Metagenômica ruminal de cabras leiteiras alimentadas com dietas adicionadas ou não de tanino

A caprinocultura é uma importante fonte de renda e alimento em ambientes extremos (altas temperaturas e baixa umidade), como o semiárido nordestino brasileiro, com curtos período chuvosos. No período da chuva, a vegetação abundante e de qualidade. Porém, na maior parte do ano, no período seco, esses alimentos são escassos e de qualidade nutricional reduzida, e apresentam altos índices de compostos secundários, como os taninos. Esses compostos apresentam características físico-químicas que lhe concedem diversas aplicações, desde controle de endoparasitas e modulação da microbiota ruminal. Diante de tais qualidades, a sua utilização tem sido bastante estudada nos mais diversos contextos produtivos e biotecnológicos. Até o presente momento, poucos trabalhos estudaram como os taninos modulam a microbiota ruminal nas espécies domésticas de ruminantes. Sendo assim, objetivou-se com este trabalho caracterizar os perfis funcionais de caprinos nativos submetidos a dietas com e sem adição de tanino condensados, utilizando a metagenômica total do liquido ruminal, com o intuito de melhor entender como esse microbioma se comporta frente a esse composto, e quais vias metabólicas, genes e funções possuem suas abundâncias modificadas. Doze caprinos nativos das raças Canindé e Repartida foram submetidos a dietas com e sem adição de tanino (5%). Esses animais foram distribuídos em quatro grupos de três animais cada, em um esquema fatorial 2x2, onde se avaliou os efeitos dos fatores dieta e raça. Ao final do período experimental foi coletado líquido ruminal de cada animal, de onde o DNA total foi extraído e utilizado para sequenciamento de metagenoma total. O controle de qualidade das sequencias foi feita no Trimmomatic, os metagenomas foram montados e avaliados os genes foram identificados e anotados utilizando o MegaHit e Metaquast, MetaProdigal, InterproScan respetivamente, e as análises estatísticas para identificação dos genes diferencialmente presentes no edgeR. Verificou-se que o tanino na dieta produziu alterações funcionais no rúmen dos animais desafiados. Na raça Canindé, a concentração testada produziu alterações mais intensas do que nos animais da raça Repartida. Nos animais desafiados foram identificados genes envolvidos com e metabolismo de carboidratos e peptidoglicano aumentados e, diminuição de genes de enzimas de hidrólise de ligações glicosídicas e biossíntese microbiana de cobalamina, bem como diminuição na contagem de sequências pertencentes a endoparasitas.

Goat farming is an important source of income and food in extreme environments (high temperatures and low humidity), such as the Brazilian northeastern semiarid region, which has a low concentration of rainfall, with short rainy periods. During this period of rain, there is abundant vegetation and excellent quality for the animals' diet. However, for most of the year, when the period is dry, these foods are scarce and of reduced nutritional quality, and still have high levels of secondary compounds, among which tannins stand out. This group of compounds has physicochemical characteristics that grant it several applications, such as endoparasite control and modulation of the ruminal microbiota. Given these qualities, its use has been extensively studied in the most diverse productive and biotechnological contexts. So far, few studies have studied how tannins modulate the ruminal microbiota in domestic ruminant species. Thus, the objective of this work was to characterize the functional profiles of native goats fed diets with and without the addition of commercial condensed tannin, using the total metagenomics of the rumen fluid, to better understand how this microbiome behaves against this compound, and which metabolic pathways, genes and functions have their abundances modified. Twelve native goats of the Canindé and Repartida breeds were fed diets with and without addition of tannin (5%). These animals were distributed into four groups of three animals each, in a 2x2 factorial scheme, where the effects of diet and race factors were evaluated. At the end of the experimental period, ruminal fluid was collected from each animal, from which the total DNA was extracted and used for metagenoma sequencing, The quality control of the sequences was carried out in Trimmomatic, the metagenomes were assembled and evaluated, the genes were identified and annotated using MegaHit and Metaquast, MetaProdigal, InterproScan respectively, and statistical analysis to identify genes differentially present in edgeR. It was found that tannin in the diet produced functional changes in the rumen of challenged animals. In the Canindé breed, the concentration tested produced more intense changes than in the Repartida breed. In challenged animals, genes involved with increased carbohydrate and peptidoglycan metabolism and decreased glycosidic bond hydrolysis enzyme genes and microbial cobalamin biosynthesis, as well as decreased sequence count belonging to endoparasites were identified.

DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO MICROBIOMA DA CONJUNTIVA OCULAR DE CÃES SEM AFECÇÕES OFTALMOLÓGICAS

A conjuntiva ocular desempenha um papel importante na função lacrimal, na proteção imunológica do olho, nos movimentos oculares e na regeneração corneana, agindo como uma barreira à entrada de microrganismos. Infecções conjuntivais em cães são comuns e resultam tanto da invasão de microrganismos patogênicos, quanto do crescimento descontrolado da microbiota previamente existente. O presente estudo analisou a comunidade microbiana presente na conjuntiva ocular de uma população heterogênea de cães sem afecções oftalmológicas por meio de técnicas de Sequenciamento de Última Geração (NGS). Suabes conjuntivais foram coletados de ambos os olhos de 30 cães que, após o processamento, foram submetidos ao sequenciamento metagenômico através da plataforma Illumina. Foi identificada a predominância do filo Proteobacteria e dos gêneros Ralstonia e Burkholderia, além de uma minoria de fungos, enquanto vírus não foram encontrados. Por meio de sequenciamento de DNA microbiano total, o presente estudo trouxe novos dados a respeito deste tema, demonstrando a presença de organismos não-cultiváveis e previamente desconhecidos como parte do ambiente ocular. Como a conjuntivite é uma afecção comum que afeta o bem-estar e a qualidade de vida dos cães, portanto, é importante conhecer a microbiota conjuntival para entender os processos infecciosos que afetam este sítio e assim direcionar os tratamentos empregados de forma racional.

The conjunctiva plays essential role in the lacrimal function, immune protection of the eye, eye mobility and corneal regeneration, acting as a barrier to the entry of microorganisms. Conjunctival infections are common in dogs and result from both the invasion of pathogenic microorganisms and the uncontrolled growth of the existing microbiota. The present study analyzed the microbial community present on the ocular conjunctivae of a heterogeneous dog population without ophthalmological disorders by New Generation Sequencing (NGS) techniques. Conjunctival swabs were collected from both eyes of 30 dogs, which after processing were subjected to NGS sequencing through the Illumina platform. A predominance of the phylum Proteobacteria and the genera Ralstonia and Burkholderia were identified along with a minority of fungi, while viruses were not found. Through total microbial DNA sequencing, the present study have brought new data on this subject showing the presence of non-cultivable organisms that were previously unknown as part of the ocular environment. As conjunctivitis is a common condition that affects welfare and life quality of dogs, so it is important to know the microbiota of the conjunctiva in order to understand the infectious processes that affect it and to direct the treatments employed rationally.

Aspectos clínicos e epidemiológicos e avaliação da disbiose cutânea em cães com dermatite atópica.

A dermatite atópica (DA) é uma doença cutânea pruriginosa, inflamatória, crônica associada a anticorpos IgE alérgeno-específicos principalmente voltados contra alérgenos ambientais. A DA afeta diversas espécies, incluindo cães e humanos e o prurido é o seu principal sinal clínico. Além disso, cães atópicos tendem a apresentar quadros recorrentes de piodermites bacterianas, associadas a alterações no microbioma tegumentar. Em alguns casos, os pacientes apresentam sinais clínicos típicos de DA, mas anticorpos IgE alérgeno-específicos não podem ser detectados. Este subtipo de DA é chamado de dermatite atópica-like (ALD). Tanto as alterações no microbioma em cães atópicos quanto as características da ALD ainda são pouco estudadas em cães. Sendo assim, objetivou-se avaliar estes dois parâmetros distintos da DA. Para tal, o presente estudo foi dividido em duas partes. Na primeira parte, realizou-se um estudo retrospectivo dos prontuários de 269 cães atendidos no hospital veterinário universitário da University of Minnesota, entre 2007 e 2015. Os pacientes foram divididos em dois grupos (AD e ALD) de acordo com os resultados dos testes alérgicos. Foram avaliados e comparados entre os grupos dados epidemiológicos, gravidade da doença de acordo com o grau de prurido, número de áreas corpóreas afetadas, protocolo de tratamento de manutenção e resposta à terapia. A partir do grau médio de prurido e do número médio de áreas corpóreas afetadas ao longo das visitas, foi criado um índice de gravidade da dermatite atópica (CADSI) para se avaliar a intensidade da doença em cada paciente e comparar entre os grupos ALD e AD. No grupo AD foram incluídos 228 cães (84,76%) e 41 no grupo ALD (15,24%). Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos nas variáveis epidemiológicas. Em relação à predisposição racial, o Bichon Frisé apresentou mais risco de desenvolver ALD. Não houve diferença significativa no grau médio de prurido e número de áreas corpóreas afetadas na primeira visita ou durante o tratamento entre os grupos, bem como na evolução dessas variáveis ao longo das visitas. Quando o CADSI foi comparado entre os grupos, não houve diferença. Na segunda parte, foram selecionados prospectivamente sete cães atópicos com manifestações clínicas sazonais, alocados no Grupo Atópico (GA) e dez cães saudáveis, alocados no Grupo Controle (GC) e amostras foram coletadas da região interdigital, axilar, abdominal e lombar utilizando um suabe estéril. No GC, realizou-se seis coletas intervaladas de quatro semanas. No GA, as amostras foram coletadas quatro semanas antes do mês típico de crise (Pré-crise), na crise antes de iniciar o tratamento (Crise), durante a crise com tratamento (Tratamento) e após a estação de crise, já sem tratamento (Pós-crise). Após as coletas, as amostras foram armazenadas refrigeradas por no máximo sete dias até a extração do DNA e sequenciamento do gene 16S rRNA. Após o processamento, foi feita a análise bioinformática e estatística para avaliação taxonômica e cálculo de alpha e beta-diversidade. Os filos mais abundantes em todas as amostras foram Actinobacteria, Firmicutes, Fusobacteria e Proteobacteria. Observou-se que a diversidade do microbioma cutâneo de cães atópicos sofre redução no Pré-crise e o tratamento imunomodulador é capaz de restabelecê-la. Estes resultados são muito relevantes e promissores pois demonstram as alterações na diversidade do microbioma antes mesmo do surgimento dos sinais clínicos da doença e o papel restaurador da terapia imunomoduladora, sem o uso de antimicrobianos.

Atopic dermatitis (AD) is a chronic inflammatory, pruritic skin disease associated with allergenspecific IgE antibodies primarily against environmental allergens. AD affects several species, including dogs and humans. Pruritus is the main clinical sign of AD. In addition, atopic dogs tend to present recurrent superficial pyoderma, associated with alterations in the skin microbiome. In some cases, patients show typical clinical signs of AD, but allergen-specific IgE antibodies cannot be detected. This subtype of AD is called atopic-like dermatitis (ALD). Both the alterations in the skin microbiome of atopic dogs and the features of ALD are still poorly understood in dogs. Thus, we aimed to evaluate these two distinct parameters of AD. So, the present study was divided in two parts. In the first part, a retrospective study of the medical records of 269 dogs seen at the veterinary teaching hospital of the University of Minnesota between 2007 and 2015 was performed. Patients were divided in two groups (AD and ALD) according to the allergy tests results. Epidemiological data, disease severity according pruritus level, number of affected body sites, maintenance treatment protocol and response to therapy were evaluated and compared between the groups. The mean pruritus level and the mean number of body sites affected across visits, the Canine Atopic Dermatitis Severity Index (CADSI) was created to assess the severity of the disease in each patient and to compare ALD and AD. In the AD group, 228 dogs (84.76%) were included and in the ALD group, 41 (15.24%). There were no significant differences between the groups in the epidemiological variables. In relation to breed predisposition, Bichon Frisé was more predisposed to developing ALD. There was no significant difference in the mean pruritus level and number of affected areas at the first visit or during treatment between groups, as well as in the outcome of these variables throughout the visits. When CADSI was compared between groups, there was no significant difference. In the second part, were selected prospectively seven seasonal atopic dogs, Atopic Group (GA), and ten healthy dogs, Control Group (CG). Samples were collected from the interdigital, axillary, abdominal and lumbar regions from each dog using a sterile swab. In GC, six collections in a of four week interval were performed. In GA, the samples were collected four weeks prior the typical flare month (Pre-crisis), in the flare before starting the treatment (Flare), during the flare with treatment (Treatment) and after the flare season without treatment (Post-flare). After collection, samples were stored refrigerated for up to seven days until DNA extraction and sequencing of the 16S rRNA gene. After processing, bioinformatic and statistical analysis were performed for taxonomic evaluation and alpha and beta-diversity assessment. The most abundant phyla in all samples were Actinobacteria, Firmicutes, Fusobacteria and Proteobacteria. It was observed that the diversity of the cutaneous microbiome of atopic dogs undergoes a reduction the Pre-flare and the immunomodulatory treatment is able to reestablish it. These results are very relevant and promising as they demonstrate changes in microbiome diversity even before the inflammatory response of the disease and the restorative role of immunomodulatory therapy without the use of antimicrobials.

AVALIAÇÃO DO IMPACTO DO LODO DE ESGOTO NA MICROBIOTA DO SOLO UTILIZANDO O GENE 16S rRNA

ABSTRACT The objective of this work was to evaluate and compare the microbial diversity of a soil treated with sewage sludge (BAR 1N) with the same soil without treatment (control). The use of industrial and domestic sewer sludge as organic fertilizer in agricultural soils is currently considered a promising alternative for the final destination of these residues. Molecular studies using the analysis of the gene 16S rRNA provide relevant information in regard to studies of microbial ecology, since it is believed that only 10% of these microorganisms can be cultivated. The sequences were submitted to analysis of nucleotide similarity, based on data in GenBank, in order to be identified and classified. Following phylogram analysis, a high number of nonidentified microorganisms were observed in the investigated soils. The results demonstrated that the outstanding bacterial phyla were Acidobacteria and Proteobacteria. Phylogenetic analyses revealed differences in both soils, based on the bacterial diversity index, showing that the test soil had more diversity when compared to the BAR 1N soil.

RESUMO Este trabalho teve por objetivo estimar e comparar a diversidade microbiana de um solo tratado com lodo de esgoto (BAR 1N) com o mesmo solo sem tratamento (controle). A utilização do lodo de esgoto de origem industrial ou domiciliar em solos agrícolas como adubo orgânico é considerado, atualmente, uma alternativa promissora para disposição final deste resíduo. Estudos moleculares que utilizam a análise do gene 16S rRNA permitem a obtenção de informações relevantes acerca da ecologia microbiana, pois acredita-se que apenas 10% desses microorganismos podem ser cultivados. O DNA genômico dos micro-organismos presentes em ambos os solos foi extraído, clonado e, após amplificação por PCR, foi feito o sequenciamento do gene 16S rRNA. As sequências obtidas foram submetidas à análise de similaridade de nucleotídeos com o banco de dados GenBank para que pudessem ser identificadas e classificadas. Após a análise dos filogramas observou-se um número elevado de micro-organismos não identificados nos solos analisados. Os resultados demonstraram que os filos bacterianos que se destacaram foram Acidobacteria e Proteobacteria. Análises filogenéticas revelaram diferenças entre os solos, mostrando por meio de índice de diversidade bacteriana que o solo controle apresentou maior diversidade quando comparado ao solo BAR 1N. O filo Nitrospira revelou-se significativamente afetado pela aplicação do lodo de esgoto.

Molecular characterization of bacterial populations of different soils

Until recently, few studies were carried out in Brazil about diversity of bacterial soil communities. Aiming to characterize the bacterial population in the soil through 16S rRNA analysis, two types of soil have been analyzed: one of them characterized by intensive use where tomato, beans and corn were cultivated (CS); the other analyzed soil was under forest (FS), unchanged by man; both located in Guaíra, São Paulo State, Brazil. Using specific primers, 16S rRNA genes from metagenomic DNA in both soils were amplified by PCR, amplicons were cloned and 139 clones from two libraries were partially sequenced. The use of 16S rRNA analysis allowed identification of several bacterial populations in the soil belonging to the following phyla: Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria Verrucomicrobia in addition to the others that were not classified, beyond Archaea domain. Differences between FS and CS libraries were observed in size phyla. A larger number of phyla and, consequently, a greater bacterial diversity were found in the under-forest soil. These data were confirmed by the analyses of genetic diversity that have been carried out. The characterization of bacterial communities of soil has made its contribution by providing facts for further studies on the dynamics of bacterial populations in different soil conditions in Brazil.

Até o momento poucos estudos foram realizados no Brasil a respeito da diversidade de comunidades bacterianas no solo. Com o objetivo de caracterizar as populações bacterianas presentes no solo através da análise do gene 16S rRNA, foram analisados dois solos: um caracterizado pelo uso intensivo, principalmente para a produção de tomate, feijão e milho (CS); e outro sob floresta (FS), não modificado pelo homem, ambos do município de Guaíra, no estado de São Paulo, Brasil. Usando oligonucleotídeos específicos, de genes 16S rRNA do DNA metagenomico de ambos os solos foram amplificados por PCR, amplicons foram clonados e 139 clones de duas bibliotecas foram seqüenciados. O uso da técnica de 16S rRNA, gerou a identificação de diferentes populações de bactérias de solo pertencentes aos filos Acidobacteria Actinobacteria Bacteroidetes Firmicutes Proteobacteria Verrucomicrobia, Archaea, além das não classificadas. Diferenças entre as bibliotecas FS e CS foram observadas no tamanho dos filos. Um grande número de filos e, consequentemente, uma grande diversidade bacteriana foi observada no solo sob floresta. Estes dados foram confirmados pela análise de diversidade genética realizada. A caracterização de comunidades do solo apresentada neste trabalho contribuiu fornecendo dados para estudos posteriores sobre a dinâmica das populações bacterianas em solos de diferentes condições no Brasil.