Taxonomic status of Tamarinus imperator subgrisescens (Lönnberg, 1940) (Cebidae, Callitrichinae)

The emperor tamarin, Tamarinus imperator, is composed of two subspecies, the nominal type, T. i. imperator, distribut-ed between the Acre and Purus Rivers, whose range is limited between the Brazilian state of Acre and Peru are unbounded, and T. i. subgrisescens, occurring in Peru, Bolivia, and Brazil, in the Brazilian states of Acre and Amazonas. Morphologically, both taxa are easily identifiable by the pelage pattern (chromogenetic fields), and even being easily distinguishable, both lineages are con-sidered subspecies according to the criterion based on the Biological Concept of Species from the 1970s, even without presenting some necessary criteria, such as the intergradation zone. Here we analyzed pelage traits, cranial morphometry, Cytochrome-b di-vergence, and distributional pattern data applying the premises of integrative taxonomy to elucidate the taxonomic status of both lineages. We hypothesize that both lineages are considered full species through a series of criteria for species recognition, such as distinguishability, level of phenotypical divergences of several morphological complexes with congruence among them, and some genetic divergence. The hybridization is unknown and the low or the lack of sampling in target areas does not allow us to determine whether a hybridization or even contact zone between the two lineages exists indeed. All character sets analyzed were congruent with each other and reinforced the high level of divergences between the two subspecies including several pelage differences, mor-phometry (descriptive statistics, PCA, and MANOVA), and mitochondrial DNA Cytochrome-b divergence. Most of the distribution in both lineages are allopatric, and the levels of intra-lineage phenotypical variation are much lower than between the lineages.(AU)

Diagnostic locus for identification of silverside hybrids (Odontesthes humensis and Odontesthes bonariensis) in a natural population / Locus diagnóstico para identificação de híbridos de peixe-rei (Odontesthes humensis and Odontesthes bonariensis) em população natural

Hybridization is a natural phenomenon that occurs more often in fish than in other vertebrates. The use of nuclear and mitochondrial molecular markers provides valuable results in the detection of these events. The aim of this study was to investigate the occurrence of interspecific hybrids in natural populations of silverside. The samples of Odontesthes humensis, Odontesthes bonariensis, and indivi-duals that were morphologically different from pure species were collected in the Mangueira lagoon, located in southern Brazil. Result: Six tetranucleotide microsatellite loci were synthesized and tested. The UFPEL_OH3 locus proved to be diagnostic for the detection of silverside hybrids, and it was possi-ble to distinguish between pure and hybrid species. The mitochondrial marker gene cytb synthesized from conserved Odontesthes sequences in the GenBank genetic database showed no differences in the genetic sequence of the samples, needing further studies to confirm the hypothesis.(AU)

A hibridação é um fenômeno natural que ocorre mais frequentemente em peixes do que em outros vertebrados. Para detectá-la, são utilizados marcadores moleculares nucleares e mitocondriais, os quais fornecem resultados valiosos. O objetivo deste estudo foi investigar a ocorrência de híbridos in-terespecíficos em populações naturais de peixe-rei. As amostras de Odontesthes humensis, Odontesthes bonariensis e de indivíduos morfologicamente diferentes das espécies puras foram coletadas na lagoa Mangueira, localizada no Sul do Brasil. Foram sintetizados e testados seis loci microssatélites tetranu-cleotídeos. O locus UFPEL_OH3 mostrou-se um diagnóstico para detectar híbridos de peixe-rei, pos-sibilitando a distinção de espécies puras de híbridas. O marcador mitocondrial gene cytb, sintetizado com base nas sequências conservadas de Odontesthes no banco de dados genéticos do GenBank, não apresentou diferenças na sequência genética das amostras, portanto, são necessários mais estudos para confirmar a hipótese de hibridação.(AU)

Molecular characterization and genetic relationships of seven piranha species of the genera Serrasalmus and Pygocentrus (Characiformes: Serrasalmidae) from Paraná-Paraguay, São Francisco and Tocantins river basins in Brazil / Caracterização molecular e relações genéticas de sete espécies de piranhas dos gêneros Serrasalmus e Pygocentrus (Characiformes: Serrasalmidae) das bacias hidrográficas Paraná-Paraguai, São Francisco e Tocantins, no Brasil

Genetic and phylogenetic relationships among seven piranha species of the genera Serrasalmus and Pygocentrus from the Paraná-Paraguay, São Francisco and Tocantins River basins were evaluated in the present study by partial sequences of two mitochondrial genes, Cytochrome b and Cytochrome c Oxidase I. Phylogenetic analysis of Maximum-Likelihood and Bayesian inference were performed. Results indicated, in general, greater genetic similarity between the two species of Pygocentrus (P. nattereri and P. piraya), between Serrasalmus rhombeus and S. marginatus and between S. maculatus, S. brandtii and S. eigenmanni. Pygocentrus nattereri, S. rhombeus and S. maculatus showed high intraspecific genetic variability. These species have each one, at least two different mitochondrial lineages that, currently, occur in sympatry (S. rhombeus) or in allopatry (P. nattereri and S. maculatus). Species delimitation analysis and the high values of genetic distances observed between populations of S. rhombeus and of S. maculatus indicated that each species may corresponds to a complex of cryptic species. The non-monophyletic condition of S. rhombeus and S. maculatus reinforces the hypothesis. The geographic distribution and the genetic differentiation pattern observed for the piranha species analyzed herein are discussed regarding the geological and hydrological events that occurred in the hydrographic basins.(AU)

Relações genéticas e filogenéticas de sete espécies de piranhas dos gêneros Serrasalmus e Pygocentrus das bacias hidrográficas Paraná-Paraguai, São Francisco e Tocantins foram avaliadas com base em sequências parciais dos genes mitocondriais Citocromo b e Citocromo c Oxidase I. Foram realizadas análises filogenéticas de Máxima Verossimilhança e de inferência Bayesiana. Os resultados indicaram, em geral, maior similaridade genética entre as duas espécies de Pygocentrus (P. nattereri e P. piraya), entre Serrasalmus rhombeus e S. marginatus e entre S. maculatus, S. brandtii e S. eigenmanni. Pygocentrus nattereri, S. rhombeus e S. maculatus revelaram ter alta variabilidade genética intraespecífica. Essas espécies têm, cada uma, pelo menos duas linhagens mitocondriais que, atualmente, ocorrem em simpatria (S. rhombeus) ou alopatria (P. nattereri e S. maculatus). Análises de delimitação de espécies e os altos valores de distância genética observados entre as populações de S. rhombeus e de S. maculatus indicam que cada espécie pode, na verdade, corresponder a um complexo de espécies crípticas. A condição não-monofilética de S. rhombeus e S. maculatus reforça essa hipótese. A distribuição geográfica e o padrão de diferenciação genética observados para as espécies de piranhas analisadas são discutidos com relação aos eventos geológicos e hidrológicos que ocorreram nas bacias hidrográficas.(AU)

Molecular characterization and genetic relationships of seven piranha species of the genera Serrasalmus and Pygocentrus (Characiformes: Serrasalmidae) from Paraná-Paraguay, São Francisco and Tocantins River basins in Brazil

Abstract Genetic and phylogenetic relationships among seven piranha species of the genera Serrasalmus and Pygocentrus from the Paraná-Paraguay, São Francisco and Tocantins River basins were evaluated in the present study by partial sequences of two mitochondrial genes, Cytochrome b and Cytochrome c Oxidase I. Phylogenetic analysis of Maximum-Likelihood and Bayesian inference were performed. Results indicated, in general, greater genetic similarity between the two species of Pygocentrus (P. nattereri and P. piraya), between Serrasalmus rhombeus and S. marginatus and between S. maculatus, S. brandtii and S. eigenmanni. Pygocentrus nattereri, S. rhombeus and S. maculatus showed high intraspecific genetic variability. These species have each one, at least two different mitochondrial lineages that, currently, occur in sympatry (S. rhombeus) or in allopatry (P. nattereri and S. maculatus). Species delimitation analysis and the high values of genetic distances observed between populations of S. rhombeus and of S. maculatus indicated that each species may corresponds to a complex of cryptic species. The non-monophyletic condition of S. rhombeus and S. maculatus reinforces the hypothesis. The geographic distribution and the genetic differentiation pattern observed for the piranha species analyzed herein are discussed regarding the geological and hydrological events that occurred in the hydrographic basins.

Resumo Relações genéticas e filogenéticas de sete espécies de piranhas dos gêneros Serrasalmus e Pygocentrus das bacias hidrográficas Paraná-Paraguai, São Francisco e Tocantins foram avaliadas com base em sequências parciais dos genes mitocondriais Citocromo b e Citocromo c Oxidase I. Foram realizadas análises filogenéticas de Máxima Verossimilhança e de inferência Bayesiana. Os resultados indicaram, em geral, maior similaridade genética entre as duas espécies de Pygocentrus (P. nattereri e P. piraya), entre Serrasalmus rhombeus e S. marginatus e entre S. maculatus, S. brandtii e S. eigenmanni. Pygocentrus nattereri, S. rhombeus e S. maculatus revelaram ter alta variabilidade genética intraespecífica. Essas espécies têm, cada uma, pelo menos duas linhagens mitocondriais que, atualmente, ocorrem em simpatria (S. rhombeus) ou alopatria (P. nattereri e S. maculatus). Análises de delimitação de espécies e os altos valores de distância genética observados entre as populações de S. rhombeus e de S. maculatus indicam que cada espécie pode, na verdade, corresponder a um complexo de espécies crípticas. A condição não-monofilética de S. rhombeus e S. maculatus reforça essa hipótese. A distribuição geográfica e o padrão de diferenciação genética observados para as espécies de piranhas analisadas são discutidos com relação aos eventos geológicos e hidrológicos que ocorreram nas bacias hidrográficas.

Molecular characterization and genetic relationships of seven piranha species of the genera Serrasalmus and Pygocentrus (Characiformes: Serrasalmidae) from Paraná-Paraguay, São Francisco and Tocantins River basins in Brazil

Abstract Genetic and phylogenetic relationships among seven piranha species of the genera Serrasalmus and Pygocentrus from the Paraná-Paraguay, São Francisco and Tocantins River basins were evaluated in the present study by partial sequences of two mitochondrial genes, Cytochrome b and Cytochrome c Oxidase I. Phylogenetic analysis of Maximum-Likelihood and Bayesian inference were performed. Results indicated, in general, greater genetic similarity between the two species of Pygocentrus (P. nattereri and P. piraya), between Serrasalmus rhombeus and S. marginatus and between S. maculatus, S. brandtii and S. eigenmanni. Pygocentrus nattereri, S. rhombeus and S. maculatus showed high intraspecific genetic variability. These species have each one, at least two different mitochondrial lineages that, currently, occur in sympatry (S. rhombeus) or in allopatry (P. nattereri and S. maculatus). Species delimitation analysis and the high values of genetic distances observed between populations of S. rhombeus and of S. maculatus indicated that each species may corresponds to a complex of cryptic species. The non-monophyletic condition of S. rhombeus and S. maculatus reinforces the hypothesis. The geographic distribution and the genetic differentiation pattern observed for the piranha species analyzed herein are discussed regarding the geological and hydrological events that occurred in the hydrographic basins.

Resumo Relações genéticas e filogenéticas de sete espécies de piranhas dos gêneros Serrasalmus e Pygocentrus das bacias hidrográficas Paraná-Paraguai, São Francisco e Tocantins foram avaliadas com base em sequências parciais dos genes mitocondriais Citocromo b e Citocromo c Oxidase I. Foram realizadas análises filogenéticas de Máxima Verossimilhança e de inferência Bayesiana. Os resultados indicaram, em geral, maior similaridade genética entre as duas espécies de Pygocentrus (P. nattereri e P. piraya), entre Serrasalmus rhombeus e S. marginatus e entre S. maculatus, S. brandtii e S. eigenmanni. Pygocentrus nattereri, S. rhombeus e S. maculatus revelaram ter alta variabilidade genética intraespecífica. Essas espécies têm, cada uma, pelo menos duas linhagens mitocondriais que, atualmente, ocorrem em simpatria (S. rhombeus) ou alopatria (P. nattereri e S. maculatus). Análises de delimitação de espécies e os altos valores de distância genética observados entre as populações de S. rhombeus e de S. maculatus indicam que cada espécie pode, na verdade, corresponder a um complexo de espécies crípticas. A condição não-monofilética de S. rhombeus e S. maculatus reforça essa hipótese. A distribuição geográfica e o padrão de diferenciação genética observados para as espécies de piranhas analisadas são discutidos com relação aos eventos geológicos e hidrológicos que ocorreram nas bacias hidrográficas.

Diagnostic Cytochrome b gene profiles for the identification of paca (Cuniculus paca) bushmeat: implications for the monitoring of illegal hunting and wildlife trade / Perfis diagnósticos do gene Citocromo b para a identificação molecular de paca (Cuniculus paca): implicações para a detecção e monitoramento de caça e comércio ilegal

Abstract Paca (Cuniculus paca Linnaeus, 1766) is the second largest rodent found in Brazil. The quality of the meat and a long tradition of hunting have contributed to the decline of the natural populations of this species. Hunting of paca is strictly prohibited in Brazil, but in spite of this restriction, no forensic tools are available for the identification of the meat. We describe an efficient method, based on single nucleotide polymorphisms of the cytochrome b gene, that can be used to differentiate biological material derived from paca from those of domestic species commonly used as sources of meat. The identification of the presence of C. paca in the samples was 100% reliable.(AU)

Resumo Paca (Cuniculus paca Linnaeus, 1766) é o segundo maior roedor brasileiro. A qualidade da carne e a forte tradição da caça de subsistência são fatores que contribuem significativamente para o declínio das populações. Apesar da proibição a caça no Brasil, no momento ainda não há ferramentas disponíveis para identificar a carne e seus produtos como prova forense. Neste trabalho propomos um método eficaz de identificação, baseado em polimorfismos de único nucleotídeo no gene Citocromo b, objetivando diferenciar material biológico de paca das espécies domésticas comumente utilizadas como alimento no Brasil. A identificação das amostras de paca foram possíveis em 100% das amostras analisadas.(AU)

Diagnostic Cytochrome b gene profiles for the identification of paca (Cuniculus paca) bushmeat: implications for the monitoring of illegal hunting and wildlife trade

Abstract Paca (Cuniculus paca Linnaeus, 1766) is the second largest rodent found in Brazil. The quality of the meat and a long tradition of hunting have contributed to the decline of the natural populations of this species. Hunting of paca is strictly prohibited in Brazil, but in spite of this restriction, no forensic tools are available for the identification of the meat. We describe an efficient method, based on single nucleotide polymorphisms of the cytochrome b gene, that can be used to differentiate biological material derived from paca from those of domestic species commonly used as sources of meat. The identification of the presence of C. paca in the samples was 100% reliable.

Resumo Paca (Cuniculus paca Linnaeus, 1766) é o segundo maior roedor brasileiro. A qualidade da carne e a forte tradição da caça de subsistência são fatores que contribuem significativamente para o declínio das populações. Apesar da proibição a caça no Brasil, no momento ainda não há ferramentas disponíveis para identificar a carne e seus produtos como prova forense. Neste trabalho propomos um método eficaz de identificação, baseado em polimorfismos de único nucleotídeo no gene Citocromo b, objetivando diferenciar material biológico de paca das espécies domésticas comumente utilizadas como alimento no Brasil. A identificação das amostras de paca foram possíveis em 100% das amostras analisadas.

PROSPECÇÃO DE REGIÕES INFORMATIVAS DO GENOMA MITOCONDRIAL DE CERVIDAE

A tribo Odocoileini é o grupo mais heterogêneo, com maiores problemas e controvérsias taxonômicas dos cervídeos. Ela é dividida em duas subtribos bem suportadas: Odocoileina e Blastocerina. Todos os cervídeos da região Neotropical são da tribo Odocoileini e suas espécies representantes destacam-se pela ampla variedade morfológica e de habitats. Dentre as espécies tem Mazama gouazoubira (veado-catingueiro) a qual possui uma grande amplitude em sua distribuição geográfica e na diversidade de habitats que ocupa. No Brasil pode ocupar quase todos os biomas, exceto a Amazônia. O veado-catingueiro apresenta ainda variações regionais, ecológicas e individuais de coloração, além de uma alta diversidade haplotípica. Por essa razão análises genéticas são importantes, já que, fornecem informações valiosas para taxonomia e para determinação da existência de estruturação populacional e, consequentemente, unidades evolutivamente significativas distintas. Para tanto, primers foram confeccionados a partir das sequências existentes (Genbank) e das produzidas no presente projeto em uma análise in silico das sequências das regiões Citocromo B, ND5, ND2 e D-loop (região controle) do DNA mitocondrial, visto que já se conhece o mitogenoma da espécie. As sequências foram alinhadas com as várias existentes para a mesma espécie e de espécies distintas, buscando-se áreas polimórficas flanqueadas por regiões conservadas. Prospectamos primers que permitam amplificação de pequenos fragmentos (150-250pb) informativos das diferentes regiões. Os primers foram utilizados para amplificação do mtDNA em amostras de fezes de veado-catingueiro, sendo testada a eficiência de amplificação para os diferentes marcadores. Também foram realizadas duas análises Máxima Verossimilhança e a Inferência Bayesiana para confirmação dos sinais filogenéticos e uma rede de haplotipos para analises intrapopulacionais das matrizes dos fragmentos separados e concatenadas. Nossos resultados mostraram que os marcadores testados possuem sinal filogenético relevante para estudos filogenéticos preliminares, identificação de gêneros e populações, principalmente quando a amostra contém pouco DNA de qualidade. Os fragmentos das regiões podem apresentar resultados de diversidade genética similares ao da região completa, a diversidade depende do local da região onde fragmento se encontra. Os amplicons menores tem maior facilidade de amplificação no material fecal e que sua concatenação pode gerar um marcador de importância para análises filogenéticas em cervídeos.

The Odocoileini tribe is the most heterogeneous group, with the greatest taxonomic problems and controversies among deer. It is divided into two well-supported subtribes: Odocoilein and Blastocerin. All deer in the Neotropical region are from the Odocoileini tribe and their representative species stand out for their wide morphological and habitat variety. Among the species there is Mazama gouazoubira (brocket deer) which has a wide range of geographic distribution and the diversity of habitats it occupies. In Brazil it can occupy almost all biomes, except for the Amazon. The brocket deer also presents regional, ecological and individual color variations, in addition to a high haplotype diversity. For this reason genetic analyzes are important, as they provide valuable information for taxonomy and for determining the existence of population structure and, consequently, distinct evolutionarily significant units. For this purpose, primers were made from existing sequences (Genbank) and those produced in this project in an in silico analysis of sequences from the Cytochrome B, ND5, ND2 and D-loop (control region) regions of the mitochondrial DNA, since the mitogenome of the species is known. The sequences were aligned with the several existing ones for the same species and from different species, looking for polymorphic areas flanked by conserved regions. We are looking for primers that allow the amplification of small fragments (150-250bp) that are informative from different regions. The primers were used for mtDNA amplification in brocket deer feces samples, and the amplification efficiency for the different markers was tested. Two Maximum Likelihood analyzes and Bayesian Inference were also performed to confirm the phylogenetic signals and a haplotype network for intrapopulation analyzes of the matrices of the separated and concatenated fragments. Our results showed that the tested markers have a relevant phylogenetic signal for preliminary phylogenetic studies, identification of genera and populations, especially when the sample contains little quality DNA. The fragments of the regions can show similar genetic diversity results to the complete region, the diversity depends on the location of the region where the fragment is found. Smaller amplicons are easier to amplify in fecal material and their concatenation can generate an important marker for phylogenetic analysis in deer.

Estimativa da diversidade genética do peixe-rei (Odontesthes humensis e Odontesthes bonariensis) por marcadores de microssatélite e CYTB nas lagoas Mirim e Mangueira no Rio Grande do Sul

Apesar da diversidade de peixes e da sua grande importância econômica para o homem, ainda pouco se conhece sobre suas características biológicas, ecológicas e genéticas. A falta de conhecimento das espécies e consequentemente a falta de manejo destas, além das altas taxas de pesca são os principais responsáveis da perda de diversidade e reduções drásticas nas populações. Este trabalho teve como objetivo, caracterizar geneticamente populações de peixe-rei, de duas lagoas, através de análises genéticas de polimorfismo através marcadores microssatélites e mitocondriais. A primeira parte do estudo foi realizada em duas lagoas, Mirim e Mangueira, localizadas no sul do Brasil de onde foram obtidas amostras de Odontesthes humensis e Odontesthes bonariensis. Foram sintetizados primers para a amplificação de seis loci microssatélites os quais foram validados e apresentaram alto polimorfismo nas populações. Foram obtidos no total 38 alelos e apenas uma população está em Equilíbrio de Hardy-Weinberg. Na segunda parte do estudo foram coletadas amostras de peixe-rei na lagoa Mangueira, que morfologicamente eram diferentes das espécies puras. O locus UFPEL_OH3 se mostrou um primer diagnóstico para a detecção de híbridos de peixe-rei. Foi sintetizado um conjunto de primers para amplificação de um fragmento do gene mitocondrial cytb para para confrontar as sequências mitocondriais das amostras em estudo e com sequências preservadas de Odontesthes do banco genético GenBank. O estudo sugere que possam estar ocorrendo eventos de especiação no ambiente, talvez associados a mudanças ambientais e efeito de sobrepesca nas lagoas em estudo, sendo necessária a elaboração de projetos de conservação e manejo da espécie.

Despite the diversity of fish and their great economic importance for man, little is known about their biological, ecological and genetic characteristics. The lack of knowledge of the species and consequently the lack of management of these, in addition to the high rates of fishing are the main responsible for the loss of diversity and drastic reductions in the populations. The objective of this work was to genetically characterize populations of silverside, from two lagoons, through genetic analyzes of polymorphism using microsatellite and mitochondrial markers. The first part of the study was carried out in two lagoons, Mirim and Mangueira, located in southern Brazil from where samples of Odontesthes humensis and Odontesthes bonariensis were obtained. Six microsatellite loci were synthesized which were validated and showed high polymorphism in the populations. A total of 38 alleles were obtained and only one population is in Hardy-Weinberg equilibrium. In the second part of the study, samples of silverside were collected in the Mangueira lagoon, which were morphologically different from pure species. The UFPEL_OH3 locus proved to be a diagnostic primer for the detection of silverside hybrids. Mitochondrial marker (cyt b) was synthesized to compare the mitochondrial sequences of the samples under study and with preserved Odontesthes sequences from the GenBank genetic bank. The study suggests that speciation events may be occurring in the environment, perhaps associated with environmental changes and the effect of overfishing in the ponds under study, requiring the elaboration of conservation and management projects for the species.

Aspectos bioecológicos de flebotomíneos (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae) em área endêmica para leishmaniose visceral no estado de São Paulo

Atualmente, temos observado importantes mudanças nos padrões de transmissão da leishmaniose tegumentar (LT) e visceral (LV) em áreas endêmicas do Brasil. Além disso, a LV vem avançando rapidamente para novas áreas antes consideradas indenes. Os flebotomíneos (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae) são pequenos mosquitos com grande relevância em ciências médicas e veterinárias, por serem vetores de vírus, Bartonella bacilliformis e principalmente Leishmania spp. Os estudos sobre esses insetos são fundamentais para uma melhor compreensão da complexa epidemiologia das leishmanioses, revelando os aspectos biológicos desses vetores e suas relações com o parasita e seus reservatórios. Atualmente, abordagens moleculares vêm sendo incluídas nesses estudos e mostram-se ser ferramentas poderosas em pesquisas sobre esses dípteros. O objetivo desse trabalho, foi investigar os aspectos bioecológicos de flebotomíneos em área endêmica de LT e LV no estado de São Paulo, Brasil. Assim, foi realizado um inquérito entomológico para descrever a fauna, sua sazonalidade, taxa de infecção natural por Leishmania spp. e a identificação de hospedeiros vertebrados de flebotomíneos na área de estudo. Os insetos foram triados, identificados e o tórax e abdômen das fêmeas amostradas submetidas a extração de DNA e posterior PCR para a detecção do DNA do Kinetoplasto (kDNA) de parasitas do gênero Leishmania. Em seguida, amostras de DNA de fêmeas ingurgitadas, semiingurgitadas e grávidas foram submetidas a PCR para a amplificação do gene mitocondrial citocromo B (CYT-B) de vertebrados. Os produtos amplificados nas reações de CYT-B foram purificados e submetidos ao sequenciamento genético. As sequências encontradas foram confrontadas com a base de dados GenBank, para identificação da espécie de vertebrado envolvido no repasto sanguíneo, das fêmeas de flebotomíneos. Por empregar ferramentas moleculares, nesse trabalho, também foi analisado o desempenho de alguns métodos de extração de DNA em amostras individuais de tórax e abdômen de fêmeas desses insetos. Em nosso estudo, foram encontradas doze espécies de flebotomíneos, entre vetores comprovados e suspeitos nos ciclos epidemiológicos de LT e LV. Não foram observados padrões sazonais entre os fatores climáticos e a fauna desses insetos. Sobre os métodos de extração de DNA, os métodos comerciais são uma boa opção para esse tipo de amostra. Contudo, os métodos caseiros baseado em fenol/clorofórmio/álcool isoamílico ou em NaCl/álcool apresentaram melhores resultados. As análises moleculares revelaram uma fêmea não ingurgitada de Ev. (Ald.) carmelinoi positiva na PCR do kDNA de Leishmania spp. A identificação das fontes de repasto sanguíneo revelou os suínos, humanos, cães, bovinos, galinhas e gambás como hospedeiros vertebrados de flebotomíneos na área em estudo. As implicações desses achados são aqui apresentadas na forma de dois artigos científicos submetidos para avaliação em revistas da área.

Nowadays, we have observed important changes in the transmission patterns of tegumentary (TL) and visceral leishmaniases (VL) on endemic areas of Brazil. In addition, the VL advances rapidly to new areas on the past considered indene. The Phlebotomine sandflies (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae) are small midges with great relevance in medical and veterinary sciences, as they are vectors of viruses, Bartonella bacilliformis and mainly Leishmania spp. The studies on Phlebotomine sandflies are fundamental to improve the comprehension of complex leishmaniasis epidemiology, revealing biological aspects of these vectors and its relationships with the parasite and its reservoirs. Molecular approaches have been included in these studies and have proven to be powerful tools for research about these dipterans. The aim of this work was to investigate the bioecological aspects of Phlebotomine sandflies on a TL and VL endemic area of São Paulo state, Brazil. Thus, an entomological survey was conducted to describe the fauna, its seasonality, rate of natural infection by Leishmania spp. and identification of vertebrate hosts of sandflies in the study area. The insects were screened, identified and the thorax and abdomen of the females sampled submitted to DNA extraction and then PCR for the detection of Kinetoplast DNA (kDNA) of Leishmania spp. parasites. Next, DNA samples from engorged, partially engorged and gravid females were submitted to PCR amplification of the mitochondrial cytochrome B gene (CYTB) of vertebrates. Amplified products in CYT-B reactions were purified and subjected to sequencing. The sequences found were compared in a database GenBank, to identify the vertebrate species involved in the blood meal of the female sandflies. By employing molecular tools, this work also analyzed the performance of some DNA extraction methods from individual samples of thorax and abdomen of females of these insects. In our study, twelve species of sandflies were found, among proven and suspected vectors in the TL and VL epidemiological cycles. No seasonal patterns were observed between climatic factors and fauna of these insects. Regarding DNA extraction methods, commercial kits are a good option for this type of sample. However, in house methods based on phenol-chloroform/isoamyl alcohol or NaCl/alcohol showed better results. Molecular analyzes revealed one non-engorged Ev. (Ald.) carmelinoi female PCR positive by Leishmania spp. kDNA. Blood meal identification showed swine, humans, dogs, cattle, chickens and opossums as vertebrate hosts of sandflies in the study area. The implications of these findings are discussed in two scientific articles submitted for evaluation in journals of the area.

PADRÕES DE DISTRIBUIÇÃO HISTÓRICA, RELAÇÕES FILOGENÉTICAS E FILOGEOGRÁFICAS DE VEADO-MATEIRO-PEQUENO, Mazama bororo DUARTE, 1996 (Mammalia: Cervidae)

Considerada a espécie de cervídeo brasileira mais ameaçada de extinção, Mazama bororo,foi recentemente descrita em 1996. Devido a isso, aspectos básicos de sua biologia ainda são desconhecidos. Dessa maneira, o presente trabalho teve como objetivo utilizar DNA extraído de espécimes recentes e de museus para descrever a sua distribuição histórica, investigar a existência de padrões filogeográficos, avaliar a taxonomia da espécie e os erros de identificação no material analisado pertencente aos acervos científicos de museus. Para tanto, foi realizada a extração de DNA de 200 amostras de ossos turbinais obtidos em museus de história natural e 78 destes espécimes foram identificados a partir de iniciadores do gene citocromo b (224bp). O total de 22 espécimes identificados como pertencentes à espécie Mazama bororopermitiu conhecer áreas inéditas da distribuição histórica e, possivelmente atuais, da espécie, como os estados de Rio Grande do Sul, Minas Gerais, Goiás, Espírito Santo e Bahia. Além disso, a comparação entre o DNA dos holótipos de Mazama bororoe de Mazama americana jucunda indica que a espécie M. bororo corresponde à subespécie M. americana jucunda, descrita em 1913, demonstrando a necessidade de elevar essa subespécie à categoria de espécie. Análises filogeográficas da espécie demonstram que M. bororonão apresenta uma estruturação populacional histórica e que diversidade genética é baixa quando comparada a outras espécies, um indicativo de que políticas de manutenção e conservação dessa espécie são essenciais a sua permanência. Comparando-se as identificações morfológicas presentes nos museus com as identificações obtidas a partir do marcador molecular utilizado observa-se que a taxa de erro decorrente da classificação baseada em caracteres morfológicos foi de 26%. Entretanto, espera-se que, com o auxílio do DNA de coleções científicas, a seleção de caracteres morfológicos não convergentes para este grupo seja possível, permitindo assim a realização de identificações morfológicas corretamente.

Mazama bororo was recently described in 1996 and is considered the most threatened species of Brazilian deer. Due to this, basic aspects of its biology are still unknown. Thus, this research project aims to use DNA extracted from recent specimens and from natural history collections to review the taxonomy, to describe historical distribution and to investigate the existence of phylogeographic patterns on M. bororo. For this purpose, we extracted DNA from 200 samples of turbinate bones obtained from natural history collections and 78 of these were identified from cytochrome b initiator (224bp). We obtained a total of 22 specimens identified as M. bororo. This result allowed identify unpublished areas on historical and perhaps current distribution of M. bororoin states such as Rio Grande do Sul, Minas Gerais, Goiás, Espírito Santo and Bahia. Moreover, the comparison among the DNA from holotype of M. bororo and Mazama americanajucunda indicates that M. bororo corresponds to the subspecies M. americanajucunda, described in 1913, highlighting the need to raise this subspecies to full species status. Our results also demonstrates that M. bororo did not show a genetic structuration of their populations and that their genetic diversity is lower than other species, highlighting the need to increase conservation and environment policy efforts to maintenance of this species. Finally, when we compare the morphological identification available on natural history collections with the identification obtained from molecular markers we found that the error rate resulting from the classification based on morphological characters was 26%. Nevertheless, we expect with the help of DNA from natural history collections will be possible to select non-convergent morphological characters for this group, allowing thus correct morphological identifications.

Isolation and purification of complex II from proteus mirabilis strain ATCC 29245

A respiratory complex was isolated from plasma membrane of pathogenic Proteus mirabilis strain ATCC 29245. It was identified as complex II consisting of succinate:quinone oxidoreductase (EC 1.3.5.1) containing single heme b. The complex II was purified by ion-exchange chromatography and gel filtration. The molecular weight of purified complex was 116.5 kDa and it was composed of three subunits with molecular weights of 19 kDa, 29 kDa and 68.5 kDa. The complex II contained 9.5 nmoles of cytochrome b per mg protein. Heme staining indicated that the 19 kDa subunit was cytochrome b. Its reduced form showed absorptions peaks at 557.0, 524.8 and 424.4 nm. The -band was shifted from 557.0 nm to 556.8 nm in pyridine ferrohemochrome spectrum. The succinate: quinone oxidoreductase activity was found to be high in this microorganism.

Isolation and purification of complex II from proteus mirabilis strain ATCC 29245

A respiratory complex was isolated from plasma membrane of pathogenic Proteus mirabilis strain ATCC 29245. It was identified as complex II consisting of succinate:quinone oxidoreductase (EC 1.3.5.1) containing single heme b. The complex II was purified by ion-exchange chromatography and gel filtration. The molecular weight of purified complex was 116.5 kDa and it was composed of three subunits with molecular weights of 19 kDa, 29 kDa and 68.5 kDa. The complex II contained 9.5 nmoles of cytochrome b per mg protein. Heme staining indicated that the 19 kDa subunit was cytochrome b. Its reduced form showed absorptions peaks at 557.0, 524.8 and 424.4 nm. The -band was shifted from 557.0 nm to 556.8 nm in pyridine ferrohemochrome spectrum. The succinate: quinone oxidoreductase activity was found to be high in this microorganism.

Phylogeny of Thylamys (Didelphimorphia, Didelphidae) species, with special reference to Thylamys karimii

The genus Thylamys Gray, 1843 lives in the central and southern portions of South America inhabiting open and shrub-like vegetation, from prairies to dry forest habitats in contrast to the preference of other Didelphidae genera for more mesic environments. Thylamys is a speciose genus including T. elegans (Waterhouse, 1839), T. macrurus (Olfers, 1818), T. pallidior (Thomas, 1902), T. pusillus (Desmarest, 1804), T. venustus (Thomas, 1902), T. sponsorius (Thomas, 1921), T. cinderella (Thomas, 1902), T. tatei (Handley, 1957), T. karimii (Petter, 1968), and T. velutinus (Wagner, 1842) species. Previous phylogenetic analyses in this genus did not include the Brazilian species T. karimii, which is widely distributed in this country. In this study, phylogenetic analyses were performed to establish the relationships among the Brazilian T. karimii and all other previously analyzed species. We used 402-bp fragments of the mitochondrial cytochrome b gene, and the phylogeny estimates were conducted employing maximum parsimony (MP), maximum likelihood (ML), Bayesian (BY), and neighbor-joining (NJ). The topologies of the trees obtained in the different analyses were all similar and pointed out that T. karimii is the sister taxon of a group constituted of taxa from dry and arid environments named the dryland species. The dryland species consists of T. pusillus, T. pallidior, T. tatei, and T. elegans. The results of this work suggest five species groups in Thylamys. In one of them, T. velutinus and T. kariimi could constitute a sister group forming one Thylamys clade that colonized Brazil.

O gênero Thylamys Gray, 1843 ocorre na região central e ao sul da América do Sul, habitando vegetações abertas e arbustivas, desde pradarias até florestas de ambientes secos, em contraste à preferência por habitats mais úmidos dos outros gêneros de Didelphidae. O gênero inclui T. elegans (Waterhouse,1839), T. macrurus (Olfers, 1818), T. pallidior (Thomas, 1902), T. pusillus (Desmarest, 1804), T. venustus (Thomas, 1902), T. sponsorius (Thomas, 1921), T. cinderella (Thomas, 1902), T. tatei (Handley, 1957), T. karimii (Petter, 1968) e T. velutinus (Wagner, 1842). Análises filogenéticas anteriores não incluíram a espécie brasileira T. karimii, que apresenta uma ampla distribuição no país. Neste estudo foram feitas análises filogenéticas visando estabelecer a relação entre a espécie brasileira T. karimii e as demais espécies incluídas em outras análises. Foram utilizados fragmentos de 402pb do gene mitocondrial citocromo b. As filogenias foram estimadas pelos métodos de máxima parcimônia (MP), máxima verossimilhança (ML), Análise Bayesiana (BY) e Neighbor-Joining (NJ). As topologias das árvores obtidas nas diferentes análises mostraram-se semelhantes e evidenciaram que T. karimii agrupa-se com as espécies T. pusillus, T. pallidior, T. tatei, and T. elegans, de ambientes secos e áridos. Os resultados obtidos neste trabalho sugerem cinco grupos de espécies em Thylamys, dos quais um poderia ser composto pelo grupo-irmão T. velutinus e T. kariimi, o qual seria o clado que colonizou o Brasil.

Phylogeny of Thylamys (Didelphimorphia, Didelphidae) species, with special reference to Thylamys karimii

The genus Thylamys Gray, 1843 lives in the central and southern portions of South America inhabiting open and shrub-like vegetation, from prairies to dry forest habitats in contrast to the preference of other Didelphidae genera for more mesic environments. Thylamys is a speciose genus including T. elegans (Waterhouse, 1839), T. macrurus (Olfers, 1818), T. pallidior (Thomas, 1902), T. pusillus (Desmarest, 1804), T. venustus (Thomas, 1902), T. sponsorius (Thomas, 1921), T. cinderella (Thomas, 1902), T. tatei (Handley, 1957), T. karimii (Petter, 1968), and T. velutinus (Wagner, 1842) species. Previous phylogenetic analyses in this genus did not include the Brazilian species T. karimii, which is widely distributed in this country. In this study, phylogenetic analyses were performed to establish the relationships among the Brazilian T. karimii and all other previously analyzed species. We used 402-bp fragments of the mitochondrial cytochrome b gene, and the phylogeny estimates were conducted employing maximum parsimony (MP), maximum likelihood (ML), Bayesian (BY), and neighbor-joining (NJ). The topologies of the trees obtained in the different analyses were all similar and pointed out that T. karimii is the sister taxon of a group constituted of taxa from dry and arid environments named the dryland species. The dryland species consists of T. pusillus, T. pallidior, T. tatei, and T. elegans. The results of this work suggest five species groups in Thylamys. In one of them, T. velutinus and T. kariimi could constitute a sister group forming one Thylamys clade that colonized Brazil.

O gênero Thylamys Gray, 1843 ocorre na região central e ao sul da América do Sul, habitando vegetações abertas e arbustivas, desde pradarias até florestas de ambientes secos, em contraste à preferência por habitats mais úmidos dos outros gêneros de Didelphidae. O gênero inclui T. elegans (Waterhouse,1839), T. macrurus (Olfers, 1818), T. pallidior (Thomas, 1902), T. pusillus (Desmarest, 1804), T. venustus (Thomas, 1902), T. sponsorius (Thomas, 1921), T. cinderella (Thomas, 1902), T. tatei (Handley, 1957), T. karimii (Petter, 1968) e T. velutinus (Wagner, 1842). Análises filogenéticas anteriores não incluíram a espécie brasileira T. karimii, que apresenta uma ampla distribuição no país. Neste estudo foram feitas análises filogenéticas visando estabelecer a relação entre a espécie brasileira T. karimii e as demais espécies incluídas em outras análises. Foram utilizados fragmentos de 402pb do gene mitocondrial citocromo b. As filogenias foram estimadas pelos métodos de máxima parcimônia (MP), máxima verossimilhança (ML), Análise Bayesiana (BY) e Neighbor-Joining (NJ). As topologias das árvores obtidas nas diferentes análises mostraram-se semelhantes e evidenciaram que T. karimii agrupa-se com as espécies T. pusillus, T. pallidior, T. tatei, and T. elegans, de ambientes secos e áridos. Os resultados obtidos neste trabalho sugerem cinco grupos de espécies em Thylamys, dos quais um poderia ser composto pelo grupo-irmão T. velutinus e T. kariimi, o qual seria o clado que colonizou o Brasil.

A molecular method for a qualitative analysis of potentially coding sequences of DNA

Total sequence phylogenies have low information content. Ordinary misconceptions are that character quality can be ignored and that relying on computer algorithms is enough. Despite widespread preference for a posteriori methods of character evaluation, a priori methods are necessary to produce transformation series that are independent of tree topologies. We propose a stepwise qualitative method for analyzing protein sequences. Informative codons are selected, alternative amino acid transformation series are analyzed, and most parsimonious transformations are hypothesized. We conduct four phylogenetic analyses of philodryanine snakes. The tree based on all nucleotides produces least resolution. Trees based on the exclusion of third positions, on an asymmetric step matrix, and on our protocol, produce similar results. Our method eliminates noise by hypothesizing explicit transformation series for each informative protein-coding amino acid. This approaches qualitative methods for morphological data, in which only characters successfully interpreted in a phylogenetic context are used in cladistic analyses. The method allows utilizing character information contained in the original sequence alignment and, therefore, has higher resolution in inferring a phylogenetic tree than some traditional methods (such as distance methods).

Filogenias baseadas em seqüências totais têm baixo conteúdo informativo. Erros comuns são acreditar que a qualidade dos caracteres pode ser ignorada e que é suficiente confiar nos algoritmos computacionais. Apesar de ampla preferência por métodos a posteriori para a avaliação de caracteres, métodos a priori tornam-se necessários para produzir séries de transformação independentes das topologias das árvores. Propomos um método qualitativo passo a passo para analisar seqüências de proteínas. Codons informativos são selecionados, séries de transformação alternativas de aminoácidos são analisadas e as transformações mais parcimoniosas são hipotetizadas. Conduzimos quatro análises filogenéticas em cobras Phylodrininae. A árvore baseada em todos os nucleotídeos produz a menor resolução. Árvores baseadas na exclusão das terceiras posições, numa matriz de passos assimétrica, e em nosso protocolo de análise produzem resultados similares. Nosso método elimina ruído ao hipotetizar séries de transformação explícitas para cada aminoácido informativo para a codificação de proteínas. Essa abordagem se aproxima de métodos qualitativos para dados morfológicos, nos quais apenas caracteres interpretados com sucesso num contexto filogenético são usados em análises cladísticas. O método permite utilizar informação de caracteres contidos no alinhamento original da seqüência e, portanto, tem maior poder de resolução para inferir árvores filogenéticas que alguns métodos tradicionais (como métodos de distância).

A molecular method for a qualitative analysis of potentially coding sequences of DNA

Total sequence phylogenies have low information content. Ordinary misconceptions are that character quality can be ignored and that relying on computer algorithms is enough. Despite widespread preference for a posteriori methods of character evaluation, a priori methods are necessary to produce transformation series that are independent of tree topologies. We propose a stepwise qualitative method for analyzing protein sequences. Informative codons are selected, alternative amino acid transformation series are analyzed, and most parsimonious transformations are hypothesized. We conduct four phylogenetic analyses of philodryanine snakes. The tree based on all nucleotides produces least resolution. Trees based on the exclusion of third positions, on an asymmetric step matrix, and on our protocol, produce similar results. Our method eliminates noise by hypothesizing explicit transformation series for each informative protein-coding amino acid. This approaches qualitative methods for morphological data, in which only characters successfully interpreted in a phylogenetic context are used in cladistic analyses. The method allows utilizing character information contained in the original sequence alignment and, therefore, has higher resolution in inferring a phylogenetic tree than some traditional methods (such as distance methods).

Filogenias baseadas em seqüências totais têm baixo conteúdo informativo. Erros comuns são acreditar que a qualidade dos caracteres pode ser ignorada e que é suficiente confiar nos algoritmos computacionais. Apesar de ampla preferência por métodos a posteriori para a avaliação de caracteres, métodos a priori tornam-se necessários para produzir séries de transformação independentes das topologias das árvores. Propomos um método qualitativo passo a passo para analisar seqüências de proteínas. Codons informativos são selecionados, séries de transformação alternativas de aminoácidos são analisadas e as transformações mais parcimoniosas são hipotetizadas. Conduzimos quatro análises filogenéticas em cobras Phylodrininae. A árvore baseada em todos os nucleotídeos produz a menor resolução. Árvores baseadas na exclusão das terceiras posições, numa matriz de passos assimétrica, e em nosso protocolo de análise produzem resultados similares. Nosso método elimina ruído ao hipotetizar séries de transformação explícitas para cada aminoácido informativo para a codificação de proteínas. Essa abordagem se aproxima de métodos qualitativos para dados morfológicos, nos quais apenas caracteres interpretados com sucesso num contexto filogenético são usados em análises cladísticas. O método permite utilizar informação de caracteres contidos no alinhamento original da seqüência e, portanto, tem maior poder de resolução para inferir árvores filogenéticas que alguns métodos tradicionais (como métodos de distância).

Molecular based identification and phylogenetic relationship by using cytochrome b gene of Pangasius pangasius / Identificação de base molecular e relação filogenética usando o gene citocromo b de Pangasius pangasius

Molecular appraoch for identification of unknown species by using Cytochrome b gene is an effective and reliable as compared with morphological based identification. For DNA barcoding universal molecular genes were used to identify the species. Cytochrome b is a specific gene used for identification purpose. DNA barcoding is a reliable and effective method compared to the different traditional morphological methods of specie identification. So,in the present study which was conducted to identify the species, a total of 50 fish samples were collected from five different sites. DNA was extracted by using the Phenol Chloroform method from muscle tissue. Five sequences were sequenced (one from each site), analyzed, and identified specific species as Pangasius pangasius. Identified sequences were variable in length from 369 bp (Site 1), 364 bp (Site 2), 364 bp (Site 3), 352 bp (Site 4), and 334 bp (Site 5). Identity matches on the NCBI database confirmed the specific specie as P. pangasius. A distancing tree was drawn to show maximum likelihood among the same and different species. Yet, in many cases fishes on diverse development stages are difficult to identify by morphological characters. DNA-based identification methods offer an analytically powerful addition or even an alternative tool for species identification and phylogenetic study. This work intends to provide an updated and extensive overview on the DNA based methods for fish species identification by using Cytochrome b gene as targeted markers for identification purpose.

A abordagem molecular para identificação de espécies desconhecidas usando o gene citocromo b é eficaz e confiável em comparação com a identificação baseada na morfologia. Códigos de barras de DNA de genes moleculares universais foram usados ​​para identificar as espécies. O citocromo b é um gene específico usado para fins de identificação. O código de barras de DNA é um método confiável e eficaz em comparação com os diferentes métodos morfológicos tradicionais de identificação de espécies. Assim, no presente estudo, que foi realizado para identificar as espécies, um total de 50 amostras de peixes foram coletadas em cinco locais diferentes. O DNA foi extraído usando o método Fenol Clorofórmio do tecido muscular. Cinco sequências foram sequenciadas (uma de cada local), analisadas e identificadas espécies específicas, como Pangasius pangasius. As sequências identificadas tinham comprimento variável de 369 bp (Local 1), 364 bp (Local 2), 369 bp (Local 1), 364 bp (Local 3), 352 bp (Local 4) e 334 bp (Local 5). As correspondências de identidade no banco de dados do NCBI confirmaram a espécie específica como P. pangasius. Uma árvore de distanciamento foi desenhada para mostrar a máxima probabilidade entre elas e diferentes espécies. No entanto, em muitos casos, peixes em diversos estágios de desenvolvimento são difíceis de identificar por caracteres morfológicos. Os métodos de identificação baseados em DNA oferecem uma adição analiticamente poderosa ou mesmo uma ferramenta alternativa para identificação de espécies e estudo filogenético. Este trabalho pretende fornecer uma visão geral atualizada e abrangente sobre os métodos baseados em DNA para identificação de espécies de peixes usando o gene citocromo b como marcadores direcionados para fins de identificação.