Células fetais bovinas de cultivo primário submetidas a diferentes pressões negativas antes do congelamento em palhetas / Fetal bovine primary culture cells submitted to different negative pressures before straw freezing

O congelamento de células é uma importante ferramenta na preservação de espécies ameaçadas de extinção. Células fetais de cultivo primário obtidas de um bovino clone foram submetidas à pressão negativa (PN) de 200, 500 ou 800 mbar, imediatamente (PN0h) ou três horas antes (PN3h) do congelamento em palhetas finas, com 10% de DMSO como crioprotetor. Células frescas e congeladas sem submissão à PN foram utilizadas como controles. Avaliou-se a viabilidade pós-descongelamento, a curva de proliferação celular, assim como o tempo de duplicação da população (PDT) celular, a cada 24 horas, durante oito dias. Os dados obtidos foram submetidos ao teste de Tukey ou Qui quadrado (P≤0,05). A sobrevivência média dos grupos controle (89,8%) e PN500 0h (88,1%) foi superior aos outros grupos; o tempo de PDT foi semelhante nos grupos fresco (27,5 ± 0,35 h), controle congelado (30,1 ± 2,3 h) e PN500 0h (32,4 ± 1,6 h). O menor tempo foi observado no grupo PN800 0h (21,9 h). O congelamento de células fetais bovinas de cultivo primário, realizado em palhetas de 0,25 mL, com 10% de DMSO, possibilita elevadas taxas de sobrevivência após o descongelamento. A PN modifica a curva de crescimento de células criopreservadas, sendo que as intensidades de 200 ou 500 mbar, aplicadas imediatamente antes do congelamento das células, possibilitam curvas de proliferação semelhantes às obtidas com células frescas.

Cell cryopreservation is an important tool in the preservation of endangered species. Fetal bovine primary culture-obtained cells were subjected to negative pressure (NP) 200, 500 or 800 mbar, just before (NP0h) or 3 hours before (NP3h) freezing into fine (0.25 mL) straws, using 10% DMSO as cryoprotectant. Fresh and frozen fibroblasts non submitted to NP were used as controls. We evaluated cell viability after freezing, cell proliferation curve, and population doubling time (PDT) every 24 hours during 8 days. Data were submitted to Tukey or Chi square test (P≤ 0.05). The average survival of control group (89.8%) and NP500-0h (88.1%) was higher than other groups; the time of PDT was similar in the fresh (27.5 ± 0.35 h), frozen control (30.1 ± 2.3 h) and NP500-0h groups (32.4 ± 1.6 h). The lowest time was observed in the NP800-0h (21.9 h) group. Freezing of bovine fibroblasts into 0.25 mL straws with 10% DMSO enables high survival rates after thawing. The NP modifies the growth curve of cryopreserved cells and the intensities of 200 or 500 mbar, applied just before freezing the cells, allow proliferation curves similar to those obtained with fresh cells.

Células fetais bovinas de cultivo primário submetidas a diferentes pressões negativas antes do congelamento em palhetas / Fetal bovine primary culture cells submitted to different negative pressures before straw freezing

O congelamento de células é uma importante ferramenta na preservação de espécies ameaçadas de extinção. Células fetais de cultivo primário obtidas de um bovino clone foram submetidas à pressão negativa (PN) de 200, 500 ou 800 mbar, imediatamente (PN0h) ou três horas antes (PN3h) do congelamento em palhetas finas, com 10% de DMSO como crioprotetor. Células frescas e congeladas sem submissão à PN foram utilizadas como controles. Avaliou-se a viabilidade pós-descongelamento, a curva de proliferação celular, assim como o tempo de duplicação da população (PDT) celular, a cada 24 horas, durante oito dias. Os dados obtidos foram submetidos ao teste de Tukey ou Qui quadrado (P≤0,05). A sobrevivência média dos grupos controle (89,8%) e PN500 0h (88,1%) foi superior aos outros grupos; o tempo de PDT foi semelhante nos grupos fresco (27,5 ± 0,35 h), controle congelado (30,1 ± 2,3 h) e PN500 0h (32,4 ± 1,6 h). O menor tempo foi observado no grupo PN800 0h (21,9 h). O congelamento de células fetais bovinas de cultivo primário, realizado em palhetas de 0,25 mL, com 10% de DMSO, possibilita elevadas taxas de sobrevivência após o descongelamento. A PN modifica a curva de crescimento de células criopreservadas, sendo que as intensidades de 200 ou 500 mbar, aplicadas imediatamente antes do congelamento das células, possibilitam curvas de proliferação semelhantes às obtidas com células frescas.(AU)

Cell cryopreservation is an important tool in the preservation of endangered species. Fetal bovine primary culture-obtained cells were subjected to negative pressure (NP) 200, 500 or 800 mbar, just before (NP0h) or 3 hours before (NP3h) freezing into fine (0.25 mL) straws, using 10% DMSO as cryoprotectant. Fresh and frozen fibroblasts non submitted to NP were used as controls. We evaluated cell viability after freezing, cell proliferation curve, and population doubling time (PDT) every 24 hours during 8 days. Data were submitted to Tukey or Chi square test (P≤ 0.05). The average survival of control group (89.8%) and NP500-0h (88.1%) was higher than other groups; the time of PDT was similar in the fresh (27.5 ± 0.35 h), frozen control (30.1 ± 2.3 h) and NP500-0h groups (32.4 ± 1.6 h). The lowest time was observed in the NP800-0h (21.9 h) group. Freezing of bovine fibroblasts into 0.25 mL straws with 10% DMSO enables high survival rates after thawing. The NP modifies the growth curve of cryopreserved cells and the intensities of 200 or 500 mbar, applied just before freezing the cells, allow proliferation curves similar to those obtained with fresh cells.(AU)

ESTRATÉGIAS PARA AUMENTAR A VIABILIDADE DE EMBRIÕES SUÍNOS PRODUZIDOS IN VITRO E VITRIFICADOS

OHLWEILER, Lain Uriel. Estratégias para aumentar a viabilidade de embriões suínos produzidos in vitro e vitrificados. 2018, 72 p. Tese (Doutorado em Ciência Animal). Universidade do Estado de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. Lages, 2018. Os embriões suínos apresentam importantes particularidades, tanto de desenvolvimento quanto estruturais, as quais fazem com que a sua criopreservação seja menos eficaz que as outras espécies domésticas. Na primeira fase deste trabalho foi avaliado o efeito de diferentes gradientes de percoll durante a seleção dos espermatozoides utilizados na fecundação in vitro e sua influência no posterior desenvolvimento e qualidade embrionária. O maior gradiente avaliado (90/45) teve a menor produção e qualidade embrionária, baseado nas taxas de produção embrionária e expressão de receptores de estrógeno. O gradiente intermediário (80/40) proporcionou bons índices de produção e baixa mortalidade embrionária, associados a elevada qualidade embrionária. Já o menor gradiente (70/35) apresentou alta mortalidade embrionária. A segunda fase investigou o efeito e toxicidade de diferentes crioproteotres aos embriões suínos nos dias 5 ou 6 de cultivo. A toxicidade aos embriões está relacionada com o dia de cultivo, o agente crioprotetor, sua concentração e tempos de exposição. As menores concentrações de EG associado a DMSO são menos tóxicas e tão eficientes quanto o uso exclusivo de EG. A sacarose mostrou-se pouco tóxica a embriões dos dias 5 e 6 de cultivo. Na terceira fase, avaliou-se o efeito do estresse controlado por pressão negativa como estratégia para aumentar a viabilidade dos embriões. Quando o estresse foi aplicado aos oócitos na intensidade de 250 mBar houve maior produção embrionária, e menor índice de apotose nos blastômeros, baseado na expressão da caspse-3 clivada. No entanto, isto não se refletiu em maior criotolerância dos embriões. Quando o estresse foi aplicado diretamente nos blastocistos, somente a pressão de 500 mBar não prejudicou o desenvolvimento embrionário, também não afetando a criotolerância dos mesmos. Quando associadas: pressão negativa de 250 mBar no oócito e 500 mBar no embrião, houve aumento na criotolerância. Na quarta fase do estudo, foi avaliado o uso do nitrogênio super-resfriado na vitrificação de embriões, que não diferiu do nitrogênio convencional. Como conclusões, o gradiente de seleção espermática influencia na qualidade embrionária, sendo que embriões do dia 5 de cultivo possuem maior viabilidade que os embriões do dia 6. Os crioprotetores exercem níveis diferentes de toxicidade aos embriões, conforme a concentração, e é possível aumentar a viabilidade de embriões vitrificados através do uso de estresse controlado por pressão negativa.

OHLWEILER, Lain Uriel. Strategies to improve the viability of in vitro produced and vitrified porcine embryos. 2018, 72 p. Thesis (Doctorate in Animal Science). Santa Catarina State University. Post Graduate Program in Animal Science. Lages, 2018. The porcine embryos present important structural and developmental features that play a negative role in their cryotolerance, in comparison to the other domestic species. The first phase of this study aimed to evaluate the effect of different concentrations of the percoll gradient, in the outcome of in vitro fertilization and its influence in the further embryo development and quality. The highest concentration assessed (90/45) resulted in the lowest embryo production and quality, based in the embryo production rate and in the expression of estrogen receptor. The outcome of the intermediate gradient (80/40) was a good rate of embryo production, with low embryo mortality and high embryo quality; whereas the lowest gradient (70/35) presented high embryo mortality. The second phase of the study aimed to assess the toxic effect of different cryoprotectant agents, to either day 5 or day 6 porcine blastocysts. Embryo toxicity was affected by the cryoprotectant agent, concentration, lenght of exposure time, and age of embryos. Low concentrations of EG and DMSO associated were the least toxic, and as efficient as the use of EG alone. Sucrose showed to have low toxicity to embryos of days 5 and 6 of culture. The third phase of the study aimed to evaluate the effect of the controlled stress by negative pressure, as a strategy to increase embryo viability. When the oocytes were submitted to 250 mBar of negative pressure, there was an increase in embryo production and a decrease in the rate of apoptosis, based in the expression of cleaved caspase-3. Nonetheless, their cryotolerance was not affected. When the stress was applied in the blastocysts, only the pressure of 500 mBar did not decrease the embryo development rates, not affecting, however, their cryotolerance. In the other hand, when both steps of negative pressure were applied: 250 mBar to the oocyte and 500 mBar to the blastocyst, in a sequential association, there was an increase in embryo cryotolerance. The fourth phase of the study aimed to assess the use of super-cooled nitrogen for embryo vitrification. Results found showed no differences between conventional (normal atmosphere) and super-cooled nitrogen. As main conclusions, the sperm selection gradient plays a role in the embryo quality, being day 5 embryos more resistant than the ones at day 6. The cryoprotectant agents have different levels of toxicity to the embryos, what was dependant on its concentration. Also, it is possible to increase the viability of vitrified embryos by applying a controlled stress mediated by negative pressure.