The role of Kisspeptin in bovine in vitro embryo production / Efeito da Kisspeptina na produção in vitro de embriões bovinos

The aim of this study was to investigate the effect of Kisspeptin (Kp) on the medium used in different stages of in vitro production of bovine embryo (IVEP), evaluating cleavage (CR) and blastocyst (BR) rates. The study was divided into three experiments that analyzed, respectively, the action of Kp on in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF), and in vitro culture (IVC) of bovine embryos. In experiment 1, the oocytes were matured in IVM medium and distributed into the following treatments: maturation (IVM Control, n = 102), maturation with addition of 10-7 M Kp (Kp 10-7 IVM, n = 90), and hormone-free maturation luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH) with the addition of 10-7M Kp (No hormones + Kp 10-7, n = 84), following maturation to normal stages of IVEP. In experiment 2, the oocytes were fertilized in IVF medium, in the following treatments: TALP-FERT without Kp (Control IVF, n = 103) and TALP-FERT with the addition of 10-7M Kp (Kp 10-7 IVF, n = 119), usually following the other steps. Finally, in the third experiment, the oocytes passed through all phases and were divided into IVC in two treatments: SOF medium without Kp (Control IVC, n = 109) and SOF medium with the addition of 10-7M Kp (Kp 10-7, N = 106). The data were analyzed by PROC GLIMMIX of the SAS program. In experiment 1, the means of CR and BR were similar (P > 0.05) between treatments (IVM Control76.47% and 37.25%, Kp 10-7 MIV80% and 33.33%, and No hormones + Kp 10-770.24% and 30.95%, respectively). In experiment 2, the means of CR were similar for the IVF Control and Kp 10-7 IVF groups (P > 0.05), 76.70% and 86.55% respectively. But, the mean of the BR of the group Kp 10-7 IVF was 38.66%, which was higher (P 0.05) were similar between the IVC Control and Kp 10-7 IVC groups (CR 83.50% and 78.30%, and BR 26.60% and 23.60%, respectively)...

Objetivou-se com esse estudoinvestigar o efeito da Kisspeptina (Kp) nos meios base utilizados nas etapas da Produção in vitro de Embriões (PIVE) bovinos, avaliando as taxas de clivagem (TC) e blastocistos (TB). O estudo foi dividido em três experimentos, sendo respectivamente analisado em cada um a ação da Kp na maturação in vitro (MIV), fertilização in vitro (FIV) e cultivo in vitro (CIV) de embriões bovinos. No experimento 1 os oócitos foram maturados em meio base MIV, distribuídos nos seguintes tratamentos: maturação (Controle MIV, n=102), maturação com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 MIV, n=90) e maturação sem hormônios LH e FSH com adição de 10-7M de Kp-10 (Sem hormônios + Kp 10-7, n=84), seguindo após a maturação para as etapas normais da PIVE. No experimento 2 os oócitos foram fecundados em meio base da FIV, nos seguintes tratamentos:TALP-FERT sem Kp (Controle FIV, n = 103) e TALP-FERT com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 FIV, n = 119), seguindo normalmente pelas outras etapas. Finalmente, no terceiro experimento os oócitos passaram por todas as fases e foram divididos no CIV em 2 tratamentos: meio SOF sem Kp (Controle CIV, n = 109) e meio SOF com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 3, n = 106). Os dados foram analisados pelo PROC GLIMMIX do programa SAS. No experimento 1 as médias das TC e TB foram semelhantes (P > 0,05) entre os tratamentos Controle MIV 76,47% e 37,25%, Kp 10-7 MIV 80% e 33,33% e Sem hormônios + Kp 10- 7 70,24% e 30,95%, respectivamente. No experimento 2 as médias das TC foram semelhantes para os grupos Controle FIV e Kp 10-7 FIV (P > 0,05), sendo 76,70% e 86,55%, respectivamente. Porém, a média da TB do grupo Kp 10-7 FIV 38,66%, foi superior (P 0,05) também foram similares entre os tratamentos Controle CIV e Kp 10-7 CIV...

The role of Kisspeptin in bovine in vitro embryo production / Efeito da Kisspeptina na produção in vitro de embriões bovinos

The aim of this study was to investigate the effect of Kisspeptin (Kp) on the medium used in different stages of in vitro production of bovine embryo (IVEP), evaluating cleavage (CR) and blastocyst (BR) rates. The study was divided into three experiments that analyzed, respectively, the action of Kp on in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF), and in vitro culture (IVC) of bovine embryos. In experiment 1, the oocytes were matured in IVM medium and distributed into the following treatments: maturation (IVM Control, n = 102), maturation with addition of 10-7 M Kp (Kp 10-7 IVM, n = 90), and hormone-free maturation luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH) with the addition of 10-7M Kp (No hormones + Kp 10-7, n = 84), following maturation to normal stages of IVEP. In experiment 2, the oocytes were fertilized in IVF medium, in the following treatments: TALP-FERT without Kp (Control IVF, n = 103) and TALP-FERT with the addition of 10-7M Kp (Kp 10-7 IVF, n = 119), usually following the other steps. Finally, in the third experiment, the oocytes passed through all phases and were divided into IVC in two treatments: SOF medium without Kp (Control IVC, n = 109) and SOF medium with the addition of 10-7M Kp (Kp 10-7, N = 106). The data were analyzed by PROC GLIMMIX of the SAS program. In experiment 1, the means of CR and BR were similar (P > 0.05) between treatments (IVM Control76.47% and 37.25%, Kp 10-7 MIV80% and 33.33%, and No hormones + Kp 10-770.24% and 30.95%, respectively). In experiment 2, the means of CR were similar for the IVF Control and Kp 10-7 IVF groups (P > 0.05), 76.70% and 86.55% respectively. But, the mean of the BR of the group Kp 10-7 IVF was 38.66%, which was higher (P < 0.05) than that of the FIV Control group, which was 31.07%. In the third experiment, the means of CR and BR (P > 0.05) were similar between the IVC Control and Kp 10-7 IVC groups (CR 83.50% and 78.30%, and BR 26.60% and 23.60%, respectively)...(AU)

Objetivou-se com esse estudoinvestigar o efeito da Kisspeptina (Kp) nos meios base utilizados nas etapas da Produção in vitro de Embriões (PIVE) bovinos, avaliando as taxas de clivagem (TC) e blastocistos (TB). O estudo foi dividido em três experimentos, sendo respectivamente analisado em cada um a ação da Kp na maturação in vitro (MIV), fertilização in vitro (FIV) e cultivo in vitro (CIV) de embriões bovinos. No experimento 1 os oócitos foram maturados em meio base MIV, distribuídos nos seguintes tratamentos: maturação (Controle MIV, n=102), maturação com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 MIV, n=90) e maturação sem hormônios LH e FSH com adição de 10-7M de Kp-10 (Sem hormônios + Kp 10-7, n=84), seguindo após a maturação para as etapas normais da PIVE. No experimento 2 os oócitos foram fecundados em meio base da FIV, nos seguintes tratamentos:TALP-FERT sem Kp (Controle FIV, n = 103) e TALP-FERT com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 FIV, n = 119), seguindo normalmente pelas outras etapas. Finalmente, no terceiro experimento os oócitos passaram por todas as fases e foram divididos no CIV em 2 tratamentos: meio SOF sem Kp (Controle CIV, n = 109) e meio SOF com adição de 10-7M de Kp-10 (Kp 10-7 3, n = 106). Os dados foram analisados pelo PROC GLIMMIX do programa SAS. No experimento 1 as médias das TC e TB foram semelhantes (P > 0,05) entre os tratamentos Controle MIV 76,47% e 37,25%, Kp 10-7 MIV 80% e 33,33% e Sem hormônios + Kp 10- 7 70,24% e 30,95%, respectivamente. No experimento 2 as médias das TC foram semelhantes para os grupos Controle FIV e Kp 10-7 FIV (P > 0,05), sendo 76,70% e 86,55%, respectivamente. Porém, a média da TB do grupo Kp 10-7 FIV 38,66%, foi superior (P < 0,05) ao grupo controle FIV 31,07%. No terceiro experimento as médias das TC e TB (P > 0,05) também foram similares entre os tratamentos Controle CIV e Kp 10-7 CIV...(AU)

ADIÇÃO DE KISSPEPTINA NO MEIO DE FERTILIZAÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

Objetivou-se avaliar diferentes concentrações de Kisspeptina (Kp) e o seu efeito na fertilização in vitro de embriões bovinos quanto à qualidade e taxas de desenvolvimento embrionário inicial. No Experimento 1 foi determinada a concentração mínima de Kp a ser utilizada no meio FIV, a partir dos tratamentos: controle (n=240); Kp 10-5 M (n=223); Kp 10-6 M (n=225) e Kp 10-7 M (n=245). No Experimento 2, os ovócitos, foram distribuídos em quatro tratamentos: controle (n=362); Kp 10-1 M (n=425), Kp 10-7 M (n=304), e antagonista P234 4x10-6 M (n=424). Os espermatozoides foram capacitados por gradiente descontínuo de Percoll®, e co-incubados com os ovócitos por 16 a 18h em estufa de cultura a 38,5°C com 5% de CO2. Após esse período, os zigotos foram incubados em Fluido Sintético de Oviduto (SOF) durante sete dias nas mesmas condições. A taxa de clivagem foi avaliada 48h após a fertilização e a taxa de blastocistos e estágio de desenvolvimento/qualidade no sétimo dia. Foi adotado um escore numérico de 1 a 4 para avaliação do estágio de desenvolvimento, onde 1 corresponde a blastocisto inicial, 2 blastocisto, 3 blastocisto expandido e 4 blastocisto eclodido. A qualidade foi avaliada por microscopia confocal 3D, e os dados analisados pelo PROC GLIMMIX/SAS e teste de Kruskal-Wallis. No Experimento 1, não houve diferença entre os tratamentos para taxas de clivagem e blastocistos respectivamente: controle (82,0%/34,2%); Kp 10-5 M (81,6%/26,9%); Kp 10-6 M (80,8%/29,3%) e Kp 10-7 M (80,8%/29,4%) (P > 0,05). No Experimento 2, as médias das taxas de clivagem e blastocisto foram semelhantes entre os tratamentos: controle (85,1%/38,1%), Kp 10-1 M (82,6%/33,6%), Kp 10-7 M (83,6%/34,9%) e P234 (81,4%/31,6%) (P > 0,05). Foram produzidos 514 embriões, com as seguintes médias de escore de desenvolvimento: controle 2,89; Kp 10-1 M 3,04; Kp 10- 7 M 2,79 e P234 2,63, sem diferença estatística entre os mesmos (P > 0,05). Quanto à qualidade, foram avaliados 360 embriões, n=30/tratamento/corante. Os parâmetros observados foram produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), necrose, apoptose e potencial mitocondrial. Cada embrião forneceu de 3 a 8 imagens (n=1.492) com intensidade de fluorescência em pixels. O grupo controle apresentou maior porcentagem de ROS: controle 3,76%; Kp 10-1 M 0,25%; Kp 10-7 M 2,95% e P234 0,91% (P < 0,05). A porcentagem de degeneração celular foi semelhante entre os tratamentos: controle 1,51%; Kp 10-1 M 1,73%; Kp 10-7 M 4,71% e P234 1,98% (P > 0,05). A média de apoptose, foi semelhante entre os tratamentos: controle 2,79%; Kp 10-7 M 1,67% e P234 6,11% (P > 0,05). O potencial mitocondrial teve maior porcentagem no grupo P234: controle 0,51%; Kp 10-1 M 0,26%; Kp 10-7 M 0,22% e P234 1,43% (P < 0,05). A adição de kp-10 no meio de fertilização não interferiu nas taxas de clivagem e blastocisto, bem como no estágio de desenvolvimento embrionário. A Kp não teve efeito na apoptose, necrose, nem tampouco no potencial mitocondrial. Por outro lado, a Kp diminuiu os níveis intracelulares de ROS, sugerindo o seu envolvimento no controle antioxidante.

The aim was to evaluate the different concentrations of Kisspeptin (Kp) and its effect in the process of in vitro fertilization of bovine embryos about the quality and production rates. In Experiment 1 the minimum concentration of Kp was determined to be used at medium FIV, starting from the treatments: control (n=240); Kp 10-5 M (n=223); Kp 10-6 M (n=225) and Kp 10-7 M (n=245). In Experiment 2, the oocytes were distributed in four treatments: control (n=362); Kp 10-1 M (n=425), Kp 10-7 M (n=304), and antagonist P234 4x10-6 M (n=424). The sperms were enabled by Percoll® discontinuous gradient, and coincubated with the oocytes from 16 to 18 hours in stove culture at 38.5°C with 5% of CO2. After this period, the zygotes were incubated in Synthetic Oviduct Fluid (SOF) during 7 days in the same conditions. The rate of cleavage was evaluated 48 hours after fertilization and the rate of blastocysts and development stage/quality on the seventh day. A numerical score was adopted from 1 to 4 for evaluation of the development stage, as 1 corresponds to initial blastocyst, 2 blastocyst, 3 expanded blastocyst and 4 hatched blastocyst. The quality was evaluated by 3D confocal microscopy, and the analyzed data by PROC GLIMMIX/SAS and Kruskal-Wallis test. In Experiment 1, there wasnt difference between the treatments rates of cleavage and blastocysts respectively: control (82,0%/34,2%); Kp 10-5 M (81,6%/26,9%); Kp 10-6 M (80,8%/29,3%) and Kp 10-7 M (80,8%/29,4%) (P > 0,05). In Experiment 2, the averages from the rates of cleavage and blastocysts were similar between the treatments: control (85,1%/38,1%), Kp 10-1 M (82,6%/33,6%), Kp 10-7 M (83,6%/34,9%) and P234 (81,4%/31,6%) (P > 0,05). A total of 514 embryos were produced, with the following averages of development score: control 2,89; Kp 10-1 M 3,04; Kp 10-7 M 2,79 and P234 2,63, without statistical difference among them (P > 0,05). About the quality, 360 embryos were evaluated, n=30/treatment/coloring. The parameters observed were production of reactive oxygen species (ROS), necrosis, apoptosis and mitochondrial potential. Each embryo supplied from 3 to 8 images (n=1.492) with fluorescence intensity in pixels. The control group presented bigger percentage of ROS: control 3,76%; Kp 10-1 M 0,25%; Kp 10-7 M 2,95% and P234 0,91% (P < 0,05). The percentage of cellular degeneration was similar between the treatments: control 1,51%; Kp 10-1 M 1,73%; Kp 10-7 M 4,71% and P234 1,98% (P > 0,05). The average of apoptosis was similar between the treatments: control 2,79%; Kp 10-7 M 1,67% and P234 6,11% (P > 0,05). The mitochondrial potential had bigger percentage in the group P234: control 0,51%; Kp 10-1 M 0,26%; Kp 10-7 M 0,22% and P234 1,43% (P < 0,05). The addition of kp-10 amid fertilization didnt interfere in the rates of cleavage and blastocyst, as well as in the embryonic development stage. The Kp didnt have effect in the apoptosis, necrosis, nor even in the mitochondrial potential. On the other hand, the Kp decreased the intracellular levels of ROS, suggesting its involvement in the antioxidant control.

INFLUÊNCIA DA KISSPEPTINA NA ETAPA DE SELEÇÃO ESPERMÁTICA PARA A PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

O objetivo do presente estudo foi avaliar a adição da Kisspeptina (Kp) no processo in vitro de seleção espermática, quanto à viabilidade dos espermatozoides bovinos e taxas de produção embrionária. Para isso foram utilizados 980 ovócitos provenientes de ovários de abatedouro-frigorífico e 75 palhetas de sêmen comercial bovino. Os tratamentos foram realizados nos espermatozoides durante a etapa de seleção espermática in vitro pelo método de centrifugação com gradientes descontínuos de Percoll® 90% e 45% de acordo com os seguintes tratamentos: Controle (n = 182), Kp 10-5 M (n = 198), Kp 10-6 M (n = 200), Kp 10-7 M (n = 206) e antagonista P-234 50 µM (n = 194), com as diluições realizadas nos dois gradientes respeitando-se as devidas concentrações. Os espermatozoides foram analisados no momento pré e pós seleção espermática para motilidade e vigor, e submetidos à coloração pelas sondas JC-1, IP e FITC-PSA, para avaliar o potencial mitocondrial, integridade de membrana plasmática e integridade do acrossoma em microscópio de varredura a laser confocal LSM 510 meta. Posterior aos tratamentos, os espermatozoides foram utilizados normalmente nos procedimentos de PIVE. No D2 e D7 foram realizadas análises de produção, baseadas nas taxas de clivagem e blastocistos, respectivamente. Os dados foram submetidos ao teste de normalidade e homogeneidade pelo guided analisys do SAS, posteriormente utilizado o proc GLIMMIX para avaliação do modelo experimental e posteriormente ao teste de Tukey-Kramer para comparação de médias. Diferenças foram consideradas quando P < 0,05. Os resultados de motilidade e vigor e taxas de produção embrionária foram semelhantes (P > 0,05) entre todos os tratamentos propostos. A taxa de clivagem (n=846) foi maior que 82% e a porcentagem de produção de blastocistos (n=331) foi maior que 29%. Quanto ao potencial mitocondrial, os grupos Kp 10-6 e Kp 10-7 (92,6%) foram superiores (P < 0,05) aos grupos Controle (89,8%) e P-234 (83,8%), sendo este último inferior (P < 0,05) a todos os outros tratamentos. Na avaliação da integridade de membrana plasmática e integridade do acrossoma (IMP/IA), os tratamentos com adição de Kp foram semelhantes (P > 0,05) entre si Kp 10-5 (88,9%/90,9%), Kp 10-6 (90,7%/91,8%) e Kp 10-7 (90,2%/91,4%) e ao antagonista P-234 (90,5%/90,8%), respectivamente. Apenas o tratamento Kp 10-6 apresentou resultado superior (P < 0,05) ao grupo Controle (87,9%/89,1%). Ao correlacionar as variáveis analisadas pela microscopia confocal, foi observada uma correlação significativa e positiva entre alto potencial mitocondrial e integridade de membrana plasmática (r = 0,80; P < 0,0001), integridade de acrossoma e alto potencial mitocondrial (r = 0,80; P < 0,0001), integridade de membrana plasmática e integridade de acrossoma (r = 0,84; P < 0,0001). Finalmente, pode-se concluir que a concentração equilibrada da Kp proporcionou maior viabilidade aos espermatozoides bovinos referente ao potencial mitocondrial, integridade acrossômica e de membrana plasmática. Já o antagonista P-234 apresentou efeito prejudicial referente ao potencial mitocondrial.

The aim of the present study was to evaluate the addition of Kisspeptin (Kp) in the in vitro process of spermatic selection, regarding the viability of bovine spermatozoa and embryo production rates. For this, 980 oocytes were obtained from slaughterhouse ovaries and 75 commercial bovine semen straws were used. The treatments were performed on the spermatozoa during the in vitro spermatic selection stage by the centrifugation method with 90% and 45% Percoll® discontinuous gradients according to each proposed treatment: Control (n = 182), Kp 10-5 M (n = 198 ), Kp 10-6 M (n = 200), Kp 10-7 M (n = 206) and 50 M P-234 antagonist (n = 194), with the dilutions carried out on both gradients respected concentrations. The spermatozoa were analyzed before and after spermatic selection for motility and vigor, and were submitted to staining with fluorescent probes JC-1, IP and FITC-PSA, to evaluate the mitochondrial potential, plasma membrane integrity and acrosome integrity under confocal laser scanning microscope LSM 510 meta. After the treatments, spermatozoa were normally used in IVEP procedures. The production analyzes were performed on D2 and D7, based respectively on cleavage and blastocysts rates. The data were submitted to the normality and homogeneity test by guided analysis SAS, after were used the proc GLIMMIX procedure to evaluate the experimental model and later the Tukey-Kramer test for comparison of means. Differences are considered when P < 0.05. The results of motility, vigor and production rates were similar (P> 0.05) among all proposed treatments. The cleavage rate (n = 846) was higher than 82% and the percentage of blastocyst production (n = 331) higher than 29% in all treatments. The mitochondrial potential of Kp 10-6 and Kp 10-7 (92.6%) groups was higher (P <0.05) to the Control (89.8%) and P-234 (83.8%) groups, the latter being lower (P <0.05) than all other treatments. Plasma membrane integrity and acrosome integrity (PMI/AI) evaluations showed that treatments with Kp addition were similar, (P> 0.05) Kp 10-5 (88.9%/90.9%), Kp 10-6 (90.7%/91.8%) and Kp 10-7 (90.2%/91.4%) and the P-234 antagonist (90.5%/90.8%), respectively. The Kp 10-6 treatment presented a superior result (P <0.05) to the Control group (87.9%/89.1%). When correlating the variables analyzed by confocal microscopy, a significant and positive correlation was observed between high mitochondrial potential and plasma membrane integrity (r = 0.80; P <0.0001), acrosome integrity and high mitochondrial potential (r = 0 , 80, P <0.0001), plasma membrane integrity and acrosome integrity (r = 0.84, P <0.0001). Finally, it can be concluded that the balanced concentration of Kp provided greater viability to bovine spermatozoa related to mitochondrial potential, acrosome integrity and plasma membrane. The P-234 antagonist presented a detrimental effect on the mitochondrial potential.