Requirement of follicular estradiol for the onset of luteolysis in Bos indicus cows supplemented with progesterone at early diestrus

Em vacas de corte, a suplementação com progesterona injetável de longa ação (iP4) no diestro inicial tem efeitos paradoxais, uma vez que tanto aumenta a fertilidade a campo quanto induz a antecipação da luteólise em uma parte dos animais tratados. Considerando que o estradiol (E2) proveniente dos folículos ovarianos durante a fase luteal desempenha um papel central na indução da liberação de PGF2 uterina e regressão luteal, testou-se a hipótese central de que a ausência de folículos pós-desvio previne a antecipação do momento da luteólise e prolonga o ciclo estral em vacas Bos indicus suplementadas com iP4. Esta dissertação consiste em dois estudos. Um primeiro estudo foi realizado para validar a utilização de escovas citológicas (cytobrush) como uma ferramenta para coletar amostras sequenciais do endométrio para caracterizar as mudanças temporais no transcriptoma ao longo do ciclo estral. Concluiu-se que a técnica de cytobrush foi confirmada como um método confiável, repetível, e seguro para o estudo da biologia uterina bovina in vivo. No segundo estudo, vacas Nelore cíclicas foram sincronizadas e distribuídas em um arranjo fatorial 2 x 2 para receber tratamento com placebo ou 300 mg de iP4 três dias após a ovulação (D0), e serem submetidos ou não à aspiração folicular (AF) durante a fase lútea. Amostras endometriais foram coletadas no D15, D17 e D19 usando a técnica de cytobrush, e a abundância de transcritos foi medida por qPCR. A iP4 diminuiu o tamanho do maior folículo no D6 e a área do CL entre D8 e D10 comparado aos grupos placebo. Vacas submetidas à AF tiveram um ciclo mais longo, porém o momento da luteólise foi semelhante ao das vacas não aspiradas. O tratamento com iP4 e AF tendeu a adiantar o momento da regressão lútea estrutural ( D16). Além disso, nos momentos precedentes à luteólise (D11 ao D16), vacas desse grupo detectadas em luteólise antes ou no D16 apresentaram um CL menor em comparação com vacas do mesmo grupo em luteólise após o D16. Adicionalmente, vacas tratadas com iP4 com luteólise precoce apresentaram um menor CL ao longo da fase lútea. Não houve diferenças significativas na abundância de transcritos endometriais relacionados com a programação (PGR, ESR1) ou execução (OXTR, PTGS2) da liberação de PGF2. Em resumo, a suplementação com iP4 no início do diestro afetou o crescimento do CL mas não modulou os transcritos endometriais associados com a luteólise, sugerindo que o componente uterino pode não estar envolvido neste processo. Conclui-se que CLs comprometidos pela exposição à iP4 durante a luteogênese são mais susceptíveis à regredir antecipadamente, e isto pode ser exacerbado por baixas concentrações de E2 resultantes da AF. Em conclusão, rejeitamos a hipótese de que a redução do E2 folicular previne a antecipação da luteólise induzida pela iP4 em vacas Bos indicus.

In beef cows, long-acting injectable progesterone (iP4) supplementation in the early diestrus has paradoxical effects, as it both increases fertility in the field as well as induces anticipation of luteolysis in part of the treated animals. Considering that estradiol (E2) from the ovarian follicles during the luteal phase plays a central role in the induction of uterine PGF2 release and luteal regression, here we tested the central hypothesis that the absence of post-deviation follicles (i.e., a low E2 tone) delays the early onset of luteolysis and extends the estrous cycle in Bos indicus cows supplemented with iP4. This dissertation consists of two studies. A first study was carried out to validate the use of cytologic brushes (cytobrush) as a tool to collect sequential samples of endometrium to characterize temporal changes in the transcriptome along the estrous cycle. It was concluded that the cytobrush technique was confirmed as a reliable, repeatable, and safe method for studying bovine uterine biology in vivo. In the second study, cyclic Nelore cows were synchronized and distributed in a 2 x 2 factorial arrangement to receive treatment with placebo or 300 mg iP4 three days after ovulation (D0), and to be subjected or not to follicular aspiration (FA) during the luteal phase. Endometrial samples were collected on D15, D17 and D19 using the cytobrush technique, and abundance of transcripts was measured by qPCR. The iP4 decreased the size of the largest follicle on D6 and the area of the CL between D8 and 10 compared to the placebo groups. Cows submitted to FA had a longer cycle but timing of luteolysis was similar to non-FA cows. Treatment with iP4 and submitted to FA tended to advance the timing of structural luteal regression ( D16). Furthermore, in the moments preceding luteolysis (D11 to D16), cows from this group that underwent luteolysis before or at D16 presented a smaller CL compared with cows of the same group that underwent luteolysis after D16. In addition, cows treated with iP4 that presented early luteolysis had a smaller CL across the luteal phase. There were no significant differences in the abundance of endometrial transcripts related to programming (PGR, ESR1) or execution (OXTR, PTGS2) of PGF2 release. In summary, supplementation of P4 at early diestrus affected CL growth but did not modulate endometrial transcripts associated with luteolysis, suggesting that the uterine component might not be involved in this process. It is concluded that CLs impaired by exposure to iP4 during luteogenesis are most likely to undergo early luteal regression, and this may be exacerbated by low E2 concentrations resulting from FA. In conclusion, we rejected the hypothesis that reduced follicular E2 could prevent iP4-induced early onset of luteolysis in Bos indicus cows.

EXPRESSÃO GÊNICA DE CITOCINAS NO ENDOMÉTRIO BOVINO PRÉ-SENSIBILIZADO COM ANTÍGENOS MATERNOS E PATERNOS E NA INFLAMAÇÃO SUBCLÍNICA

Infecções uterinas logo após o parto e perdas embrionárias relacionadas a falhas na imunotolerância ao concepto no início da gestação são importantes causas de baixa eficiência reprodutiva na bovinocultura. No presente estudo objetivou-se comparar a expressão dos genes CCL5, IL-8, IL-6 e IL-1 na mucosa endometrial com e sem inflamação, em regiões caruncular e intercaruncular, utilizando os métodos de coleta biopsia e cytobrush endometriais. Vinte úteros foram inseridos no experimento após avaliação da porcentagem de células polimorfonucleares (PMNs) na citologia endometrial, sendo dez sem a presença de PMNs (inflamação endometrial ausente), sete com PMNs variando entre 11 e 19% (inflamação endometrial leve) e três com PMNs entre 75 e 81% (inflamação endometrial grave). Após a coleta das amostras, foi feita a extração dos RNAs, em seguida realizada a transcrição reversa e a reação de qPCR para a quantificação da expressão gênica. Não foi observada diferença na expressão gênica entre as regiões carunculares e intercarunculares e a expressão foi dependente do grau de inflamação. Inflamações leves não apresentaram diferenças significativas em relação aos úteros não inflamados, existindo diferença apenas nas inflamações graves, tanto em amostras por biopsia como cytobrush. Houve influência da técnica de coleta de endométrio na expressão gênica somente na inflamação grave, sendo os melhores resultados observados em amostras colhidas por cytobrush. Este trabalho também teve como objetivo compreender os mecanismos da imunotolerância uterina ao concepto por meio de análise da expressão dos genes IL-1, IL-2, IL-6, IL-17, IFNG e LIF, e o perfil destes durante o início da gestação. Foram utilizadas 45 vacas sincronizadas ao estro, submetidas à indução imunológica intrauterina, administrada no D0 (dia do estro), sendo quatro tratamentos: sêmen, PBMCs (células mononucleares de sangue periférico), sêmen e PBMCs e controle (sem indução). As biópsias uterinas in vivo foram coletadas em três momentos, D0 (sem indução imunológica) e dia sete (D7) e 14 (D14) após a estimulação imunológica. Após a indução imunológica, a expressão de RNAm do gene IL-1 reduziu significativamente em todos os grupos sensibilizados em comparação ao controle. O gene IL-2 apresentou maior expressão somente na indução com sêmen. Observou-se também que a expressão dos genes IL-1 e IL-2 variaram significativamente entre D0, D7 e D14 do ciclo estral. O gene IL-6 não apresentou variações de expressão entre as induções imunológicas e nem durante os primeiros 14 dias do ciclo estral. O resultados dos genes IL-17, IFNG e LIF foram inconclusivos. Conclui-se que a identificação de inflamações uterinas por meio de expressão gênica só foi possível nos casos graves, sendo os melhores resultados observados em amostras colhidas por cytobrush. E que a expressão dos genes IL-1 e IL-2 podem ser modulados por imunoindução, sugerindo que a sensibilização imunológica pode contribuir com o sucesso da gestação.

Uterine infections soon after delivery and embryonic losses related to failures in the immunotolerance to the concept at the beginning of gestation are important causes of low reproductive efficiency in bovine breeding. The aim of this study was to compare the expression of the CCL5, IL-8, IL-6 and IL-1 genes in the endometrial mucosa with and without inflammation in the caruncular and intercaruncular regions using endometrial biopsy and cytobrush collection methods. Twenty uteri were used in the experiment after evaluation of the percentage of polymorphonuclear cells (PMNs) in endometrial cytology, being ten without PMNs, seven with PMNs ranging from 11 to 19% (soft endometrial inflammation) and three with PMNs between 75 and 81% (severe endometrial inflammation). These samples were collected, its RNAs were extracted, and then the reverse transcription and the qPCR reaction were performed for the quantification of the gene expression. No difference was observed in the gene expression between the caruncular and intercaruncular regions and the expression was dependent on the degree of inflammation. Soft inflammations did not present significant differences in comparison to uninflamed uteri. On the other hand, severe inflammation presented difference in comparison to the control group, independent of the collection method, biopsy or cytobrush. The influence of the endometrial collection technique in the gene expression was observed only in the severe inflammation, and the best results were observed in samples collected by cytobrush. This study had also the objective to understand the mechanisms of uterine immunotolerance to the concept by analyzing the IL-1, IL-2, IL-6, IL-17, IFNG and LIF gene expression during the early gestation. Forty-five cows synchronized to estrus were submitted to intrauterine immunological induction, administered in D0 (estrus day), with four treatments: semen, PBMCs, semen and PBMCs and control (without induction). In vivo uterine biopsies were collected at three different times: the first at D0 (no immunological induction), the second at day seven (D7) and the final one at day 14 (D14) after immunological stimulation. After immunological induction, IL-1 mRNA expression was significantly reduced in all sensitized groups when compared to control. The IL-2 gene presented greater expression only in semen induction. It was likewise observed that IL-1 and IL-2 gene expression varied significantly between D0, D7 and D14 of the estrous cycle. The IL-6 gene did not show expression variations from the immunological inductions nor during the first 14 days of the estrous cycle. The results of the IL-17, IFNG and LIF genes were inconclusive. It was concluded that the identification of uterine inflammation through gene expression is only possible in severe cases, and the best results are observed in samples collected by cytobrush. In addition, the IL-1 and IL-2 gene expression can be modulated by immune-induction, suggesting that immunological sensitization may contribute to the success of gestation.

Avaliação da técnica de esfoliação com escova citológica para coleta de células conjuntivais em gatos sadios: comparação entre a face palpebral da membrana nictitante e a conjuntiva palpebral / Evaluation of the exfoliative cytology technique using cytobrush in healthy cats: Comparison between palpebral surface of nictitating membrane and palpebral conjunctiva

A citologia conjuntival é um importante meio de diagnóstico de afecções da superfície ocular. Buscam-se técnicas que forneçam quantidade e qualidade celular, com uso de instrumentos que provoquem mínimo trauma e que diminuam as chances de danos iatrogênicos ao olho. Existem diversas técnicas de coleta de células, entre elas encontram-se: impressão, esfoliação e punção por agulha fina. Dentre os métodos utilizados para esfoliação, o uso da escova citológica fornece resultados superiores em vários parâmetros, incluindo a qualidade das células. Estudou-se a citologia conjuntival por esfoliação com escova citológica, utilizada para coleta de material da cérvix uterina, tendo como objetivos determinar se tal instrumento se adequaria à coleta de material da face palpebral da membrana nictitante e da conjuntiva palpebral de felinos sadios. Foram avaliados os seguintes parâmetros: facilidade de execução da técnica, possibilidade de ocorrência de danos iatrogênicos e quantidade e qualidade de células coletadas. Cinquenta gatos machos (58%) e fêmeas (42%), com ou sem raça definida, participaram do estudo. Apenas gatos isentos de alterações oculares no exame físico foram incluídos. A escova citológica se mostrou um instrumento de fácil utilização, que fornece células em quantidade satisfatória e com morfologia preservada. Comparada a conjuntiva palpebral, a face palpebral da membrana nictitante se mostrou um local mais adequado à realização da coleta de amostras citológicas, pela maior facilidade de execução da técnica e menor possibilidade de danos iatrogênicos. No que diz respeito à quantidade e qualidade celular, não houve diferença significativa entre os dois locais de coleta. Foi possível observar células provenientes das diferentes camadas do epitélio conjuntival com predomínio de células intermediárias e ausência de células caliciformes.(AU)

Conjunctival cytology is an important diagnostic method for ocular superficial diseases. There are several techniques to collect cells, including impression, exfoliation and fine needle aspiration. These techniques have shown individual variations depending on method and instrument used on the collection process. Techniques with instruments that cause low damage and decrease iatrogenic damage risks to the eyes, providing cellular quantity and quality, are wanted. Exfoliative cytology techniques are frequently used in human and veterinary medicine. Among the methods used for exfoliation, cytobrush provides better results on many parameters, including cell quality. The use of conjunctival exfoliation cytology using cytobrush (brush usually used for cervix cytology) was investigated. The aim was to determine if this technique would provide an adequate number and quality of conjunctival third eyelid cells of cats; to compare these samples with those collected by the same way from conjunctival area and to determine a cytologic pattern of this region. This comparison would provide information about technique security, possible damage risks and collected cells characteristics. Cats were evaluated through physical and routine ophthalmic exam. Fifty domestic cats, males (58%) and females (42%), of any breed were accepted. In the study were included only animals free of ocular and systemic changes. Cytobrush showed an easy and usefulness instrument, that provides satisfactory amount of cells with preserved morphology. Compared to palpebral conjunctiva, palpebral surface of nictitating membrane showed a most adequate site to cytological sample collect, greater facility of technical perform and smaller possibility of iatrogenic damage. In respect to quality and quantity of cells there was no significant difference between collect sites. It was possible to observe epithelial cells of conjunctiva from different stratum with predominance of intermediate cells and absence of goblet cells.(AU)

Estudo Comparativo de Técnicas Citológicas Aplicadas ao Diagnóstico de Formações Orais em Cães

A casuística de neoplasmas orais em cães é elevada e ocupa o quarto lugar em ocorrência de todas os neoplasmas diagnosticados nos cães e gatos. Os sinais clínicos mais frequentes são halitose, disfagia, sialorreia, dor e edema facial. O procedimento diagnóstico mais utilizado nestas situações é a histopatologia, uma alternativa diagnóstica à avaliação citológica, menos invasiva, mais rápida e de menor custo, com a vantagem adicional de prescindir de anestesia geral e possibilitar, a partir de um diagnóstico prévio, o adequado planejamento do ato cirúrgico. No entanto, são escassos no âmbito veterinário, estudos relativos ao método de colheita mais adequado para o diagnóstico citológico de formações bucais caninas. Neste estudo avaliou-se a eficácia diagnóstica associada a quatro métodos de colheita: decalque, escovação, escarificação e punção aspirativa por agulha fina, a partir de formações bucais provenientes de 12 cães. Predominaram lesões fibrocíticas benignas. As amostras citológicas foram examinadas com o uso de escores, avaliando-se os resultados com tabelas de contingência 2x2. Todas as técnicas apresentaram elevada especificidade, com sensibilidade inferior em amostras colhidas por decalque. A colheita por escovação ofereceu resultados mais favoráveis, associando celularidade, representatividade e preservação celulares, apresentando-se como uma alternativa de eleição para o diagnóstico preliminar de formações bucais em cães