Outbreak of Clostridium perfringens type D enterotoxemia in sheep / Surto de enterotoxemia por Clostridium perfringens tipo D em ovinos

This work describes the first Brazilian laboratory-confirmed outbreak of enterotoxemia caused by Clostridium perfringens type D in sheep, which occurred in the state of Paraná. We address the epidemiological aspects involved, the diagnostic modalities employed, and the clinical signs and pathological findings observed. Eight healthy pregnant female sheep with no history of vaccination for clostridiosis presented with a history of abrupt feeding changes and neurological manifestations that quickly evolved to illness, coma and death. Four other females with clinical neurological signs were referred to the Veterinary Hospital of the Universidade Federal do Paraná, Palotina Sector. These animals presented with lethargy, motor incoordination, opisthotonus, pedal movements, muscle tremors, spastic paralysis, bruxism, mandibular trismus, sialorrhea, hyperexcitability and the inability to stand. They were examined and euthanized due to the seriousness of the clinical picture with an unfavorable prognosis. We performed gross anatomical and microscopic analyses of the organs and intestinal contents. We also performed bacterial isolation with molecular typing. From the intestinal contents, we detected toxins by means of the seroneutralization technique in mice. At necropsy, we noted pulmonary edema (2/4), necrotizing enteritis (4/4) and hyperemia of the leptomeninges (1/4). Microscopically, we observed lymphohistiocytic interstitial pneumonia, necrotic enteritis associated with the presence of rods, and nephrosis with interstitial lymphohistiocytic nephritis. No significant brain lesions were observed. Using serum neutralization, we identified epsilon toxin in the intestinal contents of all four animals. C. perfringens type D was identified. Based on the history, clinical signs, postmortem findings, and laboratory confirmation of the presence of epsilon toxin, we concluded that C. perfringens type D enterotoxemia caused this outbreak of sheep deaths.

Este trabalho descreve o primeiro surto brasileiro com confirmação laboratorial de enterotoxemia em ovinos por Clostridium perfringens tipo D, ocorrido no estado do Paraná, abordando os aspectos epidemiológicos envolvidos, sinais clínicos observados, achados patológicos e diagnóstico empregado. Oito fêmeas ovina, gestantes, em bom estado corporal e com histórico de mudanças bruscas na alimentação, sem histórico de vacinação para clostridioses, apresentaram manifestações clínicas neurológicas que logo evoluíram para decúbito, coma e morte. Outras quatro fêmeas apresentaram os sinais clínicos neurológicos e foram encaminhadas ao Hospital Veterinário da Universidade Federal do Paraná, setor Palotina. Os animais foram examinados e submetidos à eutanásia devido à gravidade do quadro clínico e prognóstico desfavorável. Destes quatro animais foram coletados fragmentos de órgãos e do conteúdo intestinal. Foi realizada análise macroscópica e microscópica dos órgãos, bem como isolamento bacteriano, tipificação molecular do agente e a detecção das toxinas por meio da técnica de soroneutralização em camundongos a partir do conteúdo intestinal. Os quatro ovinos examinados apresentaram letargia, incoordenação motora, opistótono, movimentos de pedalagem, tremores musculares, paralisia espástica, bruxismo, trismo mandibular, sialorréia, hiperexcitabilidade e decúbito. Na necropsia, constatou-se edema pulmonar (2/4), enterite necrohemorrágica (4/4) e hiperemia de leptomeninges (1/4). Microscopicamente havia pneumonia intersticial linfohistiocitária, enterite necrótica associada com a presença de bastonetes e nefrose com nefrite intersticial linfohistiocitária. Não foram observadas lesões encefálicas dignas de nota em função do quadro agudo da doença. Por meio da soroneutralização foi possível identificar a presença da toxina épsilon no conteúdo intestinal dos quatro...

Outbreak of Clostridium perfringens type D enterotoxemia in sheep / Surto de enterotoxemia por Clostridium perfringens tipo D em ovinos

This work describes the first Brazilian laboratory-confirmed outbreak of enterotoxemia caused by Clostridium perfringens type D in sheep, which occurred in the state of Paraná. We address the epidemiological aspects involved, the diagnostic modalities employed, and the clinical signs and pathological findings observed. Eight healthy pregnant female sheep with no history of vaccination for clostridiosis presented with a history of abrupt feeding changes and neurological manifestations that quickly evolved to illness, coma and death. Four other females with clinical neurological signs were referred to the Veterinary Hospital of the Universidade Federal do Paraná, Palotina Sector. These animals presented with lethargy, motor incoordination, opisthotonus, pedal movements, muscle tremors, spastic paralysis, bruxism, mandibular trismus, sialorrhea, hyperexcitability and the inability to stand. They were examined and euthanized due to the seriousness of the clinical picture with an unfavorable prognosis. We performed gross anatomical and microscopic analyses of the organs and intestinal contents. We also performed bacterial isolation with molecular typing. From the intestinal contents, we detected toxins by means of the seroneutralization technique in mice. At necropsy, we noted pulmonary edema (2/4), necrotizing enteritis (4/4) and hyperemia of the leptomeninges (1/4). Microscopically, we observed lymphohistiocytic interstitial pneumonia, necrotic enteritis associated with the presence of rods, and nephrosis with interstitial lymphohistiocytic nephritis. No significant brain lesions were observed. Using serum neutralization, we identified epsilon toxin in the intestinal contents of all four animals. C. perfringens type D was identified. Based on the history, clinical signs, postmortem findings, and laboratory confirmation of the presence of epsilon toxin, we concluded that C. perfringens type D enterotoxemia caused this outbreak of sheep deaths.(AU)

Este trabalho descreve o primeiro surto brasileiro com confirmação laboratorial de enterotoxemia em ovinos por Clostridium perfringens tipo D, ocorrido no estado do Paraná, abordando os aspectos epidemiológicos envolvidos, sinais clínicos observados, achados patológicos e diagnóstico empregado. Oito fêmeas ovina, gestantes, em bom estado corporal e com histórico de mudanças bruscas na alimentação, sem histórico de vacinação para clostridioses, apresentaram manifestações clínicas neurológicas que logo evoluíram para decúbito, coma e morte. Outras quatro fêmeas apresentaram os sinais clínicos neurológicos e foram encaminhadas ao Hospital Veterinário da Universidade Federal do Paraná, setor Palotina. Os animais foram examinados e submetidos à eutanásia devido à gravidade do quadro clínico e prognóstico desfavorável. Destes quatro animais foram coletados fragmentos de órgãos e do conteúdo intestinal. Foi realizada análise macroscópica e microscópica dos órgãos, bem como isolamento bacteriano, tipificação molecular do agente e a detecção das toxinas por meio da técnica de soroneutralização em camundongos a partir do conteúdo intestinal. Os quatro ovinos examinados apresentaram letargia, incoordenação motora, opistótono, movimentos de pedalagem, tremores musculares, paralisia espástica, bruxismo, trismo mandibular, sialorréia, hiperexcitabilidade e decúbito. Na necropsia, constatou-se edema pulmonar (2/4), enterite necrohemorrágica (4/4) e hiperemia de leptomeninges (1/4). Microscopicamente havia pneumonia intersticial linfohistiocitária, enterite necrótica associada com a presença de bastonetes e nefrose com nefrite intersticial linfohistiocitária. Não foram observadas lesões encefálicas dignas de nota em função do quadro agudo da doença. Por meio da soroneutralização foi possível identificar a presença da toxina épsilon no conteúdo intestinal dos quatro...(AU)

Avaliação da eficiência dos toxóides recombinantes e de Clostridium perfringens na imunização de equinos

Clostridium perfringens tem sido classificado como principal agente patogênico gastrointestinal em potros com até 10 dias de idade, apesar dos quadros de enterocolites serem mais comuns em neonatos, animais jovens e adultos também podem ser acometidos. O quadro clínico que se manifesta na forma de cólica, diarreia sanguinolenta e evolui rapidamente para choque circulatório, é causado por ação da toxina (CPB) de C. perfringens tipo C. Esse agente bacteriano também está associado a graves quadros de mionecrose, geralmente fatais, por envolvimento da toxina (CPA) de C. perfringens tipo A. Para equinocultura, a importância dessas enfermidades deve-se a elevada mortalidade e a inexistência de vacinas comerciais, que garantam a imunização, principal forma de prevenção. Assim o objetivo deste trabalho foi ser o pioneiro em utilizar e avaliar a longevidade da resposta imune humoral no período de um ano, em equinos imunizados com diferentes concentrações (100, 200 e 400µg) de toxóides recombinantes CPA e CPB de C. perfringens tipos A e C, respectivamente, bem como comparar aos resultados obtidos em animais inoculados com toxóide comercial. Foram utilizados 50 animais da espécie equina, raça Mangalarga Marchador, de ambos os sexos, a partir de um ano de idade, sem histórico vacinal contra clostridioses. Os animais foram divididos aleatoriamente em cinco grupos de dez equinos: Grupo Vacina Recombinante 100µg (G1), Grupo Vacina Recombinante 200µg (G2), Grupo Vacina Recombinante 400µg (G3), Grupo Vacina Comercial (G4) e Grupo Controle Negativo (G5). Os equinos do G1, G2 e G3 foram vacinados com a vacina recombinante contendo diferentes concentrações dos toxóides recombinantes CPA e CPB 100, 200 e 400µg, respectivamente, G4 com vacina comercial e o G5 recebeu solução salina estéril (NaCl 0,9%). Todos os animais receberam duas doses de 2ml, por via intramuscular, na tábua do pescoço, nos dias zero e 28 após a primeira dose. As amostras de soro sanguíneo foram coletadas nos dias zero, 28, 56, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330 e 360 após a primeira vacinação. Os soros obtidos, após centrifugação foram submetidos a técnica de soroneutralização em camundongos. O teste de potência realizado no dia 56, demonstrou que as formulações de 200 e 400µg foram capazes de induzir resposta imune em todos os equinos inoculados, de acordo com os níveis exigidos na legislação, assim como, ao avaliar a longevidade (teste de eficiência) da resposta imune vacinal, as mesmas concentrações apresentaram níveis de anticorpos detectáveis até o dia 180, não havendo diferenças significativas entre os resultados obtidos. A vacina recombinante nas concentrações acima de 200µg foi capaz de estimular resposta imune humoral satisfatória em equinos.

Clostridium perfringens has been rated as the main gastrointestinal pathogen in foals up to age 10 days old, although enterocolitis is more common in neonates, young and adult animals may also be affected. The clinical picture which manifests itself in a form of colic, bloody diarrhoea and progresses rapidly towards a circulatory shock, is caused by the action of toxin (CPB) of C. perfringens type C. This bacterial agent is also associated with severe myonecrosis, usually fatal, due to the involvement of toxin (CPA) of C. perfringens type A. For equinoculture, the importance of these diseases is due to the high mortality and the absence of commercial vaccines, which ensure immunization, the main form to prevent. Therefore, the aim of the present work was to be pioneer in using and to analyse the longevity of humoral immune response in the period of one year, in horses immunized with different concentrations (100, 200 and 400µg) of recombinant toxoids CPA and CPB of C. perfringens types A and C, respectively, as well as compare to results acquired from inoculated animals with commercial toxoid. Fifty horses were used, Mangalarga Marchador breed, of both sexes, from the age of one year and up, no vaccine history against clostridiosis. The animals were randomly divided into five groups of ten horses: Recombinant Vaccine Group 100µg (G1), Recombinant Vaccine Group 200µg (G2), Recombinant Vaccine Group 400µg (G3), Commercial Vaccine Group (G4) and Negative Control Group (G5). G1, G2 and G3 horses have been vaccinated with the recombinant vaccine containing different concentrations of recombinant toxoids CPA and CPB 100, 200 and 400µg, respectively, G4 with commercial vaccine and G5 received sterile saline (NaCl 0.9%). All animals received two doses of 2ml, intramuscularly, in the neck, on days zero and 28 after the first dose. Blood serum samples were collected on days zero, 28, 56, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330 and 360 after the first vaccination. The serum obtained after centrifugation was submitted to the serum neutralization technique in mice. The potency test held on day 56 has demonstrated that the formulations of 200 and 400µg were able to induce an immune response in all inoculated horses, according to levels required by legislation, as well as, when assessing the longevity (efficiency test) of the immune response, the same concentrations presented levels of detectable antibodies until day 180, without significant differences between the results obtained. The recombinant vaccine in above concentrations 200 µg was able to stimulate a satisfactory humoral immune response in horses.

ELISA and modified toxin-binding inhibition test for quality control of the clostridial vaccine processes / ELISA direto e ToBI-test modificado para o controle de qualidade de processos de vacinas clostridiais

This study aimed to assess and standardize the ELISA and modified ToBI test in vitro methods in order to verify the potency of epsilon toxicoid in comparison with the in vivo TCP method. The following epsilon toxoids were used: NIBSC standard from batches 375/07, 532/08, 551/08, 373/07 and 378/07. These were evaluated using a TCP test, ELISA and ToBI tests. The results indicate that the correlation ratio between the dilutions of standard NIBSC toxicoid and absorbance values of 89.44% obtained with the ELISA method support the use of the curve to evaluate epsilon toxoids. However, it was observed that the absorbance values were similar for all toxoids, thus presenting no significant difference between higher and lower concentration toxoids. For the ToBI test, the correlation ratio of 96.76, obtained in the curve pattern, demonstrates the effectiveness of the curve to be used in the epsilon toxoid evaluation. The correlation ratio between the titration degrees of toxoids obtained through TCP and ToBI tests was higher than 90%. It is concluded that the type of ELISA test used does present discriminative power for toxoids with different concentrations, which does not support the use of this technique for such a purpose. The ToBI test can be used as a screening method for it is sensitive and effective to detect epsilon toxicoid produced by C. perfringens type D.(AU)

Teve-se por objetivo avaliar e padronizar as metodologias in vitro, ELISA e ToBI-test modificado, para a análise de toxoide épsilon, em comparação com a metodologia in vivo TCP. Foram utilizados os seguintes toxoides épsilon: padrão NIBSC e os lotes 375/07, 532/08, 551/08, 373/07 e 378/07, os quais foram avaliados por métodos in vivo, TCP, e in vitro, ELISA e ToBI-test. A análise do título de toxoide épsilon por meio dos métodos in vitro foi realizada a partir de uma curva-padrão, estabelecida previamente. Os principais resultados mostram que os valores de absorbância foram semelhantes para todos os toxoides, não apresentando diferença significativa entre os toxoides mais concentrados e menos concentrados. No ToBI-test, o coeficiente de correlação de 96,76%, obtido na curva-padrão, demonstra a eficiência da curva para avaliação do toxoide épsilon. O coeficiente de correlação entre os títulos de toxoide obtidos pelo TCP e ToBI-test foi superior a 90%. Conclui-se que o tipo de ELISA utilizado não apresenta poder discriminativo para toxoides com diferentes concentrações, inviabilizando a técnica para esse fim. O ToBI-test pode ser utilizado como um método de triagem sensível e eficaz para a detecção de toxoide épsilon de C. perfringens tipo D.(AU)

Avaliação de uma estirpe não toxigênica para prevenção de diarreia neonatal em leitões por clostridioides ( clostridium ) difficile

Clostridioides (Clostridium) difficile é um dos maiores causadores de diarreia neonatal em suínos e estudos tem apontado para um possível potencial zoonótico deste microrganismo. Apesar da importância do patógeno, não existem medidas específicas para a prevenção e controle da infecção por C. difficile (ICD). Desta forma, o objetivo do presente estudo foi caracterizar genotipicamente e avaliar o potencial de proteção de uma estirpe não toxigênica de C. difficile (NTCD), nomeada de Z31, contra a ICD em suínos. Para tal, o estudo foi dividido em cinco etapas: (1) Caracterização genotípica da estirpe Z31; (2) Avaliação da capacidade preventiva da estirpe Z31 contra a ICD em modelo experimental suíno; (3) Avaliação da capacidade preventiva da estirpe Z31 contra a ICD em uma granja comercial; (4) Avaliação de cinco meios de cultura para a produção e esporulação da estirpe Z31; e (5) Avaliação da viabilidade temporal de esporos liofilizados da estirpe Z31. O sequenciamento genômico revelou que a estirpe Z31 possui um cromossomo circular de 4.298.263 pares de base (bp), contendo genes responsáveis por produção e estabilidade dos esporos (spo0A), aderência intestinal (slpA) e formação de biofilme (fliD), porém, ausência dos genes codificadores das toxinas. Em modelo experimental em suínos neonatos, a Z31 preveniu a ICD, reduzindo os sinais clínicos, as lesões macro e microscópicas e a eliminação fecal do agente. Em uma granja comercial, mesmo na presença de outros enteropatógenos, a Z31 reduziu a ocorrência de ICD, a eliminação fecal de C. difficile toxigênico e a ocorrência de diarreia neonatal suína. Os meios BHI e RCM proporcionaram as maiores taxas de crescimento in vitro da estirpe Z31, atingindo concentrações de 6,57 × 106 UFC/mL com proporção de esporos superiores a 98%. Quando liofilizada, a estirpe Z31 manteve uma viabilidade aceitável tanto em temperatura ambiente quanto resfriada, de forma que 40-50% da carga total ainda se encontrava viável após 2 anos de armazenamento. Como conclusão, a estirpe Z31 foi capaz de prevenir a ICD em suínos e demonstrou características desejáveis para o seu potencial uso comercial.

Clostridioides (Clostridium) difficile is one of the main causes of porcine neonatal diarrhea and studies has shown the possible zoonotic potential of this microorganism. Despite the importance of this pathogen, there are no specific measures for the prevention and control of C. difficile infection (CDI). Thus, the aim of the present study was to characterize genotypically and evaluate the protective potential of a non-toxigenic C. difficile strain (NTCD), named Z31, against CDI in piglets. For this purpose, the study was divided into five stages: (1) Genotypic characterization of the strain Z31; (2) Evaluation of the preventive capacity of the strain Z31 against the CDI in experimental pig model; (3) Evaluation of the preventive capacity of the strain Z31 against CDI in a commercial farm; (4) Evaluation of five culture media for the production and sporulation of the strain Z31; and (5) Evaluation of the temporal viability of freeze-dried spores of the strain Z31. Genomic sequencing revealed that the strain Z31 has a circular chromosome of 4,298,263 base pairs (bp) containing genes responsible for spore production and stability (spo0A), intestinal adhesion (slpA) and biofilm formation (fliD), but absence of toxins encoding genes. In an experimental model in neonatal pigs, the strain Z31 prevented CDI, reducing clinical signs, macro and microscopic lesions and fecal elimination of the agent. In a commercial farm, even in the presence of other enteropathogens, the Z31 reduced the occurrence of CDI, the fecal elimination of toxigenic C. difficile and the occurrence of neonatal porcine diarrhea. The BHI and RCM media provided the highest in vitro growth rates of the strain Z31, reaching concentrations of 6.57 × 106 CFU/ml with spore ratio greater than 98%. After lyophilization, the strain Z31 maintained acceptable viability at both, ambient and cooled temperatures, so that 40-50% of the total charge was still viable after 2 years of storage. In conclusion, the strain Z31 was able to prevent CDI in pigs and demonstrated desirable characteristics for its potential commercial use.

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E ANTIGÊNICA DE Clostridium chauvoei ISOLADOS DE CASOS DE CARBÚNCULO SINTOMÁTICO EM BOVINOS

As clostridioses formam o grupo de infecções e intoxicações causadas por micro-organismos anaeróbios do gênero Clostridium. Dentre estas enfermidades, a principal doença que determina mionecrose é o carbúnculo sintomático, uma infecção endógena e aguda que acomete principalmente os bovinos, cujo agente etiológico é Clostridium chauvoei. O controle desta enfermidade se baseia em medidas adequadas de manejo e vacinações sistemáticas de todo o rebanho. As vacinas contra o carbúnculo sintomático comercializadas no Brasil são, no geral, compostas de múltiplos antígenos e seguem as normas para o controle da qualidade e eficiência definidas na legislação publicada pela Secretaria de Defesa Agropecuária (SDA) do Ministério de Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). No entanto, são escassos os trabalhos com evidências científicas que comprovem a eficiência da vacina, assim como trabalhos que indiquem o grau de similaridade entre cepas de C. chauvoei utilizadas na produção destas vacinas, cepas de maior ocorrência no campo e a cepa padrão utilizada no teste de eficiência da vacina pelo MAPA. Da mesma forma os relatos acerca de falhas vacinais são informais e as circunstâncias destas falhas não são claramente elucidadas. Os principais fatores de virulência de C. chauvoei são a neuraminidase, citotoxina A (CctA) e a flagelina, sendo que a CctA parece ser o principal. Esta tese teve por objetivo avaliar a eficácia protetiva de vacinas comerciais frente ao desafio com C. chauvoei, bem como realizar a comparação genômica das cepas utilizadas no desafio vacinal (manuscrito 2). A diversidade molecular foi investigada, a partir do sequenciamento parcial dos genes da neuraminidase (nanA), CctA (cctA) e flagelina (fliC) de dezessete cepas de C. chauvoei isoladas de casos clínicos em bovinos (manuscrito 3). Também pretendeu à comparação genômica de seis cepas isoladas de casos de carbúnculo sintomático no Brasil com vistas a pesquisar diferenças moleculares na única cepa com apresentação clínica visceral (manuscrito 4). Dessa forma, discutir as implicações da caracterização molecular e antigênica no entendimento do carbúnculo sintomático, e subsidiar futuras pesquisas a fim de melhorar o controle da doença. Concluímos que o desempenho equivalente das duas cepas de C. chauvoei após o desafio in vivo e a incapacidade de infectar os animais vacinados estão correlacionados com a homologia genética das cepas, sugerindo que as falhas vacinais não estão relacionadas à variabilidade antigênica. O sequenciamento parcial dos genes nanA e cctA mostrou alta homologia entre as cepas. Por essa razão, estes antígenos solúveis são bons candidatos a antígenos vacinais. Além disso, três alelos foram detectados no gene fliC. Na comparação genômica as seis cepas brasileiras se mostraram altamente conservadas, tal como foi observado no sequenciamento parcial dos genes e na comparação das cepas utilizadas no desafio vacinal. Os resultados apresentados nesta tese podem ser um indicativo de que neste momento evolutivo C. chauvoei não está sendo desafiado a desenvolver mutações

Clostridioses are the group of infections and intoxications caused by anaerobic microorganisms of the genus Clostridium. Among these diseases, the main disease that causes myonecrosis is blackleg, an endogenous and acute infection that mainly affects cattle, whose etiological agent is Clostridium chauvoei. Control of this disease is based on adequate management measures and systematic vaccinations of herd. Vaccines against blackleg marketed in Brazil are, in general, composed of multiple antigens and follow the standards for quality and efficiency control defined in the legislation published by the Ministry of Agriculture, Livestock and Food Supply (MAPA). However, there are few studies with scientific evidence to prove the effectiveness of the vaccine, as well as studies indicating the degree of similarity between strains of C. chauvoei used in the production of these vaccines, strains occurring in the field and the standard strain. Likewise reports of vaccine failures are informal and the circumstances of these failures are not clearly elucidated. The main virulence factors of C. chauvoei are neuraminidase, cytotoxin A (CctA) and flagellin, and CctA appears to be the main. This thesis aimed to evaluate the protective efficacy of commercial vaccines against the challenge with C. chauvoei, as well as to carry out the genomic comparison of the strains used in the vaccine challenge (manuscript 2). The molecular diversity, from the partial sequencing of the neuraminidase (nanA), CctA (cctA) and flagellin (fliC) genes of seventeen strains of C. chauvoei isolated from clinical cases in cattle was investigated (manuscript 3). It also aimed to the genomic comparison of six strains isolated from cases of blackleg in Brazil with a view to investigate molecular differences in the only strain with visceral clinical presentation (manuscript 4). Thus, to discuss the implications of molecular and antigenic characterization in the understanding of blackleg, and to support future research with the objective of improving disease control. We concluded that the similar performance observed between the strains in challenge in vivo and the inability to infect the vaccinated animals are correlated with the genetic homology of the strains, suggesting that vaccine failures are not related to antigenic variability. Partial sequencing of nanA and cctA genes showed high homology between strains. For this reason, these soluble antigens are good candidates for vaccine antigens. Moreover, three different fliC alleles were detected among the strains studied. In the genomic comparison, the six Brazilian strains were highly conserved, as observed in the partial sequencing of the genes and in the comparison of the strains used in the vaccine challenge. The results presented in this thesis may be indicative that at this evolutionary time C. chauvoei is not being challenged to develop mutations.

CINÉTICA DE CRESCIMENTO DO Clostridium haemolyticum PARA PRODUÇÃO DE VACINA VETERINÁRIA

O gênero Clostridium representa um grupo extenso de bactérias anaeróbicas que são encontradas no solo e no trato gastrintestinal dos animais e do homem. Essas bactérias são capazes de sobreviver por longos períodos em condições adversas, graças à capacidade que possuem de formar esporos. São consideradas de importância tanto para a medicina quanto para a economia devida às inúmeras doenças que acometem aos bovinos, ovinos e caprinos.O Clostridium haemolyticum é o microrganismo responsável por provocar a doença hemoglobinúria bacilar, a qual acomete bovinos em sua maioria, sendo fatal nos casos agudos.A principal forma de prevenção da doença é através da vacinação, cuja produção é realizada utilizando corpo bacteriano inativado. O Clostridium haemolyticumé difícil de ser cultivado em alta densidade celular em escala industrial por ser um microrganismo fastidiososendo, portanto, um obstáculo importante de ser superado. Este trabalho teve por objetivo conhecer a influência da glicose e pH na cinética de crescimento do Clostridium haemolyticum, no intuito de estabelecer parâmetros para produção em alta densidade celular para formulação de vacinas contra hemoglobinúria bacilar.Neste estudo, foi observado que o cultivo do Clostridium haemolyticum com glicose inicial em 10 g.L-1 e pH controlado em 6,5 apresentou os melhores resultados para produtividade. Os dados cinéticos debaixa formação de ácidos orgânicos, menor fase lag e maior velocidade específica de crescimentovisto neste ensaio são requisitos essências para obtenção crescimento em alta densidade celular para produção de vacina contraClostridium haemolyticum.

The genus Clostridium is an extensive group of anaerobic bacteria that are found in soil and in the gastrointestinal tract of animals and man. These bacteria are able to survive for long periods in adverse conditions due to the capacity they have to form spores. They are considered of importance both for medicine and for the economy due to the many diseases affecting the cattle, sheep and goats. Clostridium haemolyticum is the microorganism responsible for causing bacillary hemoglobinuria disease, which affects cattle mostly be fatal in acute cases. The main way to prevent the disease is through vaccination, where production is performed using inactivated bacterial body. Clostridium haemolyticum is difficult to be grown in high density cell on an industrial scale to be a fastidious organism is therefore a major obstacle to overcome.This study aimed to know the influence of glucose and ph in Clostridium haemolyticum growth kinetics, in order to establish parameters for production in high cell density for the formulation of vaccines against bacillary hemoglobinuria. In this study, it was observed that the cultivation of Clostridium haemolyticum with initial glucose in 10 g.l-1 and ph controlled at 6.5 showed the best results for productivity. The kinetic data for low formation of organic acids, shorter lag phase and higher specific growth rate seen in this test are requirements for obtaining essences growth in high cell density for clostridialvaccine production haemolyticum.

Desenvolvimento de bacterinas de Escherichia coli recombinante contendo as toxinas alfa, beta e épsilon de Clostridium perfringens

Clostridium perfringens é um bacilo Gram-positivo, formador de esporo e produtor de ao menos 17 toxinas, das quais, quatro são consideradas principais, a toxina alfa (CPA), beta (CPB), épsilon (ETX) e iota (CPI) utilizadas para classificar a espécie em cinco toxinotipos (A, B, C, D e E). A toxinfecção nos animais ocorre por via iatrogênica/traumática ou gastrointestinal. As principais enfermidades causadas por C. perfringens são gangrena gasosa, enterotoxemias, enterite necrótica/hemorrágica e enterocolite. As vacinas contra as toxinas de C. perfringens são extensivamente utilizadas em medicina veterinária, tornando-se a principal medida de controle e profilaxia nos rebanhos. Tem crescido o número de estudos visando à utilização de vacinas recombinantes contra as principais toxinas de C. perfringens (CPA, CPB e ETX). Com isso, o objetivo do presente estudo foi avaliar os títulos de anticorpos neutralizantes antitoxinas CPA, CPB e ETX em coelhos vacinados com células inteiras inativadas de Escherichia coli (bacterinas recombinantes), assim como, a fração celular solúvel ou insolúvel, contendo tais antígenos. Após a expressão das proteínas, as células foram inativadas com formaldeído na concentração final 0,2% (v/v). Em seguida, a eficiência da inativação foi avaliada por plaqueamento de uma alíquota do cultivo em placas de LB ágar. Confirmada a inativação, as bactérias foram centrifugadas e lavadas com PBS estéril para remoção de formaldeído residual. Nas vacinas compostas por frações celulares solúveis e insolúveis, a presença dos antígenos rCPA, rCPB e rETX foi confirmada através de SDS-PAGE e western blot. As proteínas, nas duas formulações, foram quantificadas por SDSPAGE juntamente com uma curva com diferentes concentrações de albumina sérica bovina (BSA) e analisadas no software TotalLab quant®. As características de solubilidade dos antígenos recombinantes foram idênticas em ambos os vetores utilizados, pAE e pET28a, onde rCPA e rCPB foram expressas em corpos de inclusão e rETX na forma solúvel. Não foram detectados títulos de anticorpos neutralizantes antitoxinas CPA, CPB ou ETX no soro dos animais vacinados com ambas as formulações vacinais contendo 50 µg de cada antígeno expresso no vetor pAE. Entretanto, no segundo experimento com 200 µg de cada antígeno expresso em vetor pET28a, em ambas as formulações, geraram títulos de anticorpos neutralizantes antitoxina ETX de 10 UI/mL-1 , cinco vezes superior ao valor mínimo preconizado pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA). Não foram detectados títulos de anticorpos neutralizantes antitoxina CPB. A titulação de anticorpos neutralizantes antitoxina CPA não foi realizada. Os resultados do presente estudo, não apenas sustentam a potencial utilização de antígenos recombinantes, mas também fornecem dados adicionais quanto à vacinação com células inteiras inativadas de E. coli ou fração celular solúvel e insolúvel contendo proteínas recombinantes. Essa forma alternativa de produção de vacinas recombinantes visa à disponibilização de antígenos de alta qualidade e baixo custo para utilização pela indústria veterinária

Clostridium perfringens is a spore-forming, Gram-positive bacillus that produces at least 17 alpha (CPA), beta (CPB), epsilon (ETX), and iota (CPI) toxins are used to classify this bacterium into five toxinotypes (A, B, C, D, and E). Animal toxinfection occurs via either the iatrogenic/traumatic or the gastrointestinal route. The main illnesses caused by C. perfringens are gas gangrene, enterotoxemias, haemorrhagic/necrotic enteritis and enterocolitis. Vaccines against C. perfringens toxins are largely used in veterinary medicine, rendering them the main prophylactic control measure in farm animals. The number of studies aiming to develop recombinant vaccines against C. perfringens alpha, beta, and epsilon toxins is on the rise. Studies looking for alternatives to diminish time and production costs are also gaining ground. Therefore, the present study aims to evaluate neutralizing antibody titers against CPA, CPB, and ETX in rabbits immunized with whole, inactivated de E. coli cells (recombinant bacterins) and with post-lysis cell fractions containing such antigens. After protein expression, E. coli cells were inactivated with formaldehyde 0,2% (v/v). Inactivation efficiency was assessed by plating sterile LB agar plates. Once inactivation was confirmed, bacteria were washed with sterile PBS to remove residual formaldehyde. The presence of rCPA, rCPB and rETX in vaccines comprised by both soluble and insoluble cell fractions was confirmed by means of SDS-PAGE and western blot. Proteins in both formulations were quantified by SDSPAGE using different BSA concentrations using TotalLab quant® software. Solubility characteristic were identical in both pAE and pET28a expression vectors: rCPA and rCPB were expressed in inclusion bodies and rETX was soluble. No neutralizing antibody titers against CPA, CPB or ETX were detected in the sera of animals immunized with either formulation containing 50 µg of each antigen when pAE was used. However, when pET28a was used, 200 µg of each antigen in either formulation were able to generate up to 10 UI/mL-1 of anti ETX neutralizing antibodies, which is five-fold the minimum required by the Brazilian Ministry of Agriculture, Livestock and Food Supply. Neutralizing antibodies against CPB were not detected. A toxoid-based commercial vaccine induced 10-20 UI/mL-1of neutralizing antibodies against CPB. Anti-CPA neutralizing antibodies titration was not performed. These results, not only support the use of recombinant antigens, but also provide data about immunization using whole, inactivated E. coli cells or both their soluble and not soluble fractions containing recombinant antigens as vaccines. This alternative recombinant vaccine production method yields high quality antigens with low production costs to be used in veterinary medicine.

Avaliação da potência de vacinas contra clostridium septicum comercializadas no brasil

ABSTRACT Clostridium septicum, a ubiquitous organism, is the main pathogen causing malignant edema. Because of its strong cytotoxic alpha toxin, infections are often lethal. Losses in livestock can be prevented through vaccination with alpha-toxoid vaccines. The antibody response to the C. septicum component of 12 commercial vaccines was evaluated by the mouse serum neutralization test using rabbit and bovine sera. The vaccines coded as T1, T2, T4, T10 and T11 induced titers of alpha antitoxin higher than the minimum test level of 2.5 IU/mL. None of the other vaccines induced the formation of antibodies. The majority of the C. septicum vaccines commercialized in Brazil were unable to induce an immune response as recommended for the control of this product.

RESUMO Clostridium septicum, um organismo ubiquitário, é o principal patógeno responsável pelo quadro de edema maligno. Devido à ação citotóxica da toxina alfa as infecções geralmente são fatais. Para o controle da doença é utilizada a vacinação com toxóide alfa. Neste trabalho, avaliouse a eficiência de 12 vacinas comerciais contra clostridioses, que continham em sua composição C. septicum, através da soroneutralização em camundongos com soros de coelhos e bovinos vacinados. As vacinas codificadas como T1, T2, T4, T10 e T11 apresentaram títulos de antitoxina alfa superiores ao nível mínimo exigido pelo teste de 2,5 UI/mL. As demais vacinas não induziram a formação de anticorpos. Em sua maioria, as vacinas comercializadas no Brasil, contra C. septicum, foram ineficientes em estimular resposta imune compatível com os níveis de teste recomendados para controle deste produto.

Evaluation of the potency of vaccines against Clostridium tetani commercialized in Brazil / Avaliação da potência de vacinas contra Clostridium tetani comercializadas no Brasil

Tetanus is an infectious neurological syndrome caused by the action of the tetanus toxin, produced by Clostridium tetani, which acts in the central nervous system, characterizing itself by a spastic paralysis scenario. The antibody response to the C. tetani component of eight commercial vaccines was evaluated by the mice serum neutralization test with rabbit and guinea pigs sera. T2, T4, T5 and T8 induced titles of C. tetani antitoxin superior to the recommended minimum title of 2.5 IU/ml. The vaccines T1, T3, T6 and T7 did not induce protection titles. A total of 50% of the C. tetani vaccines commercialized in Brazil were unable to induce the minimum antibody response recommended for the approval of the product.

O tétano é uma síndrome neurológica infecciosa ocasionada pela ação da toxina tetânica, produzida por Clostridium tetani, que age no sistema nervoso central, caracterizando-se por um quadro de paralisia espástica. Neste trabalho foi avaliada a potência de oito vacinas comerciais contra clostridioses que continham em sua composição C. tetani, pela titulação de antitoxina tetânica em soro de coelhos e cobaios vacinados, empregando-se a técnica de soroneutralização em camundongos. As vacinas codificadas como T2, T4, T5 e T8 apresentaram, em coelhos e cobaios, títulos superiores ao nível mínimo exigido no teste de 2,5 UI/ml, recomendado para controle desse produto. As vacinas T1, T3, T6 e T7 não induziram títulos protetores. Os resultados demonstram que 50% das vacinas contra C. tetani testadas, comercializadas no Brasil, foram ineficientes em estimular títulos sorológicos compatíveis com os níveis de teste recomendado.

Carbúnculo sintomático: ocorrência, evolução clínica e acompanhamento da recuperação de bovino acometido de manqueira

ABSTRACT Clostridium chauvoei infection typically develops in young cattle between 6 months and 2 years of age, and is rarely found affecting calves younger than 6 months of age. Mortality is nearly 100%. In the Clinic of Bovines and Small Ruminants of the FMVZ-USP, assistance was given to a one-year old beef calf with no definite race, vaccinated against Clostridium sp. The animal showed movement troubles of the right anterior member, gas presence with volume and temperature increase on the affected area. The animal was submitted to aseptical cleanliness on the affected region and treated with penicillin against C. chauvoei. Six months later the lesion was reduced and the animal showed only a moderate limp.

RESUMO Clostridium chauvoei causa uma infecção conhecida no Brasil como manqueira e geralmente desenvolve-se em bovinos entre os 6 meses e 2 anos de idade, raramente acomete animais com menos de 6 meses de vida, sendo que a mortalidade é de quase 100%. Um animal de um ano de idade e sem raça definida, vacinado contra as clostridioses entre 10 a 15 dias antes de ser atendido na Clínica de Bovinos do Centro de Pesquisa e Diagnóstico de Enfermidades de Ruminantes (CPDER), FMVZ-USP, apresentava dificuldade de locomoção do membro anterior direito, sendo que na região acometida observou-se mionecrose com crepitação ao toque, e alterações na temperatura do membro acometido. O animal foi tratado com antibioticoterapia sistêmica e limpeza do local da ferida obtendo cura das lesões após 6 meses do início do tratamento, sendo confirmado o diagnóstico de clostridiose pelo isolamento bacteriano do Clostridium chauvoei.

Eficácia de vacinas comerciais contra clostridioses frente ao desafio com Clostridium sordellii

Twelve commercial vaccines against clostridiosis commercialized in Brazil which have in their composition Clostridium sordellii were evaluated for efficacy. A standard monovalent bacterin was used as a reference test. Two of the tested vaccines (16.6%), codified as T6 and T8, gave the same results as the standard bacterin, protecting all the challenged animals. One vaccine (8.3%), codified as T10, after being retested was considered efficient. The remaining vaccines (75%), codified as T1, T2, T3, T4, T5, T7, T9, T11 and T12, were considered inefficient.

Determinou-se a eficácia de doze vacinas contra clostridioses comercializadas no Brasil que contêm em sua composição Clostridium sordellii, pelo método de desafio em cobaias imunizadas. Como referência dos testes, empregou-se uma bacterina monovalente padrão. Duas vacinas (16,6%), codificadas como T6 e T8, apresentaram resultado igual à bacterina padrão, protegendo todos os animais desafiados. Uma vacina (8,3%), codificada como T10, não atendeu aos requisitos mínimos exigidos no primeiro teste, mas após o reteste foi considerada eficiente. As demais vacinas (75%), codificadas como T1, T2, T3, T4, T5, T7, T9, T11 e T12, não foram eficientes.

Eficácia de vacinas comerciais contra clostridioses frente ao desafio com Clostridium sordellii

Twelve commercial vaccines against clostridiosis commercialized in Brazil which have in their composition Clostridium sordellii were evaluated for efficacy. A standard monovalent bacterin was used as a reference test. Two of the tested vaccines (16.6%), codified as T6 and T8, gave the same results as the standard bacterin, protecting all the challenged animals. One vaccine (8.3%), codified as T10, after being retested was considered efficient. The remaining vaccines (75%), codified as T1, T2, T3, T4, T5, T7, T9, T11 and T12, were considered inefficient.

Determinou-se a eficácia de doze vacinas contra clostridioses comercializadas no Brasil que contêm em sua composição Clostridium sordellii, pelo método de desafio em cobaias imunizadas. Como referência dos testes, empregou-se uma bacterina monovalente padrão. Duas vacinas (16,6%), codificadas como T6 e T8, apresentaram resultado igual à bacterina padrão, protegendo todos os animais desafiados. Uma vacina (8,3%), codificada como T10, não atendeu aos requisitos mínimos exigidos no primeiro teste, mas após o reteste foi considerada eficiente. As demais vacinas (75%), codificadas como T1, T2, T3, T4, T5, T7, T9, T11 e T12, não foram eficientes.

Evaluation of the potency of vaccines against Clostridium tetani commercialized in Brazil / Avaliação da potência de vacinas contra Clostridium tetani comercializadas no Brasil

Tetanus is an infectious neurological syndrome caused by the action of the tetanus toxin, produced by Clostridium tetani, which acts in the central nervous system, characterizing itself by a spastic paralysis scenario. The antibody response to the C. tetani component of eight commercial vaccines was evaluated by the mice serum neutralization test with rabbit and guinea pigs sera. T2, T4, T5 and T8 induced titles of C. tetani antitoxin superior to the recommended minimum title of 2.5 IU/ml. The vaccines T1, T3, T6 and T7 did not induce protection titles. A total of 50% of the C. tetani vaccines commercialized in Brazil were unable to induce the minimum antibody response recommended for the approval of the product.

O tétano é uma síndrome neurológica infecciosa ocasionada pela ação da toxina tetânica, produzida por Clostridium tetani, que age no sistema nervoso central, caracterizando-se por um quadro de paralisia espástica. Neste trabalho foi avaliada a potência de oito vacinas comerciais contra clostridioses que continham em sua composição C. tetani, pela titulação de antitoxina tetânica em soro de coelhos e cobaios vacinados, empregando-se a técnica de soroneutralização em camundongos. As vacinas codificadas como T2, T4, T5 e T8 apresentaram, em coelhos e cobaios, títulos superiores ao nível mínimo exigido no teste de 2,5 UI/ml, recomendado para controle desse produto. As vacinas T1, T3, T6 e T7 não induziram títulos protetores. Os resultados demonstram que 50% das vacinas contra C. tetani testadas, comercializadas no Brasil, foram ineficientes em estimular títulos sorológicos compatíveis com os níveis de teste recomendado.

Seleção de colônias de Clostridium perfringens tipo D produtoras de toxina épsilon por "dot blot"

Para seleção de amostras de Clostridium perfringens tipo D produtoras de toxina épsilon, padronizou-se o teste de dot blot com toxina épsilon adsorvida em membrana de nitrocelulose, anti-toxina épsilon, produzida em carneiro e anti-imunoglobulina de carneiro,produzida em coelho, marcada com peroxidase. A reação foi revelada utilizando-se Kit Substrato DAB 3,3 diaminobenzidina, e a leitura foi feita visualmente de acordo com a intensidade de cor obtida em cada poço. Foram selecionados clones produtores de toxina épsilon obtidos de unidades formadoras de colônias e, após três passagens, obteve-se títulos em dose mínima mortal (DMM) determinado em camundongos, 1000 vezes superiores aos obtidos com a amostra original. A presença do gene etx que codifica a síntese da toxina épsilon foi verificada pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e todos os clones foram positivos, mesmo aqueles negativos ao dot blot. O teste de dot blot mostrou-se eficiente para selecionar colônias toxigênicas de C. perfringens tipo D

In order to select strains of Clostridium perfringens type D producers for epsilon toxin, a dot blot was standardized test using epsilon toxin adsorbed in nitrocellulose membrane, anti-epsilon toxin produced in sheep and anti-immunoglobulin of sheep produced in rabbit conjugated with peroxidase. The reaction was visualized using DAB Substrate Kit 3,3 diaminobenzidine and the reading was made according to the intensity of color obtained in each well. Clones producing epsilon toxin were selected by limiting dilution and after three passages, mortal minimum dose (MMD) titres were determined in mice. Selected clones produced epsilon toxin 1000 times more concentrated those the original strain. The presence of the gene etx that encodes the synthesis of the epsilon toxin was verified by the polymerase chain reaction, and all clones were positive, including those negative at the dot blot. It was concluded that the dot blot test was efficient for selecting toxigenic colonies of C. perfringens type D

Indução experimental de enterotoxemia pelo Clostridium perfringens tipo D em bovinos

Desenvolveu-se protocolo de indução experimental da enterotoxemia em bovinos pelo C. perfringens tipo D e foram avaliados seus aspectos clínicos e patológicos. Foram utilizados 13 bezerros susceptíveis, divididos em quatro grupos e inoculados pela via intraduodenal (ID): Grupo 1(n=4) cultura completa de C. perfringens tipo D; Grupo 2 (n=3) células bacterianas de C. perfringens tipo D lavadas; Grupo 3 (n=5) sobrenadante da cultura de C. perfringens tipo D concentrado; Grupo 4 (n=1) meio para produção de toxina estéril. Os grupos 1,2 e 4 receberam 200 ml de solução de amido a 20% (ID). Sete animais apresentaram quadro agudo com sintomas de alterações do SNC e respiratórias. Curso subagudo foi observado em um animal. Dois animais apresentaram sintomas da doença e se recuperaram espontaneamente e três não adoeceram. Os achados de necropsia foram edema pulmonar intersticial e alveolar, efusões pericárdicas, alterações circulatórias discretas no mesentério, linfonodos mesentéricos, intestino e cérebro. Em um animal observou-se na região basal cerebral, cavidades bilaterais e simétricas na cápsula interna. Na histopatologia, as principais alterações foram edema perivascular proteináceo cerebral, edema pulmonar proteináceo alveolar, intersticial e perivascular, linfonodos mesentéricos reativos. No quadro subagudo foi diagnosticado encefalomalacia simétrica focal, localizada na cápsula interna e fibras tálamo-corticais. Os quadros clínicos se assemelharam aos dos ovinos e os achados histológicos, associados à sintomatologia e necropsia, são consistentes e importantes no estabelecimento do diagnóstico