Antimicrobial activity of propolis extract fractions against Staphylococcus spp. isolated from goat mastitis / Atividade antimicrobiana de frações do extrato de própolis frente à Staphylococcus spp. isolados de mastite caprina

The indiscriminate use of antibiotics in the treatment of caprine mastitis causes the appearance of resistant microorganisms, besides leaving residues in milk, putting at risk to human health. In this way, propolis is an alternative in the treatment of diseases because it has antimicrobial activity, mainly because of the presence of flavonoids in its composition. The aim of this study was to evaluate the antimicrobial potential of propolis to Staphylococcus spp. Isolated from cases of goat mastitis and qualify the crude ethanoic extract by high performance liquid chromatography (HPLC). In this study, the minimum bactericidal concentration values of propolis extracts in ethanol, ethyl acetate and hexane showed that the best concentrations capable of promoting the highest mortality of the isolates of Staphylococcus spp. from mastitis in goats, were 6250, 3125 and 1562.5µg/mL, respectively. By the microplate adherence test, it was found that 20.78% isolates were not able to form biofilm, 14.70% were classified as moderate and 64.70% were weak and none as a strong biofilm producer. Propolis in its different diluents was able to affect the formation of biofilm and showed a pronounced marked antimicrobial activity against Staphylococcus spp. strains and may be indicated for use in in vivo studies.(AU)

O uso indiscriminado de antibióticos no tratamento de mastite caprina leva ao desenvolvimento de micro-organismos resistentes que poderão estar presentes em alimentos, colocando em risco a saúde humana. Dessa forma, a própolis surge como uma alternativa para o tratamento de doenças por possuir uma ação antimicrobiana, principalmente pela presença de flavonoides em sua composição. O objetivo desse estudo foi avaliar o potencial antimicrobiano da própolis frente à Staphylococcus spp. isolados de casos de mastite caprina e qualificar o extrato etanoico bruto por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE-DAD). Neste estudo, os valores de concentração bactericida mínima (CBM) dos extratos de própolis em álcool etílico, acetato de etila e hexano nos isolados foram de 6250, 3125 e 1562,5µg/mL, respectivamente. Pelo teste de aderência à microplacas, observou-se que 20,78% dos microorganismos, não foram capazes de formar biofilme, 14,70% foram classificados como moderados, 64,70% em fracos e nenhum como forte produtor de biofilme. A própolis em seus diferentes diluentes foi capaz de afetar a formação de biofilme e apresentou significativa atividade antimicrobiana frente a cepas de Staphylococcus spp., podendo ser indicada para utilização em estudos "in vivo".(AU)

Antimicrobial activity of propolis extract fractions against Staphylococcus spp. isolated from goat mastitis / Atividade antimicrobiana de frações do extrato de própolis frente à Staphylococcus spp. isolados de mastite caprina

The indiscriminate use of antibiotics in the treatment of caprine mastitis causes the appearance of resistant microorganisms, besides leaving residues in milk, putting at risk to human health. In this way, propolis is an alternative in the treatment of diseases because it has antimicrobial activity, mainly because of the presence of flavonoids in its composition. The aim of this study was to evaluate the antimicrobial potential of propolis to Staphylococcus spp. Isolated from cases of goat mastitis and qualify the crude ethanoic extract by high performance liquid chromatography (HPLC). In this study, the minimum bactericidal concentration values of propolis extracts in ethanol, ethyl acetate and hexane showed that the best concentrations capable of promoting the highest mortality of the isolates of Staphylococcus spp. from mastitis in goats, were 6250, 3125 and 1562.5µg/mL, respectively. By the microplate adherence test, it was found that 20.78% isolates were not able to form biofilm, 14.70% were classified as moderate and 64.70% were weak and none as a strong biofilm producer. Propolis in its different diluents was able to affect the formation of biofilm and showed a pronounced marked antimicrobial activity against Staphylococcus spp. strains and may be indicated for use in in vivo studies.(AU)

O uso indiscriminado de antibióticos no tratamento de mastite caprina leva ao desenvolvimento de micro-organismos resistentes que poderão estar presentes em alimentos, colocando em risco a saúde humana. Dessa forma, a própolis surge como uma alternativa para o tratamento de doenças por possuir uma ação antimicrobiana, principalmente pela presença de flavonoides em sua composição. O objetivo desse estudo foi avaliar o potencial antimicrobiano da própolis frente à Staphylococcus spp. isolados de casos de mastite caprina e qualificar o extrato etanoico bruto por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE-DAD). Neste estudo, os valores de concentração bactericida mínima (CBM) dos extratos de própolis em álcool etílico, acetato de etila e hexano nos isolados foram de 6250, 3125 e 1562,5µg/mL, respectivamente. Pelo teste de aderência à microplacas, observou-se que 20,78% dos microorganismos, não foram capazes de formar biofilme, 14,70% foram classificados como moderados, 64,70% em fracos e nenhum como forte produtor de biofilme. A própolis em seus diferentes diluentes foi capaz de afetar a formação de biofilme e apresentou significativa atividade antimicrobiana frente a cepas de Staphylococcus spp., podendo ser indicada para utilização em estudos "in vivo".(AU)

Antimicrobial activity of propolis extract fractions against Staphylococcus spp. isolated from goat mastitis

ABSTRACT: The indiscriminate use of antibiotics in the treatment of caprine mastitis causes the appearance of resistant microorganisms, besides leaving residues in milk, putting at risk to human health. In this way, propolis is an alternative in the treatment of diseases because it has antimicrobial activity, mainly because of the presence of flavonoids in its composition. The aim of this study was to evaluate the antimicrobial potential of propolis to Staphylococcus spp. Isolated from cases of goat mastitis and qualify the crude ethanoic extract by high performance liquid chromatography (HPLC). In this study, the minimum bactericidal concentration values of propolis extracts in ethanol, ethyl acetate and hexane showed that the best concentrations capable of promoting the highest mortality of the isolates of Staphylococcus spp. from mastitis in goats, were 6250, 3125 and 1562.5g/mL, respectively. By the microplate adherence test, it was found that 20.78% isolates were not able to form biofilm, 14.70% were classified as moderate and 64.70% were weak and none as a strong biofilm producer. Propolis in its different diluents was able to affect the formation of biofilm and showed a pronounced marked antimicrobial activity against Staphylococcus spp. strains and may be indicated for use in in vivo studies.

RESUMO: O uso indiscriminado de antibióticos no tratamento de mastite caprina leva ao desenvolvimento de micro-organismos resistentes que poderão estar presentes em alimentos, colocando em risco a saúde humana. Dessa forma, a própolis surge como uma alternativa para o tratamento de doenças por possuir uma ação antimicrobiana, principalmente pela presença de flavonoides em sua composição. O objetivo desse estudo foi avaliar o potencial antimicrobiano da própolis frente à Staphylococcus spp. isolados de casos de mastite caprina e qualificar o extrato etanoico bruto por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE-DAD). Neste estudo, os valores de concentração bactericida mínima (CBM) dos extratos de própolis em álcool etílico, acetato de etila e hexano nos isolados foram de 6250, 3125 e 1562,5g/mL, respectivamente. Pelo teste de aderência à microplacas, observou-se que 20,78% dos microorganismos, não foram capazes de formar biofilme, 14,70% foram classificados como moderados, 64,70% em fracos e nenhum como forte produtor de biofilme. A própolis em seus diferentes diluentes foi capaz de afetar a formação de biofilme e apresentou significativa atividade antimicrobiana frente a cepas de Staphylococcus spp., podendo ser indicada para utilização em estudos in vivo.

CARACTERIZAÇÃO GENÔMICA DE ESTIRPES DE STAPHYLOCOCCUS CAPRAE: IMPLICAÇÕES PARA A QUALIDADE E SEGURANÇA DO LEITE CAPRINO

Objetivou-se, por meio do presente estudo, caracterizar o genoma de Staphylococcus caprae (S. caprae), uma bactéria do grupo dos Staphylococcus coagulase negativos (CoNS), associada à mastite subclínica em cabras na Paraíba e suas implicações na qualidade do leite produzido. No primeiro capítulo, foi apresentado um referencial teórico abrangendo os desafios relacionados às infecções intramamárias subclínicas na caprinocultura e seu impacto na qualidade e na segurança do leite e seus derivados. Adicionalmente, foram abordados avanços tecnológicos relacionados às pesquisas em microbiológa aplicada ao setor agropecuário. No segundo capítulo, objetivou-se caracterizar genomas de S. caprae isolados associados à mastite subclínica caprina no Estado da Paraíba, identificando fatores de virulência através de análises de bioinformática. Para isso, foram selecionadas, da bacterioteca do Laboratório de Avaliação dos Produtos de Origem Animal (LAPOA), três cepas originalmente isoladas de leite caprino com mastite subclínica e previamente identificadas por MALDI-TOF. Foi realizado sequenciamento do genoma completo dessas cepas em plataforma Illumina Miseq, montagem do genoma pelo método de novo e anotação. Foram realizados estudos genômicos comparativos com outras espécies de Staphylococcus spp., buscando-se identificar genes de interesse relacionados a produção de enterotoxinas e à formação de biofilme. Foi realizado ainda um estudo filogenético utilizando 29 cepas de Staphylococcus spp., incluindo os genomas sequenciados neste estudo. Os resultados mostraram que as cepas de S. caprae isoladas de mastite caprina no Estado da Paraíba possuem elevado potencial de produção de biofilme, uma vez que todas apresentaram o operon icaADBCR. Adicionalmente, as estirpes investigadas apresentaram genes codificadores de enterotoxinas (sec, sed, seg), podendo representar um problema em saúde pública associada à intoxicação alimentar estafilocócica em seres humanos. Portanto, os resultados reforçam a necessidade de manter um programa de controle sanitário visando a redução de Staphylococcus coagulase-negativos em rebanhos caprinos, que por sua vez, apresentam-se como espécies predominantes em casos de infecções intramamária em pequenos ruminantes.

The aim of this study was to characterize the genome of Staphylococcus caprae (S. caprae), a bacterium of coagulase-negative staphylococci (CoNS) group, associated with subclinical mastitis in dairy goat herds in Paraíba state and its implications for the quality and safety goat milk. The first chapter refers to a review covering the challenges associated with subclinical mastitis in the dairy goat sector, and the technological advances applied to research in agricultural microbiology. The second chapter presents the genome analyses of S. caprae strains associated with subclinical mastitis in goat herds in Paraíba, in which virulence factors were identified by means of downstream bioinformatics tools. S. caprae strains originally isolated from milk of goats with subclinical mastitis were selected from the collection of the Laboratory for the Evaluation of Animal Products, and confirmed by MALDI-TOF. After whole genome sequencing using Illumina high-throughput sequencing, de novo assembling and annotation, comparative genomic analyses were carried out using 26 publicly available genomes of coagulase-negative Staphylococcus strains. The results showed that S. caprae associated with subclinical mastitis in goat herds in Paraíba has great capacity for biofilm production, as all strains carried the operon icaADBCR. In addition, the investigated strains may represent a burden to public health as they carried genes encoding for staphylococcal enterotoxins (sec, sed, seg) associated with food poisoning in humans. In summary, the results reinforce the need to reduce coagulase-negative staphylococci infections in goat herds, as they represent species associated with subclinical intramammary infections in small ruminants.

Isolamento e identificação de microrganismos potencialmente patogênicos em leite caprino

A mastite subclínica caprina ocasiona prejuízos econômicos em decorrência do descarte, dos gastos com medidas terapêuticas e da redução da quantidade e qualidade do leite e seus derivados. Este trabalho teve como objetivo determinar a ocorrência, a etiologia da mastite subclínica e identificar Estafilococcus coagulase negativo (ECN) por PCR bem como identificar a presença de ECN resistente a meticilina ou com produção de biofilme além de, constatar os fatores de risco associados à infecção. Nesse estudo, 372 amostras de leite de cabra in natura a partir de 186 animais, provenientes de 10 propriedades leiteiras no estado da Paraíba, foram avaliadas pelo teste da caneca telada, California Mastitis Test (CMT) e exame bacteriológico. Após o resultado do microbiológico, as 24 amostras de leite que apresentaram apenas ECN foram encaminhadas ao laboratório de Biologia molecular da Embrapa Tabuleiros Costeiros para a extração de DNA diretamente do leite. Os fragmentos contendo os genes de interesse foram amplificados, a partir de DNA genômico de cepas isoladas, por PCR utilizandose os primers específicos para a amplificação dos genes em estudo. No teste da caneca rastreados e CMT, 3,22% e 43,90% das amostras foram positivas, respectivamente. No exame bacteriológico, 19,35 % para o número de glândulas e 38,70 % das cabras foram positivas e o patógeno mais frequente entre isolados puros ou em associação foi Staphylococcus coagulase negativa (28,25%). Fazer limpeza frequente nas instalações, isolar animais doentes, possuir sala de ordenha e higienização dos tetos antes da ordenha foram os maiores riscos associados à infecção da glândula mamária em cabras leiteiras. Baseado neste estudo pode-se ampliar o estudo da etiologia da mastite caprina subclínica, possibilitando realizar extrações diretamente do leite e com amostras apresentando diferentes tipos de bactérias.

The goats subclinical mastitis causes economic losses due to disposal, spending on therapeutic measures and reducing the quantity and quality of milk and its derivatives. This study aimed to determine the incidence, etiology of subclinical mastitis and identify coagulase negative Staphylococcus (CNS) by PCR and identify the presence of ECN methicillin resistant or biofilm production beyond, note the risk factors associated with infection. In this study, 372 samples of goat milk fresh from 186 animals from 10 dairy farms in the state of Paraiba, were evaluated by testing the screened mug, California Mastitis Test (CMT) and bacteriological examination. After the results of the microbiological, the 24 milk samples showed that Staphylococcus coagulase negative were sent to the molecular biology laboratory of the Embrapa Coastal Tablelands for DNA extraction directly from milk. The fragments containing the genes of interest were amplified from genomic DNA isolated strains by PCR using primers specific for the amplification of genes in study. In the test the screened mug and CMT, 3.22% and 43.90% of the samples were positive, respectively. In bacteriological examination, 19.35% for the number of glands and 38.70% of the goats were positive and the most common pathogen among pure alone or in combination was coagulase negative Staphylococcus (28.25%). Make frequent cleaning the premises, isolate sick animals, have milking parlor hygiene and ceilings before milking were the biggest risks associated with infection of the mammary gland of goats. Based on this study can further the study of the etiology of subclinical mastitis goat, allowing perform extractions directly from milk samples and presenting different types of bacteria.

Efeito do est?gio de lactação e da ordem de parto sobre o conteúdo celular do leite de cabras mestiças

Os efeitos do estágio de lactação e da ordem de parto sobre o conteúdo de células somáticas foram estudados através do California Mastitis Test (CMT) e da Contagem de Células Somáticas (CCS). Durante sete meses foram feitas coletas quinzenais de leite em 143 cabras mestiças pertencentes ao rebanho leiteiro da Embrapa Caprinos e apenas as amostras negativas ao exame bacteriológico foram submetidas à CCS. Observou-se efeito significativo (P 0,05) do estágio de lactação e da ordem de parto sobre a CCS e o CMT. A média da contagem de células somáticas para toda a lactação foi de 820 x 103 céls/mL, enquanto que a média para o CMT foi de 1,0 (reação traços). Os resultados demonstraram que os fatores fisiológicos analisados neste estudo interferem no conteúdo celular da glândula mamária de cabras e devem ser levados em consideração no momento da interpretação dos testes diagnósticos da mastite subclínica nesta espécie animal.

EFEITO DO EST?GIO DE LACTAÇÃO E DA ORDEM DE PARTO SOBRE O CONTEÚDO CELULAR DO LEITE DE CABRAS MESTIÇAS

Os efeitos do estágio de lactação e da ordem de parto sobre o conteúdo de células somáticas foram estudados através do California Mastitis Test (CMT) e da Contagem de Células Somáticas (CCS). Durante sete meses foram feitas coletas quinzenais de leite em 143 cabras mestiças pertencentes ao rebanho leiteiro da Embrapa Caprinos e apenas as amostras negativas ao exame bacteriológico foram submetidas à CCS. Observou-se efeito significativo (P 0,05) do estágio de lactação e da ordem de parto sobre a CCS e o CMT. A média da contagem de células somáticas para toda a lactação foi de 820 x 103 céls/mL, enquanto que a média para o CMT foi de 1,0 (reação traços). Os resultados demonstraram que os fatores fisiológicos analisados neste estudo interferem no conteúdo celular da glândula mamária de cabras e devem ser levados em consideração no momento da interpretação dos testes diagnósticos da mastite subclínica nesta espécie animal.

Comparação entre técnicas de diagnóstico e fatores de risco associados à mastite caprina

A produção leiteira no vale do São Francisco é considerada importante atividade econômica que visa garantir a produtividade em pequenas propriedades rurais. Entretanto, a mastite se constitui uma grave fonte de prejuízos, seja pela redução na quantidade e qualidade do leite produzido, como nos gastos com medicamentos e serviços veterinários. Objetivou-se avaliar as condições de criação de caprinos leiteiros, conhecer os fatores de risco bem como os principais patógenos da mastite nesses animais, correlacionar técnicas de detecção da mastite subclínica, além de caracterizar, fenotípica e genotipicamente, micro-organismos formadores de biofilmes. Foram visitadas 16 propriedades localizadas em Pernambuco onde foram aplicados questionários e, posteriormente, coletou-se amostras de leite de 269 cabras, totalizando 538 amostras. Foram realizados os testes de California Mastitis Test (CMT), lactocultura e citologia de expressão, além das técnicas de violeta de Genciana e PCR para determinar o potencial de produção de biofilme dos micro-organismos. Foram isoladas 95 cepas de Staphylococcus sendo, em sua maioria, do grupo dos coagulase-negativos. Quanto à análise de concordância entre CMT, lactocultura e citologia de expressão, os valores relativos ao índice kappa foram: K=0,13, K=0,03 e K=0,05, para CMT, citologia de expressão entre 50 e 70% de neutrófilos e com quantidade de neutrófilos acima de 70%, respectivamente. Observou-se que o número de animais do rebanho, pasto inadequado, fonte de água de origem duvidosa, aquisição de animais de propriedades vizinhas, mão-de-obra familiar, assistência veterinária e realização de pós-dipping, são fatores associados à presença de infecção da glândula mamária em cabras leiteiras. No estudo feito para análise de biofilme, 75 isolados foram produtores de biofilme em placas, sendo que 38 apresentaram o gene icaD. As práticas de manejo adotadas devem estar adequadas para uma criação leiteira, de forma a não comprometer a qualidade do leite, evitando o aparecimento de micro-organismos resistentes e, consequentemente, melhorando a produção. Palavras-chave: mastite caprina, CMT, Staphylococcus spp., biofilme, PCR

Genotipagem e avaliação do potencial enterotoxigênico de amostras de Staphylococcus aureus isoladas de mastite caprina e bovina

O objetivo deste trabalho foi o de identificar subtipos de Staphylococcus aureus isolados de mastite caprina e bovina, por meio da análise do polimorfismo do gene da proteína coagulase. Adicionalmente, pesquisou-se a presença de genes que codificam para as enterotoxinas estafilocócicas dos tipos A, B e C. Utilizaram-se 36 amostras de Staphylococcus aureus isoladas do leite de cabras pertencentes a rebanhos localizados nas regiões Norte do Ceará e Serrana do Rio de Janeiro e 64 amostras isoladas do leite de vacas pertencentes a rebanhos localizados em municipios de Minas Gerais. Dentre os isolados de origem caprina identidicaram-se 11 diferentes genótipos, sendo que nos rebanhos da região Norte do Ceará o tipo predominate foi encontrado em 60% das amostrasm enquanto, nos rebanhos da região Serrana, os dois tipos indicou unma relação entre os mesmos. Dentre as amostras de origem bovina foram identificados 49 genótipos com os 10 mais friquentes agrupando 39% das amostras. A presença de algum dos genes que codificam para as enterotoxinas pesquisadas foi detactada em 37% das amostras positivas para o gene sec. Das amostras de origem caprina, 86% foram positivas para a presença do gene sec. A produção en vitro da enterotoxina foi detectada em todas as amostras nas quais o gene correspondente estava presente

The aim of this study was to identify subtypes of Staphylococcus aureus isolated from goat and bovine mastitis, by analyzing the polymorphism of coagulase gene protein. Additionally, surveyed for the presence of genes coding for staphylococcal enterotoxin types A, B and C. We used 36 strains of Staphylococcus aureus isolated from goats belonging to herds in the North of Ceará and Serrana do Rio de Janeiro and 64 strains isolated from milk of cows belonging to herds in the municipalities of Minas Gerais. Among the isolates of caprine origin are indentified 11 different genotypes, and the herds from northern Ceara predominate type was found in 60% of amostrasm while in flocks of mountain region, the two types indicated UNMA relationship between them. Among the samples of bovine origin were identified 49 genotypes with 10 more friquentes grouping 39% of samples. The presence of some genes encoding enterotoxins was investigated detactada in 37% of positive samples for gene sec. Samples of goat origin, 86% were positive for the gene sec. Production en vitro enterotoxin was detected in all samples in which the corresponding gene was present