Acurácia diagnóstica e viabilidade de ácidos nucléicos em tumores mamários caninos usando fixação coagulante e processamento histológico rápido em micro-ondas doméstico

Neoplasias mamárias são relativamente comuns em cães. O diagnóstico dessa enfermidade se dá por meio da histopatologia usando o formol como fixação padrão. Métodos alternativos existem, porém são pouco empregados, como é o caso da fixação coagulante e do processamento em micro-ondas domésticos. O presente trabalho teve como objetivo avaliar acurácia diagnóstica de fragmentos fixados com fixador coagulante e processadas em micro-ondas doméstico, bem como avaliar se esse material é viável para biologia molecular. Os tumores mamários foram clivados em duas partes e uma pequena parte foi criopreservada. Foi determinada a acurácia diagnóstica no exame histopatológico do fragmento processado em micro-ondas. Além disso, todas as amostras foram extraídas o DNA para amplificação do gene GAPDH e em seguida realizada a eletroforese. A acurácia diagnóstica obtida foi de 66,6% e o amostras parafinadas de todos os fragmentos fixados em fixador coagulante e processados em micro-ondas foram positivos para o gene GAPDH na eletroforese. Os resultados demonstraram que a técnica de processamento rápido em forno micro-ondas doméstico empregando a fixação coagulante é uma alternativa viável para diagnóstico de neoplasias mamária de cães em curto prazo. Os blocos parafinados serviram como ótimas fontes de extração de DNA para biologia molecular.

Breast neoplasms are relatively common in dogs. The diagnosis of this disease is made through histopathology using formalin as standard fixation. Alternative methods exist, but they are little used, as is the case of coagulant fixation and domestic microwave processing. This study aimed to evaluate the diagnostic accuracy of fragments fixed with coagulant fixative and processed in domestic microwaves, as well as to evaluate whether this material is viable for molecular biology. Breast tumors were cleaved into two parts and a small part was cryopreserved. The diagnostic accuracy was determined in the histopathological examination of the microwave-processed fragment. In addition, all samples were extracted from DNA for amplification of the GAPDH gene and then electrophoresed. The diagnostic accuracy obtained was 66.6% and the paraffin samples of all fragments fixed in coagulant fixative and processed in microwave were positive for the GAPDH gene in electrophoresis. The results showed that the rapid processing technique in a domestic microwave oven using coagulant fixation is a viable alternative for short-term diagnosis of breast cancer in dogs. The paraffin blocks served as excellent sources of DNA extraction for molecular biology.

Análise das funções moonlighting de duas proteínas de Leptospira: Enolase e GAPDH

Mais de 25% das mortes em humanos são causadas por doenças infecciosas. Muitas dessas doenças são emergentes e de importância zoonótica. A leptospirose é considerada uma das mais importantes doenças zoonóticas emergentes. Sua distribuição global e seu potencial epidêmico constituem um problema de Saúde Pública. Estima-se que ocorram anualmente 1.03 milhão de casos e 58.900 mortes por leptospirose em todo o mundo, mas, em se tratando de uma doença negligenciada, a real prevalência da doença é subestimada. O Rattus norvegicus é o principal reservatório associado a epidemias urbanas. Leptospiras possuem a capacidade de aderir às células dos túbulos renais e interagem com muitos componentes da matriz extracelular do hospedeiro, o que facilita a invasão e colonização. Possuem também mecanismos de evasão ao sistema complemento do hospedeiro. A identificação destes mecanismos tem sido alvo de pesquisas desenvolvidas por vários grupos. Enolase e Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) pertencem à categoria de proteínas conhecidas como proteínas moonlighting. Estas englobam um grupo de proteínas multifuncionais. Enolases são metaloenzimas citossólicas que catalisam a conversão de 2-D-fosfo-glicerato em fosfoenolpiruvato. Apesar de não possuírem sequência clássica de ancoragem à membrana, são encontradas na superfície de uma variedade de células eucarióticas e procarióticas, tendo a capacidade de interagir com plasminogênio. GAPDH é uma enzima da via glicolítica responsável pela conversão de gliceraldeído 3-fosfato em D glicerato 1,3-bifosfato. Estudos recentes mostram que a GAPDH tem múltiplas funções independentes do seu papel no metabolismo de energia. Neste trabalho demonstrou-se que GAPDH de Leptospira está localizada na superfície da bactéria, e que tanto GAPDH como enolase interagem com plasminogênio, o qual é convertido em sua forma ativa, a plasmina, na presença do ativador exógeno uPA. A capacidade da plasmina gerada sobre a enolase de clivar substratos fisiológicos foi testada. A cadeia do fibrinogênio foi totalmente degradada, e a molécula vitronectina parcialmente clivada em fragmentos de 61- 64 kDa. Ainda, mostrou-se que a enolase interage com os reguladores do complemento C4BP e FH. Ambos os reguladores permanecem funcionais, agindo como co-fatores de Fator I na degradação de C3b (FH) e C4b (C4BP). No que diz respeito à GAPDH, os dados claramente mostram que a plasmina ligada à GAPDH degrada as cadeias e do fibrinogênio, assim como a isoforma de 75 kDa da vitronectina, de forma tempo-dependente. Ainda, na presença de GAPDH, a plasmina degradou totalmente a cadeia de C5, mas não degradou C3b. Por fim, resultados obtidos por Far Western Blot revelam que GAPDH interage com C1q, molécula-chave da via clássica do sistema complemento, e também com fibronectina plasmática, podendo, portanto, contribuir para a adesão da bactéria durante a colonização do hospedeiro. Em suma, no presente estudo caracterizamos duas novas proteínas moonlighting de Leptospira: enolase e GAPDH. A caracterização funcional destas proteínas, assim como a identificação das moléculas-alvo do hospedeiro com as quais essas proteínas são capazes de interagir, podem contribuir para a compreensão dos mecanismos de invasão, disseminação e evasão imune utilizados por leptospiras patogênicas.

More than 25% of human deaths are caused by infectious diseases, among which a large number are emerging and of zoonotic importance. Leptospirosis is considered one of the most important emerging zoonotic diseases. Its global distribution and its epidemic potential constitute a Public Health problem. It is estimated that approximately 1,03 million cases and 58,900 deaths from leptospirosis occur annually worldwide, but as a neglected disease, its actual prevalence is underestimated. Rattus norvegicus is the main reservoir associated with urban epidemics. Leptospires have the capacity to adhere to renal tubule cells which facilitates invasion and colonization. They also have mechanisms to evade the host's complement system. The identification of these mechanisms has been the object of research developed by several groups. Enolase and Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) belong to the category of proteins known as moonlighting proteins. These encompass a group of multifunctional proteins. Enolases are cytosolic metalloenzymes that catalyze the conversion of 2-D-phosphoglycerate to phosphoenolpyruvate. Although they do not have a classic membrane anchor sequence, they are found on the surface of a variety of eukaryotic and prokaryotic cells, and have the capacity to interact with plasminogen. GAPDH is an enzyme of the glycolytic pathway responsible for the conversion of glyceraldehyde 3-phosphate to D-glyceryl 1,3-bisphosphate. Recent studies show that GAPDH has multiple functions independent of its role in energy metabolism. In this work we demonstrated that Leptospira GAPDH is located on the surface of the bacterium, and that both GAPDH and enolase interact with plasminogen, which is converted into its active form, plasmin, in the presence of the exogenous activator uPA. The capacity of plasmin-bound enolase to cleave physiological substrates was tested. The -chain of fibrinogen was totally degraded, and vitronectin was partially cleaved into fragments of 61-64 kDa. Further, enolase interacts with the complement regulators C4BP and FH. Both regulators remain functional, acting as cofactors for Factor I on the degradation of C3b (FH) and C4b (C4BP). With regard to GAPDH, the date clearly show that plasmin bound to GAPDH degrades the and chains of fibrinogen as well as the 75-kDa isoform of vitronectin, in a time-dependent manner. Furthermore, in the presence of GAPDH, plasmin totally degraded C5 -chain, but did not degrade C3b. Finally, our Far Western Blot data reveal that GAPDH interacts with C1q, a key molecule of the classical pathway of the complement system, and also interacts with plasma fibronectin, and may therefore contribute to bacterial adhesion during host colonization. Briefly, in the present study we characterized two novel moonlighting proteins of Leptospira: enolase and GAPDH. The functional characterization of these proteins, as well as the identification of the host target molecules with which these proteins are capable of interacting, may contribute to the understanding of the mechanisms of invasion, dissemination and immune evasion used by pathogenic leptospires.

VALIDAÇÃO DE GENES DE REFERÊNCIA PARA RT-qPCR EM TECIDO CARDÍACO DE RATOS SUBMETIDOS À OBESIDADE E AO DIABETES

O presente trabalho tem como objetivo identificar e validar genes de referência para RT-qPCR em tecido cardíaco de ratos da espécie Rattus norvegicus albinus, submetidos à obesidade associada ou não ao diabetes mellitus tipo 2. Para isso, as alterações metabólicas foram induzidas aos 42 dias de vida, sendo a eutanásia realizada no 70º dia. Os corações dos animais foram coletados e o ápice cardíaco foi destinado às técnicas moleculares para extração do RNA, realizada com TRIzol®. Os candidatos a genes de referência foram GAPDH, POLR2A, RPL32 e RPL4. A técnica da RT-qPCR foi feita em termociclador, sendo a eficiência dos iniciadores encontrada pelo software LinReg e a estabilidade da expressão dos genes de referência nas amostras analisada pelo algoritmo RefFinder. O gene alvo utilizado para verificar a diferença da expressão gênica dos candidatos a genes de referência foi o CMA1. Os resultados sugerem que os animais obesos apresentaram uma diminuição da expressão do gene CMA1 quando comparado com os dois genes de referência mais estáveis. O contrário ocorre quando o mesmo é comparado com os dois genes de referência menos estáveis. Não existe um gene de referência universal para todas as situações, o que requer uma validação sistemática para cada uma. A utilização de genes de referência não validados pode comprometer a expressão dos genes alvo, o que impediria o reflexo da situação real. Os genes GAPDH e POLR2A são os melhores para normalizar as reações com as amostras nas condições do presente experimento.

The present work aims to identify and validate reference genes for RT-qPCR in cardiac tissue of rats of the Rattus norvegicus albinus species, submitted to obesity associated or not to type 2 diabetes mellitus. For this, the metabolic changes were induced at 42 days of life, with euthanasia being performed on the 70th day. The hearts of the animals were collected and the cardiac apex was assigned to the molecular techniques for RNA extraction, performed with TRIzol®. Candidates for reference genes were GAPDH, POLR2A, RPL32 and RPL4. The RT-qPCR technique was done in thermocycler, with the efficiency of the primers found by the LinReg software and the stability of the expression of the reference genes in the samples analyzed by the RefFinder algorithm. The target gene used to verify the difference in gene expression of candidates for reference genes was CMA1. The results suggest that obese animals showed a decrease in CMA1 gene expression when compared to the two most stable reference genes. The opposite occurs when it is compared to the two less stable reference genes. There is no universal reference gene for all situations, which requires systematic validation for each. The use of unvalidated reference genes may compromise the expression of the target genes, which would prevent the reflection of the actual situation. The GAPDH and POLR2A genes are best at normalizing the reactions with the samples under the conditions of the present experiment. Keywords: Normalization, RT-qPCR, RT-qPCRr, GAPDH, POLR2A