acordo com as faixas etárias revelou que a taxa de 27,5% do grupo 1ano <7 anos foi maior do que as de <1 ano (5,3%) e 7anos (2,2%), respectivamente. Por outro lado, a incidência global da infecção foi de 5,7% cães / mês (5,4% perfil I, 0,3% perfil II e 0,0% perfil III). No entanto, observou-se uma progressiva diminuição nas taxas de incidência nos seguintes pontos de tempo: seis (3,6% cães / mês), doze (1,7% cães / mês) e vinte e quatro (0,4% cães / mês) meses do estudo. Além disso, a incidência da infecção de acordo com os grupos etários demonstraram que a taxa de 6,6% cães / mês no grupo <1 ano foi maior em comparação com as de 5,3% e 3,3% cães / mês nos grupos 1ano e <7 anos, e <1 ano, respectivamente. O diagnóstico parasitológico da infecção foi confirmado em 19% (21/111) no estudo da prevalência, sendo a maioria dos cães (85,7%) do perfil I, onde 61,1% eram sintomáticos e 38,9% assintomáticos. Entre o restante (14,3%), o diagnóstico foi associado ao perfil III, sendo 66,6% assintomáticos e 33,3% sintomáticos. No levantamento da incidência, o diagnóstico foi confirmado em 11% dos cães, todos pertencentes ao perfil I, sendo 60% assintomáticos e 40% sintomáticos. Com relação ao estado clínico de todos os 179 cães diagnosticados infectados durante o período de dois anos, observou-se que entre 145 (81%) cães do perfil I, 82% eram assintomáticos e 18% sintomáticos; entre os 21 (11,7%) cães do perfil II, todos (100%) eram assintomáticos; e entre 13 (7,3%) cães do perfil III, 84,6% eram assintomáticos e 15,4% sintomáticos. Além disso, observou-se que a conversão do estado clínico assintomático ao sintomática foi registado principalmente em cães do perfil I (40,2%) do que aqueles dos perfis II (5,8%) e III (9%). Por outro lado, apenas 3,2% dos cães do perfil I [RIFI (+) / RIM (-)] converteu resposta RIM (+), enquanto 80% de cães do perfil II [RIFI (-) / RIM (+)] converteu resposta RIFI (+). Por fim, demonstrou-se que 100% dos óbitos por LVC ocorreu entre os cães do perfil I, sendo 85,7% na prevalência e 14,3% na incidência. Considerando todos esses resultados, parece razoável que a interação entre parasita e resposta imune canina é suportada principalmente pelo perfil imunológico claramente vulnerável, o perfil I [RIFI (+) / RIM (-)], o qual não oferece qualquer resistência ao parasita, tornando o cão altamente susceptível à infecção

Canine visceral leishmaniasis (CVL) is one of the most important public health problems in Latin America because it usually precedes human disease, American visceral leishmaniais (AVL), being caused by Leishmania (L.) infantum chagasi. In the present prospective study it was analyzed during two years period the prevalence, incidence and dynamics of the clinical-immunological evolution of canine L. (L.) i. chagasi-infection in a cohort of 316 mongrel dogs living in endemic area of AVL in Barcarena municipality, Pará State, Amazonian Brazil, by the combined use of the indirect fluorescence antibody test (IFAT-IgG) and delayed-type hypersensitivity (DTH), as well as the parasite research by the popliteal lymph node aspiration for the diagnosis of infection. The IFAT and DTH reactivity recognized three different immune response profiles: (I) IFAT(+)/DTH(-) (81 dogs), (II) IFAT(-)/DTH(+) (17 dogs), and (III) IFAT(+)/DTH(+) (13 dogs), providing an overall infection prevalence of 35,1% (111/316). In this way, the specific prevalence of profile I 25,6% was higher than those of profiles II 5,4% and III 4,1%. Moreover, the frequency of these profiles among 111 infected dogs showed that the rate 73% of profile I was also higher than those of profiles II 15,3% and III 11,7%. The infection prevalence according to the age groups revealed that the rate 27,5% of 1year <7years was higher than those of <1year 5,3% and 7years 2,2%, respectively. On the other hand, the overall incidence of infection was 5,7% dogs/month (5,4% profile I, 0,3% profile II and 0,0% profile III). However, it was noted a progressive decreasing in the incidence rates at the following time-points: six (3,6% dogs/month), twelve (1,7% dogs/month) and twenty four (0,4% dogs/month) months of the study. In addition, the infection incidence according to the age groups demonstrated that the rate 6,6% dogs/month of <1year was higher compared to those of 5,3% and 3,3% dogs/month of 1year and <7years, and <1year, respectively. The parasitological diagnosis of infection was confirmed in 19% (21/111) at the prevalence survey, being most dogs (85,7%) of the profile I, 61,1% symptomatic and 38,9% asymptomatic ones. Among the remainder 14,3%, the diagnosis was associated to the profile III, 66,6% in asymptomatic and 33,3% in symptomatic dogs. At the incidence survey, the diagnosis was confirmed in 11% of dogs, all from the profile I, 60% asymptomatic and 40% symptomatic ones. With regards to clinical status of all 179 infected dogs diagnosed during two years period, it was observed that among 145 (81%) dogs from the profile I, 82% were asymptomatic and 18% symptomatic ones; among 21 (11,7%) from the profile II, all (100%) were asymptomatic; and among 13 (7,3%) from the profile III, 84,6% were asymptomatic and 15,4 % symptomatic ones. Besides this, it was noted that the clinical conversion from asymptomatic to symptomatic status was principally recorded in dogs from the profile I (40,2%) than those from the profiles II (5,8%) and III (9%). By the other side, only 3,2% dogs from the profile I [IFAT(+)/DTH(-)] converted DTH(+) response, while 80% dogs from the profile II [IFAT(-)/DTH(+)] converted IFAT(+) response. At last, it was demonstrated that 100% of death by CVL occurred amongst dogs from the profile I, being 85,7% from the prevalence and 14,3% from the incidence. Taking together all these results, it seems reasonable that interaction between parasite and canine immune response is principally supported by immunologic profile clearly vulnerable, the profile I [IFAT(+)/DTH(-)], which does not offer any resistance to parasite, became the dog highly susceptible to infection

Influência da imunidade de matrizes suinas na resposta à vacinação de leitões contra mycoplasma hyopneumoniae

A suinocultura está amplamente difundida no Brasil, o quarto maior produtor mundial de carne suína. Seu efetivo está concentrado em maior parte na região Sul, com 48,8% dos suínos. Porém, a intensificação e o confinamento das criações expõem os animais a agentes patogênicos, como o Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo), causador da Pneumonia Enzoótica Suína (PES). A doença é caracterizada pela ocorrência de tosse seca não produtiva e lesões pulmonares de consolidação, denominadas hepatização. A vacinação de leitões é uma importante ferramenta empregada no controle da PES. Contudo, é relatado que a imunidade passiva adquirida pelos leitões através do colostro das matrizes suínas pode interferir na sua resposta à vacinação contra o Mhyo. Desta forma, este trabalho teve como objetivo avaliar a influência da imunidade materna na resposta à imunização de leitões contra Mhyo ao desmame. Dez matrizes foram divididas em dois grupos baseado na Razão S/P de um teste ELISA comercial , um com baixo nível de anticorpos (Ac) anti-Mhyo (BAc, Razão S/P <0,75) e outro com alto nível (AAc, Razão S/P 0,75). De cada fêmea, dois leitões eram controles (contr) e nove vacinados (vac) contra Mhyo. Estes grupos e tratamentos foram comparados entre si quanto a parâmetros de imunidade humoral, celular e comprometimento pulmonar ao abate. Após a ingestão de colostro, os leitões das fêmeas AAc mantiveram os maiores níveis de Ac, até os 56 dias de idade. Quando avaliados através do teste ELISA, dos 13 aos 99 dias depois de vacinados os leitões BAc-vac apresentaram níveis de Ac mais estáveis, com um aumento significativo aos 113 dias pós-vacinação. Os parâmetros celulares não diferiram entre grupos e tratamentos, com exceção dos linfócitos T CD4 + CD8 +, com menores percentuais entre os vacinados. Independente do grupo, os vacinados tiveram menor comprometimento pulmonar, porém os BAc-vac tiveram menos lesões que os AAc-vac. Os resultados demonstraram que a vacinação dos leitões contra Mhyo ao desmame os protege contra o agente, levando ao menor comprometimento pulmonar, principalmente quando a imunização ocorre na presença de baixos níveis de Ac passivos.

Swine production is widespread in Brazil, being the fourth largest producer of pork meat. Swinesare concentrated in the Southern region, comprising 48.8%of pig population. However, due to confinement system, pigs are exposed to pathogens such as the bacteria Mycoplasma hyopneumoniae (Mhyo), responsible for swine enzootic pneumonia (SEP). The disease is characterized by a dry, nonproductive cough, and macroscopic areas of consolidation in the lung. The piglet vaccination is an important practice to SEP control. However, it is reported that passive immunity acquired by the piglets through the colostrum of sows may affect their response to vaccination against Mhyo. The objective of this study was to evaluate the influence of maternal immunity in the pig vaccination against Mhyo after weaning. Ten sows were divide in two groups according with the ELISAs S/P Ratio, with low (LAb, S/P Ratio <0.75) or high (HAb, S/P Ratio 0.75) level of antibodies (Ab). From each sow, two piglets were controls (contr) and nine vaccinated (vac) against Mhyo. Piglets' humoral and cellular immunity and pulmonary lesions were compared between the treatments and groups of sows.The Ab level after colostrum intake was higher in piglets from HAb group of sows until 56 days of age. When evaluated by ELISA, LAb-vac piglets showed a more stable Ab levels from 13 to 99 days post-vaccination, with a significant increase at 113 days post-vaccination. No differences were detected between groups and treatments according with cellular parameters, except T CD4 + CD8+ lymphocytes percentages, that were lower in vaccinated piglets. Regardless of the group, vaccinated pigs had lower pulmonary lesions, but the LAb-vac piglets had less damage than the HAb-vac. These results demonstrated that piglet vaccination against Mhyo at weaning protects them against the pathogen and provides lower pulmonary lesions, especially when the immunization occurs in the presence of low levels of maternal Ab

Suplementaçãoenergética e de aminoácidos glicogênicos para leitões lactentes

Seis experimentos foram conduzidos com o objetivo de estudar o efeito de fontes de energia no desempenho, resposta imune e morfologia intestinal de leitões recém-nascidos. Osestudos foram divididos em duas etapas. Na primeira, por meio do fornecimento de níveis de óleo de arroz (OA) foi determinada a quantidade de energia suplementar necessária para leitões nos primeiros dias de vida. A partir dos resultados obtidos foi realizado um experimento com o fornecimento de OA viaoral e via ração pré- inical para leitões na maternidade. Os leitões que receberam OA via oral apresentaram maior peso ao desmame (P = 0,101). Enquanto os leitões suplementados com OA via ração pré-inicialapresentaram maior consumo de ração (P = 0,08). Com base nos resultados dos experimentos anteriores foram calculadas as doses utilizadas no experimento seguinte, em que cada recém-nascido dentro da leitegada foi aleatoriamente designado para um dos sete tratamentos: C- controle (sem suplementação); OAE- 2 mL de OA enriquecido com omega-3; GP- 2,33 mL de glicerina pura; OS- 1,3 mL de óleo de soja; OL- 1,4 mL de óleo de linhaça; GC- 1,68 mL de gordura de coco; OA- 2 mL de OA. Para análise do desempenho foram utilizados dois conjuntos de dados: todos os animais (± 1,479kg peso corporal; PC) ou apenas os leitões de menor peso (< 1,250kg de PC ao nascer). Os leitões de menor peso alimentados com gordura de coco tiveram aumento no PC (P = 0,099) aos sete dias e ganho de peso (GP, P = 0,104) donascimento aos7 dias de vida. Já as concentrações de triglicerídeos no soro foram maiores (P < 0,0001) nos anima is suplementados com glicerina. Na segunda etapa do estudo, foram realizados três experimentos em que os leitões foram suplementados via sonda comos seguintes aminoácidos: glutamina (Gln), glutamato (Glu), arginina (Arg) e AminoGut (Amg; Gln + Glu). No experimento (exp.) 1, a suplementação de Amg aumentou (P = 0,088) a resposta imune celular emleitões recém-nascidos. Os níveis de ureia no soro foram maioresnos leitões suplementados com aminoácidos (P < 0,001) em comparação ao grupo controle. A concentração sérica de alanina transaminase (ALT) foi menor (P = 0,042) em suínos que receberam Glu, quando comparados aos animais suplementados com Amg e grupo controle. No exp. 2, leitões alimentados com Glu apresentaram menor PC aos sete dias comparados aos animais recebendo Amg e ao grupo controle. Ao desmame, a suplementação com Glu promoveu menor PC e GP comparados ao grupo controle. No mesmo experimento, os níveis de triglicerídeos no sangue foram reduzidos (P = 0,018) em leitões recebendo aminoácidos. Noexp. 3, leitões alimentados com Arg apresentaram menor PC e GP no sétimo diae ao desmame comparados aos animais recebendo Glu, Amg e grupo controle.Em todos os estudos foi realizada análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey. Em conclusão, a suplementação de duas doses contendo 1mL de OA logo após o nascimento melhora o peso ao desmame e a suplementação de 2% de OA na dieta pré inical aumenta o consumo de ração. Assim como a gordura de cocomelhora o desempenho de leitões de baixo peso, sem alterar a imunidade ou morfologia intestinal. Com relação aos aminoácidos, Amg melhora a resposta imune celular, porém sem alterar desempenho e citocinas pró-inflamatórias.

In order to study the effects of different energy sources supplementation on performance, immune system, and gut morphology of newborn piglets six experiments were conducted. The studies were divided in two parts. In the first part,three studies were carried out. In the experiment (Exp.) 1, piglets received different levels of rice oil (RBO) to determine the amount of energy supply required for the first twodays of life. In Exp. 2, piglets were fed RBO orally or by pre-starter feed. Piglets receiving RBO orally enhanced BW at weaning (P = 0.101), whereas piglets fed RBO by pre-starter feed had a higher feed intake (P = 0.08), compared to control group.Based on the achieved results, doses for the next study were calculated. In Exp. 3, each neonatal within a litter was randomly assigned to one of the seven treatments: C- control (no supplementation); RBOE- 2 ml of rice bran oil (RBO) enriched with Omega-3 fat acids; PG- 2.33 ml of pure glycerin; SO- 1.3 ml of soybean oil; LO- 1.4 ml of linseed oil; CO- 1.68 ml of coconut oil; RBO- 2 ml of RBO. Animal performance was analyzed using two data sets: all data (± 1.479 kg initial body weight; BW), and low birthweight piglet data (< 1.250 kg initial BW). Low birth weight piglets fed coconut oil showed an increased BW (P = 0.099) and body weight gain (P = 0.104; BWG) fromzero to 7 days of life. Piglets fed glycerin had a higher (P < 0.0001) triglycerides concentration. In the second part of the study, three experiments were carried out, and the newborn pigs received by gastric tube one of the following: glutamine (Gln), glutamate (Glu), arginine (Arg), and AminoGut (Amg; Gln + Glu). In the first experiment, the Amg supplementation increased cellular immune response (P = 0.088) and urea concentration (P < 0.001)in animals fed amino acids compared to control group. Piglets receiving Glu had lower alanine transaminase (ALT) concentration (P = 0.042) compared to Amg and control group. In the exp. 2, piglets fed Glu showed a lower BW on day 7compared to piglets receiving Amg and control group. At weaning, the Glu group presented lower BW and BWG compared to control group. Triglycerides levels were significantly reduced (P = 0.018) in pigs supplemented with amino acids. In the exp. 3, Arg supplementation reduced BW and BWG on day 7 and at weaning compared to piglets receiving Glu, Amg, and control group. Analysis of variance was conducted in all studies and the means were compared by Tukey test. In conclusion, theaddition of two doses containing 1 mL of OA may improve BWat weaning. Likewise, 2% of OA supplementation in the pre-started diet may increased feed intake. As well as, coconut oil supplementation may enhance the performance of low birth piglets weight, with no effect on immunity system and gut morphology. Amg might improve the cellular immune response, although without changing the humoral immune response and performance.

Expressão gênica de interferon-gama, fator de necrose tumoral alfa e interleucinas 2 e 5 no baço de gatos naturalmente infectados por Leishmania spp.

Considerando-se a complexidade envolvida na resposta imune frente à infecção por Le ishma n ia spp. nas diferentes espécies e a ausência de alterações clínicas na maioria dos gatos com leishmaniose visceral, o presente estudo teve como objetivos avaliar a expressão gênica de citocinas envolvidas na resposta imune celular (IFN- , TNF-, IL-2) e humoral (IL-5) por PCR em tempo real em amostras de baço de 12 gatos naturalmente infectados por L e ishma n ia spp., comparando-as à expressão gênica de quatro gatos saudáveis; e verificar a correlação entre a carga parasitária na medula óssea e a expressão gênica das citocinas no baço dos animais infectados. Nos gatos infectados observou-se aumento de 1,53 vezes na expressão gênica de IFN- quando comparada ao grupo de animais hígidos (p=0,0005). Não foi verificada diferença estatisticamente significante na expressão gênica das demais citocinas avaliadas entre gatos infectados e hígidos (TNF- p=0,4203, IL-2 p=0,1968, IL-5 p=0,6390). Não foi observada correlação entre a carga parasitária na medula óssea e a expressão gênica das citocinas no baço dos gatos infectados por Le ishma n ia spp. (IFN- p = 0,1570; TNF- p = 0,5702; IL-2 p = 0,6081; IL-5 p = 0,2329). Estes resultados sugerem que o IFN- possa exercer papel relevante nos mecanismos de proteção contra a leishmaniose felina.

Considering the complexity of the immune response against L e ishma n ia spp. infection in different species and the lack of clinical signs in the majority of cats with visceral leishmaniasis, this study aimed to evaluate the gene expression of some cytokines involved in cellular (IFN- , TNF , IL-2) and humoral (IL-5) immune response by real-time PCR, on spleen samples from 12 cats naturally infected by L e ishma n ia spp., comparing to the immune response of four healthy cats; and to verify the correlation between the parasite load in the bone marrow and the gene expression of cytokines in the spleen of infected animals. An increase of 1.53 times in IFN- gene expression was observed in infected cats when compared to healthy cats (p=0.0005). Statistically significant differences were not observed in gene expression of the cytokines evaluated between infected and healthy cats (TNF- p=0.4203, IL-2 p=0.1968, IL-5 p=0.6390). Correlation was not observed between the parasite load in the bone marrow and the gene expression of cytokines in the spleen of cats infected by L e ishma n ia spp. (IFN- p = 0.1570; TNF- p = 0.5702; IL-2 p = 0.6081; IL-5 p = 0.2329). These results suggest that IFN- may play an important role in the protective mechanisms against feline leishmaniasis.

Avaliação da imunidade celular na pele de cães naturalmente infectados com Leishmania (Leishmania) infantum chagasi e sua correlação com transmissibilidade ao vetor / Evaluation of cellular immunity in the skin of naturally infected dogs with Leishmania (Leishmania) infantum chagasi and its relationship with the vector transmissibility

Foram selecionados aleatoriamente 38 cães naturalmente infectados por Leishmania (Leishmania) infantum chagasi oriundos de Araçatuba, São Paulo, área endêmica para leishmaniose visceral, e os quais foram distribuídos em dois grupos: o primeiro com 24 cães sintomáticos e, o outro, composto por 14 animais assintomáticos. Correlacionou-se a caracterização clínica (assintomáticos ou sintomáticos) com os: potencial em infectar o inseto vetor, padrão inflamatório da pele, perfil de imunidade celular e parasitismo tegumentar desses cães. Quanto ao número de formas amastigotas/mm2 no tegumento, não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos (p = 0,1584), sendo que a densidade de parasitos na pele mostrou uma correlação positiva moderada com os títulos de anticorpos anti-Leishmania (p = 0,042). Quanto à infectividade ao vetor, evidenciada pelo xenodiagnóstico, 16 (66,7%) cães sintomáticos e 13 (93%) assintomáticos foram capazes em transmitir Leishmania aos flebotomíneos, dentre estes, respectivamente, seis (37,5%) e oito (61,5%) animais não apresentavam parasitismo cutâneo, embora todos, de ambos os grupos, tenham sido positivos quando da pesquisa de parasitos no linfonodo poplíteo. Observou-se um maior percentual de transmissibilidade para o vetor a partir de cães assintomáticos (p = 0,0494). As alterações histológicas cutâneas foram similares em ambos os grupos e se caracterizaram, de modo geral, por um infiltrado inflamatório, ora focal ora difuso, na derme, constituído, principalmente, por células mononucleares (macrófagos, linfócitos e plasmócitos), variando de discreto a intenso. Quanto à caracterização da resposta imune celular no tegumento dos animais, somente a densidade (células/mm2) de células iNOS+ foi significantemente maior na derme dos cães sintomáticos quando comparado aos assintomáticos (p = 0,0368). Observou-se correlação positiva moderada entre a densidade de parasitos na pele e a densidade de macrófagos (p = 0,031), de células T CD4+ (p = 0,015) e CD8+ (p = 0,023), e, também, naquela de células iNOS+ relativamente a de células T CD3+ (p = 0,005), CD4+ (p = 0,001) e CD8+ (p = 0,0001). Verificou-se, ainda, correlação negativa moderada com o número de manifestações clínicas e/ou gravidade da enfermidade (p = 0,028), confirmando, assim, maior transmissibilidade de parasitos ao vetor, a partir de animais assintomáticos, demonstrando-se, dessa forma, que tais cães são fontes de infecção em potencial para insetos vetores em áreas endêmicas para leishmaniose visceral canina.

Thirty-eight dogs naturally infected by Leishmania (Leishmania) infantum chagasi were randomly selected from Araçatuba of São Paulo state (Brazil), an endemic area for visceral leishmaniasis. The subjects were distributed into two groups: the first comprising 24 symptomatic dogs and the second consisting of 14 asymptomatic dogs. Possible correlations of clinical characterization (in both symptomatic and asymptomatic subjects) with potential to infect the insect vector, skin inflammatory pattern, cutaneous cellular immunity profile and cutaneous parasitism were investigated. Regarding to the number of cutaneous leishmania amastigotes/mm2, there was not a significant difference between the groups (p = 0.1584); density of skin parasites showed a moderate positive correlation with anti-Leishmania antibody titers (p = 0.042). Concerning to the infectivity to the insect vector, as evidenced by xenodiagnosis, 16 (66.7%) symptomatic and 13 (93%) asymptomatic dogs were able to transmit Leishmania to phlebotomines. Among these, six (37.5%) and eight (61.5%) dogs, respectivelly, did not show cutaneous parasitism, although all participant dogs were found positive when searching for parasites in the popliteal lymph nodes. Asymptomatic dogs showed higher transmissibility to the vector than symptomatic ones (p = 0.0494). Histological features in the skin were similar in both groups and were generally characterized by an inflammatory infiltrate, either diffuse or focal, in the dermis, mainly consisted of mononuclear cells (macrophages, lymphocytes and plasma cells), varying from mild to intense. Concerning characterization of the cutaneous cellular immune response, only iNOS+ cells density (cells/mm2) was significantly higher in the dermis of the symptomatic dogs compared to the asymptomatic ones (p = 0.0368). Moderate positive correlation between the cutaneous parasites density and the macrophages density (p = 0.031), the CD4+ T cells (p = 0.015) and CD8+ T cells (p = 0.023) were observed. Furthermore, density of iNOS+ cells in relation to CD3+ T cells (p = 0.005), CD4+ T cells (p = 0.001) and CD8+ T cells (p = 0.0001) were found positively correlated at a moderate level. It was also found a moderate negative correlation between cutaneous parasites density and the number of clinical signs and/or disease severity (p = 0.028), confirming grater parasites transmission to the vector from asymptomatic animals. It was therefore demonstrated that these dogs are potential sources of infection to insect vectors in endemic areas for canine visceral leishmaniasis.

Avaliação da imunidade celular na pele de cães naturalmente infectados com Leishmania (Leishmania) infantum chagasi e sua correlação com transmissibilidade ao vetor / Evaluation of cellular immunity in the skin of naturally infected dogs with Leishmania (Leishmania) infantum chagasi and its relationship with the vector transmissibility

Foram selecionados aleatoriamente 38 cães naturalmente infectados por Leishmania (Leishmania) infantum chagasi oriundos de Araçatuba, São Paulo, área endêmica para leishmaniose visceral, e os quais foram distribuídos em dois grupos: o primeiro com 24 cães sintomáticos e, o outro, composto por 14 animais assintomáticos. Correlacionou-se a caracterização clínica (assintomáticos ou sintomáticos) com os: potencial em infectar o inseto vetor, padrão inflamatório da pele, perfil de imunidade celular e parasitismo tegumentar desses cães. Quanto ao número de formas amastigotas/mm2 no tegumento, não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos (p = 0,1584), sendo que a densidade de parasitos na pele mostrou uma correlação positiva moderada com os títulos de anticorpos anti-Leishmania (p = 0,042). Quanto à infectividade ao vetor, evidenciada pelo xenodiagnóstico, 16 (66,7%) cães sintomáticos e 13 (93%) assintomáticos foram capazes em transmitir Leishmania aos flebotomíneos, dentre estes, respectivamente, seis (37,5%) e oito (61,5%) animais não apresentavam parasitismo cutâneo, embora todos, de ambos os grupos, tenham sido positivos quando da pesquisa de parasitos no linfonodo poplíteo. Observou-se um maior percentual de transmissibilidade para o vetor a partir de cães assintomáticos (p = 0,0494). As alterações histológicas cutâneas foram similares em ambos os grupos e se caracterizaram, de modo geral, por um infiltrado inflamatório, ora focal ora difuso, na derme, constituído, principalmente, por células mononucleares (macrófagos, linfócitos e plasmócitos), variando de discreto a intenso. Quanto à caracterização da resposta imune celular no tegumento dos animais, somente a densidade (células/mm2) de células iNOS+ foi significantemente maior na derme dos cães sintomáticos quando comparado aos assintomáticos (p = 0,0368). Observou-se correlação positiva moderada entre a densidade de parasitos na pele e a densidade de macrófagos (p = 0,031), de células T CD4+ (p = 0,015) e CD8+ (p = 0,023), e, também, naquela de células iNOS+ relativamente a de células T CD3+ (p = 0,005), CD4+ (p = 0,001) e CD8+ (p = 0,0001). Verificou-se, ainda, correlação negativa moderada com o número de manifestações clínicas e/ou gravidade da enfermidade (p = 0,028), confirmando, assim, maior transmissibilidade de parasitos ao vetor, a partir de animais assintomáticos, demonstrando-se, dessa forma, que tais cães são fontes de infecção em potencial para insetos vetores em áreas endêmicas para leishmaniose visceral canina. (AU)

Thirty-eight dogs naturally infected by Leishmania (Leishmania) infantum chagasi were randomly selected from Araçatuba of São Paulo state (Brazil), an endemic area for visceral leishmaniasis. The subjects were distributed into two groups: the first comprising 24 symptomatic dogs and the second consisting of 14 asymptomatic dogs. Possible correlations of clinical characterization (in both symptomatic and asymptomatic subjects) with potential to infect the insect vector, skin inflammatory pattern, cutaneous cellular immunity profile and cutaneous parasitism were investigated. Regarding to the number of cutaneous leishmania amastigotes/mm2, there was not a significant difference between the groups (p = 0.1584); density of skin parasites showed a moderate positive correlation with anti-Leishmania antibody titers (p = 0.042). Concerning to the infectivity to the insect vector, as evidenced by xenodiagnosis, 16 (66.7%) symptomatic and 13 (93%) asymptomatic dogs were able to transmit Leishmania to phlebotomines. Among these, six (37.5%) and eight (61.5%) dogs, respectivelly, did not show cutaneous parasitism, although all participant dogs were found positive when searching for parasites in the popliteal lymph nodes. Asymptomatic dogs showed higher transmissibility to the vector than symptomatic ones (p = 0.0494). Histological features in the skin were similar in both groups and were generally characterized by an inflammatory infiltrate, either diffuse or focal, in the dermis, mainly consisted of mononuclear cells (macrophages, lymphocytes and plasma cells), varying from mild to intense. Concerning characterization of the cutaneous cellular immune response, only iNOS+ cells density (cells/mm2) was significantly higher in the dermis of the symptomatic dogs compared to the asymptomatic ones (p = 0.0368). Moderate positive correlation between the cutaneous parasites density and the macrophages density (p = 0.031), the CD4+ T cells (p = 0.015) and CD8+ T cells (p = 0.023) were observed. Furthermore, density of iNOS+ cells in relation to CD3+ T cells (p = 0.005), CD4+ T cells (p = 0.001) and CD8+ T cells (p = 0.0001) were found positively correlated at a moderate level. It was also found a moderate negative correlation between cutaneous parasites density and the number of clinical signs and/or disease severity (p = 0.028), confirming grater parasites transmission to the vector from asymptomatic animals. It was therefore demonstrated that these dogs are potential sources of infection to insect vectors in endemic areas for canine visceral leishmaniasis. (AU)

Resposta imune-humoral e celular em bovinos da raça Nelore imunizados com extrato de larvas (L2 e L3) de Dermatobia hominis (Linnaeus Jr., 1781)

Dermatobia hominis larvae cause ulcerative lesions and damage to subcutaneous tissue and skin of the host. Leather is the subproduct which undergoes major depreciation, making it difficult to industrial use. Nowadays, the chemical control is utilized against dermatobiosis, therefore it leads to rising toxic chemicals in the animals and environment. The immunological challenge with D. hominis larval extract may represent an important altervative for this parasitosis control. Humoral and cellular immune responses were tested in bovine using an antigenic extract prepared with D. hominis larvae. Three groups of 10 months old Nelore females were used. The first group (A) received immunogenic larval extract of D. hominis with fifteen-days interval between injections; the group (B) was the control and has not received any sort of treatment; and the group (C) received an ectoparasitecide treatment based on Dichlorvos associated to Cypermetrina. Aditionally, leucogram and levels of IgG against D. hominis by immunoassay technique were evaluated. As for the humoral immunity, animals from group A presented higher IgG production against D. hominis with maximum levels of circulating antibodies at the 45th day after the first injection. These animals also showed higher production of neutrophils, eosinophils and monocytes than those from groups B and C. The number of D. hominis larvae nodules observed in animals from the group C was 148.3% larger than those from group A and B. The evidence concerning both cellular and humoral immune responses as well as the reduction on nodules number are an indication that the immunization against D. hominis was partially protective for the immunized bovines.

As larvas da Dermatobia hominis provocam lesões ulcerativas, danificando o tecido subcutâneo e conseqüentemente a pele do hospedeiro. O couro é o subproduto que sofre maior depreciação, o que, muitas vezes, impossibilita seu aproveitamento na industrialização. Atualmente o controle químico é utilizado como forma de combate à dermatobiose, entretanto, leva ao acúmulo de substâncias tóxicas nos animais e no ambiente. No presente trabalho, foram avaliadas as respostas imune-humoral e celular de bovinos imunizados com extrato antigênico preparado com larvas de D. hominis. Três grupos de oito bezerras da raça Nelore com 10 meses de idade foram usados, tendo o primeiro grupo (A) recebido aplicação de extrato imunogênico de larvas de D. hominis, com intervalos de quinze dias; o grupo (B), utilizado como controle, não recebendo nenhum tipo de tratamento; e o grupo (C) recebendo o tratamento ectoparasiticida à base de Dichlorvos associado a Cypermetrina. Neste mesmo período, foram avaliados o leucograma e os níveis de IgG contra D. hominis pela técnica de enzimoimunoensaio-ELISA. Quanto à avaliação da imunidade humoral, verificou-se que os animais do grupo A apresentaram maior produção de IgG contra D. hominis, com níveis máximos de anticorpos circulantes aos 45 dias após a primeira imunização. Estes animais também apresentaram maior produção de neutrófilos, eosinófilos e monócitos que os dos grupos B e C. O número de nódulos de larvas encontrado nos animais do grupo C foi 148,3% maior que nos animais dos grupos A e B. A comprovação da resposta imune celular e humoral, parcialmente caracterizadas, bem como a redução do número de nódulos, são indicadores que a imunização contra D. hominis foi parcialmente protetora para os bovinos imunizados.

Resposta imune-humoral e celular em bovinos da raça Nelore imunizados com extrato de larvas (L2 e L3) de Dermatobia hominis (Linnaeus Jr., 1781)

Dermatobia hominis larvae cause ulcerative lesions and damage to subcutaneous tissue and skin of the host. Leather is the subproduct which undergoes major depreciation, making it difficult to industrial use. Nowadays, the chemical control is utilized against dermatobiosis, therefore it leads to rising toxic chemicals in the animals and environment. The immunological challenge with D. hominis larval extract may represent an important altervative for this parasitosis control. Humoral and cellular immune responses were tested in bovine using an antigenic extract prepared with D. hominis larvae. Three groups of 10 months old Nelore females were used. The first group (A) received immunogenic larval extract of D. hominis with fifteen-days interval between injections; the group (B) was the control and has not received any sort of treatment; and the group (C) received an ectoparasitecide treatment based on Dichlorvos associated to Cypermetrina. Aditionally, leucogram and levels of IgG against D. hominis by immunoassay technique were evaluated. As for the humoral immunity, animals from group A presented higher IgG production against D. hominis with maximum levels of circulating antibodies at the 45th day after the first injection. These animals also showed higher production of neutrophils, eosinophils and monocytes than those from groups B and C. The number of D. hominis larvae nodules observed in animals from the group C was 148.3% larger than those from group A and B. The evidence concerning both cellular and humoral immune responses as well as the reduction on nodules number are an indication that the immunization against D. hominis was partially protective for the immunized bovines.

As larvas da Dermatobia hominis provocam lesões ulcerativas, danificando o tecido subcutâneo e conseqüentemente a pele do hospedeiro. O couro é o subproduto que sofre maior depreciação, o que, muitas vezes, impossibilita seu aproveitamento na industrialização. Atualmente o controle químico é utilizado como forma de combate à dermatobiose, entretanto, leva ao acúmulo de substâncias tóxicas nos animais e no ambiente. No presente trabalho, foram avaliadas as respostas imune-humoral e celular de bovinos imunizados com extrato antigênico preparado com larvas de D. hominis. Três grupos de oito bezerras da raça Nelore com 10 meses de idade foram usados, tendo o primeiro grupo (A) recebido aplicação de extrato imunogênico de larvas de D. hominis, com intervalos de quinze dias; o grupo (B), utilizado como controle, não recebendo nenhum tipo de tratamento; e o grupo (C) recebendo o tratamento ectoparasiticida à base de Dichlorvos associado a Cypermetrina. Neste mesmo período, foram avaliados o leucograma e os níveis de IgG contra D. hominis pela técnica de enzimoimunoensaio-ELISA. Quanto à avaliação da imunidade humoral, verificou-se que os animais do grupo A apresentaram maior produção de IgG contra D. hominis, com níveis máximos de anticorpos circulantes aos 45 dias após a primeira imunização. Estes animais também apresentaram maior produção de neutrófilos, eosinófilos e monócitos que os dos grupos B e C. O número de nódulos de larvas encontrado nos animais do grupo C foi 148,3% maior que nos animais dos grupos A e B. A comprovação da resposta imune celular e humoral, parcialmente caracterizadas, bem como a redução do número de nódulos, são indicadores que a imunização contra D. hominis foi parcialmente protetora para os bovinos imunizados.

Role of cytokines, NO, and H2O2 on the immunopathology of Leptospirosis in genetically selected mice

Immune response to leptospirosis is mainly humorally mediated, and involves opsonization of leptospires for phagocytosis by macrophages and neutrophils. However, some aspects are still unknown. For a more detailed analysis of the cellular immune response to leptospirosis infection, trials were carried out in order to determine the hydrogen peroxide and nitric oxide (H2O2 and NO) production stimulated or not by Interferon-gamma. The participation of some specific cytokines, such as Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-alpha); Interferon-gamma (IFN-gamma); Interleukin-6 (IL-6); and Interleukin-4 (IL-4), in the immunopathology of this infection was also investigated. For this purpose, we analyzed the supernatant from peritoneal macrophage cell culture and the splenic cells of mice genetically selected as High (H) and Low (L) antibody producers, and inbred Balb/c mice infected with Leptospira interrogans serovar icterohaemorrhagiae. The IL-6 production varied from release peaks to inhibition in H, L, and Balb/c mice. Similar behavior was observed for IL-4, produced only by H and Balb/c mice. The three strains presented constant and elevated production of TNF-alpha until day 14, suggesting its effective participation in the initial phase of the infection. Meanwhile, all the three strains presented a constant and irregular IFN-gamma production, with release peaks between the 7th and 14th days in L mice. The H and Balb/c mice strains presented a higher tendency to Th2 response pattern, whereas L mice tended towards Th1 response.