Development and assessment of a latex agglutination test based on recombinant MSP5 to detect antibodies against Anaplasma marginale in cattle

The recombinant protein MSP5 has been established as an important antigen for serological diagnosis of Anaplasma marginale by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). However, due to the high cost of specialized equipment, this technique is not accessible to all laboratories, especially in developing countries in areas where the disease is endemic. The present study describes the standardization of a latex agglutination test (LAT) to detect antibodies against A. marginale based on recombinant MSP5. Compared with indirect enzyme-linked immunosorbent assay (iELISA), the relative sensitivity and specificity of the LAT were 95.21% and 91.86% respectively, with an almost perfect agreement between tests (kappa index = 0.863). These results can be considered important for the serological diagnosis of A. marginale, as they indicate that the test represents a rapid and low cost alternative to ELISA.(AU)

Detecção sorológica e molecular de Anaplasma marginale em búfalos na Ilha de Marajó, Pará / Serological and molecular detection of Anaplasma marginale in water buffaloes on Marajó Island, State of Pará, Brazil

O objetivo do estudo foi testar a prevalência sorológica e molecular de Anaplasma marginale em búfalos do municipio de Soure, Ilha de Marajó, estado do Pará, Brasil. Para a pesquisa sorologica foram selecionados randomicamente 800 animais e para a pesquisa molecular 50 destes animais foram aleatoriamente escolhidos. Para quantificar a prevalência sorológica utilizou-se o ensaio de imunoadsorção enzimático indireto (iELISA) com antígeno total contendo proteínas de superfície externa e para quantificar a prevalência molecular utilizou-se a reação em cadeia da polimerase (PCR), envolvendo a amplificação de fragmento gênico da proteína de superfície maior 5 (MSP5). A prevalência de animais positivos no ELISA para A. marginale foi de 25% (200/800). Na PCR foi detectada a presença de A. marginale em 2% (1/50) dos animais. Embora apenas um animal tenha sido positivo na PCR, observou-se que o mesmo foi negativo no ELISA. A presença do agente, mesmo em baixa prevalência, mostra que os bubalinos podem funcionar como um importante reservatório desse patógeno para os rebanhos bovinos da região norte do Brasil.(AU)

The aim of the study was to test the molecular and serological prevalence of Anaplasma marginale in water buffaloes of the Marajó Island, State of Pará, Brazil. For serologic research were randomly selected 800 buffaloes and for molecular research 50 of these animals were randomly chosen. To quantify the serological prevalence we used the indirect enzyme linked immunosorbent assay (iELISA) with total antigen containing proteins outer surface. To quantify the prevalence molecular was used the polymerase chain reaction (PCR) involving gene amplification fragment larger surface protein 5 (MSP5). The prevalence of positive animals in iELISA was 25% (200/800). In the PCR we detected the presence of A. marginale in 2% (1/50) of animals. Although only one animal was positive in PCR, we found that it was negative in ELISA. The presence of the agent, even in low prevalence, shows that buffaloes can act as an important reservoir for transmission of the pathogen to cattle in northern Brazil.(AU)

Molecular diagnosis of Anaplasma marginale in cattle: quantitative evaluation of a real-time PCR (Polymerase Chain Reaction) based on msp5 gene / Diagnóstico molecular de Anaplasma marginale em bovinos: avaliação quantitativa de uma PCR em tempo real baseada no gene msp5

The rickettsia Anaplasma marginale is considered the main agent of bovine anaplasmosis. Due the nonspecific clinical signs of the anaplasmosis, the diagnosis of infection depends of laboratory confirmation. In recent years, molecular diagnostic methods have been used to detect A. marginale in cattle. However, the existence of a large number of assays of different sensitivity and cost makes the choice of an appropriate test difficult. In the present study, a real-time Polymerase Chain Reaction (PCR) based on the msp5 target gene was quantitatively assessed and compared to an end point PCR. Both reactions were subjected to sensitivity and specificity evaluation using plasmid DNA and samples from cattle experimentally infected with A. marginale. A comparative field trial of the tests was carried out using samples of cattle from a stable enzootic area for A. marginale. The real-time PCR showed a higher sensitivity than the end point PCR. This reaction (i.e. real-time PCR) was able to detect one copy of the msp5 gene in 100 ηg of plasmidial DNA, and more than 80% of its results were positive among experimentally infected animals seven days after infection. In addition, based on in silico analysis, the real-time PCR evaluated in the present study appears to be useful for the detection of A. ovis.(AU)

A riquétsia Anaplasma marginale é considerada o principal agente da anaplasmose bovina. Devido a não especificidade dos sinais clínicos, a confirmação da infecção nos animais depende de testes laboratoriais. Recentemente, métodos de diagnóstico molecular têm sido aplicados para detecção de A. marginale em bovinos. No entanto, a grande quantidade de testes com diferentes sensibilidade e custos tem dificultado a escolha do ensaio mais adequado. No presente estudo, uma PCR em tempo real baseada no gene msp5 foi avaliada quantitativamente e comparada a uma reação de PCR convencional. As reações foram submetidas à avaliação de sensibilidade e especificidade com DNA plasmidial e amostras provenientes de bovinos experimentalmente infectados por A. marginale. Uma avaliação comparativa a campo foi realizada entre os testes utilizando amostras provenientes de bovinos criados em uma região de estabilidade enzoótica para A. marginale. Embora os testes não tenham apresentado diferença estatisticamente significativa, a PCR em tempo real apresentou valor de sensibilidade maior do que a PCR convencional. A PCR em tempo real foi capaz de detectar uma cópia de msp5 em 100ng de DNA plasmidial, e mais de 80% de resultados positivos entre bovinos experimentalmente infectados apenas sete dias após infecção. Além disso, baseado em análise in silico, a PCR em tempo real avaliada aqui pode ser útil para detecção de Anaplasma ovis.(AU)

Immune response of calves inoculated with proteins of Anaplasma marginale bound to an immunostimulant complex / Resposta imune de bezerros inoculados com proteínas de Anaplasma marginale ligadas a um complexo imunoestimulante

Despite our current knowledge of the immunology, pathology, and genetics of Anaplasma marginale, prevention in cattle is currently based on old standbys, including live attenuated vaccines, antibiotic treatment, and maintaining enzootic stability in cattle herds. In the present study, we evaluated the use of an immunostimulant complex (ISCOMATRIX) adjuvant, associated with a pool of recombinant major surface proteins (rMSP1a, rMSP1b, rMSP4 and rMSP5) to improve the humoral immune response triggered in calves mainly by IgG2. Ten calves were divided in three groups: 4 calves were inoculated with the ISCOMATRIX/rMSPs (G1); 2 calves were inoculated with ISCOMATRIX adjuvant (G2); and 4 calves received saline (G3). Three inoculations were administered at 21-day intervals. In G1, the calves showed significant increases in total IgG, IgG1 and IgG2 levels 21 days after the second inoculation, compared to the control group (p < 0.05), and G1 calves remained above the cut-off value 28 days after the third inoculation (p < 0.05). The post-immunized sera from calves in G1 reacted specifically for each of the rMSPs used. In conclusion, the ISCOMATRIX/rMSPs induced antigen-specific seroconversion in calves. Therefore, additional testing to explore the protection induced by rMSPs, both alone and in conjunction with proteins previously identified as subdominant epitopes, is warranted.

Apesar dos avanços da imunologia, patologia e genética de Anaplasma marginale, a prevenção em bovinos ainda é baseada nas vacinas vivas atenuadas, na terapia com antibiótico e estabilidade enzoótica dos rebanhos bovinos. No presente estudo, avaliou-se o uso de um complexo imunoestimulante (ISCOMATRIX), associado às proteínas recombinantes de superfície (rMSP1a, rMSP1b, rMSP4 e rMSP5) para melhorar a resposta imune humoral desencadeada em bezerros, principalmente por IgG2. Dez animais foram divididos em três grupos: 4 bezerros foram inoculados com o ISCOMATRIX/rMSPs (G1), 2 bezerros foram inoculados com ISCOMATRIX adjuvante (G2) e 4 bezerros receberam salina (G3). Três doses vacinais foram administradas em intervalos de 21 dias. No G1, os bezerros apresentaram aumentos significativos nos níveis de IgG total, IgG1 e IgG2 21 dias após a segunda inoculação, em comparação com o grupo de controle (p <0,05). Nos bezerros do G1 esses níveis de anticorpos permaneceram acima do ponto de corte 28 dias após a terceira inoculação (p < 0,05). Os soros pós-imunização de bezerros do G1 reagiram especificamente com cada uma das rMSPs utilizadas. Em conclusão, o ISCOMATRIX/rMSPs induziu soroconversão antígeno-específica em bezerros. Portanto, se justifica a realização de ensaios adicionais para explorar a proteção induzida pela rMSPs, tanto sozinhas como em conjunto com novas proteínas identificadas com epítopos subdominantes.

Immune response of calves inoculated with proteins ofAnaplasma marginale bound to an immunostimulant complex

Despite our current knowledge of the immunology, pathology, and genetics of Anaplasma marginale, prevention in cattle is currently based on old standbys, including live attenuated vaccines, antibiotic treatment, and maintaining enzootic stability in cattle herds. In the present study, we evaluated the use of an immunostimulant complex (ISCOMATRIX) adjuvant, associated with a pool of recombinant major surface proteins (rMSP1a, rMSP1b, rMSP4 and rMSP5) to improve the humoral immune response triggered in calves mainly by IgG2. Ten calves were divided in three groups: 4 calves were inoculated with the ISCOMATRIX/rMSPs (G1); 2 calves were inoculated with ISCOMATRIX adjuvant (G2); and 4 calves received saline (G3). Three inoculations were administered at 21-day intervals. In G1, the calves showed significant increases in total IgG, IgG1 and IgG2 levels 21 days after the second inoculation, compared to the control group (p 0.05), and G1 calves remained above the cut-off value 28 days after the third inoculation (p 0.05). The post-immunized sera from calves in G1 reacted specifically for each of the rMSPs used. In conclusion, the ISCOMATRIX/rMSPs induced antigen-specific seroconversion in calves. Therefore, additional testing to explore the protection induced by rMSPs, both alone and in conjunction with proteins previously identified as subdominant epitopes, is warranted.

Apesar dos avanços da imunologia, patologia e genética deAnaplasma marginale, a prevenção em bovinos ainda é baseada nas vacinas vivas atenuadas, na terapia com antibiótico e estabilidade enzoótica dos rebanhos bovinos. No presente estudo, avaliou-se o uso de um complexo imunoestimulante (ISCOMATRIX), associado ás proteínas recombinantes de superfície (rMSP1a, rMSP1b, rMSP4 e rMSP5) para melhorar a resposta imune humoral desencadeada em bezerros, principalmente por IgG2. Dez animais foram divididos em três grupos: 4 bezerros foram inoculados com o ISCOMATRIX/rMSPs (G1), 2 bezerros foram inoculados com ISCOMATRIX adjuvante (G2) e 4 bezerros receberam salina (G3). Três doses vacinais foram administradas em intervalos de 21 dias. No G1, os bezerros apresentaram aumentos significativos nos níveis de IgG total, IgG1 e IgG2 21 dias após a segunda inoculação, em comparação com o grupo de controle (p 0,05). Nos bezerros do G1 esses níveis de anticoprpos permaneceram acima do ponto de corte 28 dias após a terceira inoculação (p 0,05). Os soros pós-imunização de bezerros do G1 reagiram especificamente com cada uma das rMSPs utilizadas. Em conclusão, o ISCOMATRIX/rMSPs induziu soroconversão antígeno-específica em bezerros. Portanto, se justifica a realização de ensaios adicionais para explorar a proteção induzida pela rMSPs, tanto sozinhas como em conjunto com novas proteínas identificadas com epitopos subdominantes.

Soroprevalência de Anaplasma marginale em bovinos da região Centro-Sul do estado do Paraná, Brasil, por um teste imunoenzimático competitivo utilizando proteína recombinante MSP5-PR1

Anaplasma marginale prevalence was determined in 223 sera samples in 2-year old or older cattle, from the Center- Southern Region of the Paraná State, including Ponta Grossa, Guarapuava and Laranjeiras do Sul municipalities. A survey of antibodies IgG class against Anaplasma marginale was performed through a competitive immune absorbent assay (cELISA-PR1). From the 223 sera examined, 130 (58.74%) reacted to cELISA-PR1 test, suggesting an region of enzootic instability, with a significant percentage of animals susceptible to infection by A. marginale and potentially in risk to develop anaplasmosis. The kind of exploration in the property, the breeding and handling system, the presence of other animals (ovine/caprine, horses, wild animals), and means of commercialization of animals were analyzed. The statistical analysis showed that there were no significant differences among the analyzed variables.

Foi determinada a prevalência de Anaplasma marginale em 223 soros de bovinos com idade maior ou igual a dois anos, das regiões de Ponta Grossa, Guarapuava e Laranjeiras do Sul, região Centro-Sul do estado do Paraná. O teste imunoenzimático de competição PR1 (cELISA-PR1) foi utilizado para determinar a presença ou ausência de anticorpos anti-A. marginale. Dos 223 soros analisados, 130 (58,74%) foram positivos pelo cELISA-PR1, sugerindo ser essa região de instabilidade de enzoótica, com uma porcentagem significativa de animais susceptíveis à infecção por A. marginale, com risco potencial para desenvolver a anaplasmose. As características de tipo de exploração da propriedade, sistema de criação, manejo e forma de comercialização dos animais foram avaliadas. A análise estatística não demonstrou haver diferença significativa entre as variáveis estudadas e a positividade dos animais.

Detecção de anticorpos para Anaplasma sp. em pequenos ruminantes no semi-árido do estado de Pernambuco, Brasil

This paper reports the detection of antibodies against Anaplasma sp. in goats and sheep from the semi-arid region from Pernambuco State, Brazil, using an enzyme-linked immunosorbent assay with recombinant MSP5 of Anaplasma marginale. Sera from 243 goats and 68 sheep from Ibimirim municipality were analyzed and frequencies of antibodies of 11.93% (29/243) and 16.17% (11/68) were found for goats and sheep, respectively. The epidemiological relevance of the findings was discussed.

Neste trabalho é descrita a detecção de anticorpos para Anaplasma sp. em caprinos e ovinos da região do semi-árido do Estado de Pernambuco, Brasil, utilizando-se um ensaio de imunoadsorção enzimática baseado em MSP5 recombinante de Anaplasma marginale. Foram analisados soros de 243 caprinos e 68 ovinos provenientes do município de Ibimirim, e observadas freqüências de anticorpos de 11,93% (29/243) e 16,17% (11/68) para caprinos e ovinos, respectivamente. A importância epidemiológica dos achados foi discutida.

Ensaio de imunoadsorção enzimática com MSP5 recombinante truncada para a detecção de anticorpos contra Anaplasma marginale em bovinos

The objectives of this work were the production and solubilization of recombinant truncated MSP5 of Anaplasma marginale and the evaluation of its performance in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to detect antibodies against the rickettsia in cattle. The fragment of msp5 gene, except the hydrophobic Nterminal region, was amplified by PCR, cloned in pTrcHis-TOPO plasmid and expressed in Escherichia coli. Solubilization of the recombinant protein was evaluated in different pHs and concentrations of urea. The sensibility and specificity of the assay were evaluated with 66 sera from cattle experimentally-infected and 96 sera from cattle free of A. marginale defined by polymerase chain reaction for msp5 gene. Serum ??samples from 1,666 cattle from Brazil - states of Rio Grande do Sul (73), Mato Grosso do Sul (91), Pernambuco (86), Bahia (314) and Minas Gerais (267), Uruguay (32) and Costa Rica (803) were tested by ELISAs with recombinant truncated MSP5 and with recombinant MSP1a, and the agreement between both ELISAs was calculated. ELISA with recombinant truncated MSP5 protein detected infected animals with sensibility of 96.97% and specificity of 100%. In cattle experimentally-infected, the ELISA detected antibodies from the 12th day post-infection (DPI) to the end of the experiment, at the 37th DPI. The agreement between the ELISAs with truncated MSP5 and MSP1a antigens was 95.67%, with a kappa index of 0.81. Disagreement results showed significative difference (p < 0.001). Antibodies for A. marginale were detected in animals of the all the region analyzed. The ELISA with recombinant truncated MSP5 showed a good performance in ELISA for detention of antibodies against A. marginale with high sensitivity and specificity, representing an important tool for the diagnosis of anaplasmose bovine in epidemiological studies. INDEX TERMS: Anaplasma marginale, ELISA, MSP5, solubilization, recombinant protein. RESUMO.- ?ELISA com MSP5 recombinante truncada para detecção de anticorpos contra Anaplasma marginale em bovinos?. Os objetivos deste estudo foram produzir e solubilizar a proteína MSP5 recombinante truncada de Anaplasma marginale, e avaliar seu desempenho em um ensaio de imunoadsorção enzimática indireto (ELISA) para detecção de anticorpos contra a riquétsia. O gene msp5, exceto a região N-terminal hidrofóbica, foi amplificada por PCR, clonada em plasmídeo pTrcHis-TOPO e expressa em Escherichia coli. A solubilização da proteína recombinante foi avaliada em diferentes pHs e concentrações de uréia. A sensibilidade e 31 a especificidade do ensaio foram avaliados testando-se 66 soros de animais infectados experimentalmente com A. marginale e 96 soros negativos, com o estado de infecção destes animais confirmado por PCR. Um total de 1.666 amostras de soros bovino, provenientes do Brasil - Rio Grande do Sul (73), Mato Grosso do Sul (91), Pernambuco (86), Bahia (314) e Minas Gerais (267)-, Uruguai (32) e Costa Rica (803) foram testadas nos ELISAs com MSP5 truncada e com MSP1a recombinantes e a concordância entre os dois testes foi avaliada. O ELISA indireto com MSP5 truncada foi capaz de detectar animais infectados com 96,97% de sensibilidade e 100% de especificidade. Nos animais infectados experimentalmente, o ELISA detectou anticorpos do 12° até o último dia de observação. Os ELISAs para MSP5 e MSP1a apresentaram concordância de 95,67%, com índice kappa de 0,81. Os resultados discordantes apresentaram uma diferença significativa (p <

Padronização e avaliação de um teste de elisa competitivo utilizando a proteína recombinante msp5-pr1 para o diagnóstico sorológico da anaplasmose bovina

Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) é o agente etiológico da anaplasmose bovina que se encontra distribuída mundialmente afetando regiões tropicais e subtropicais. É transmitido por vetores, sendo a doença caracterizada clinicamente por febre, anemia hemolítica, perda de peso, aborto e morte. A. marginale possui seis Proteínas Majoritárias de Superfície (MSPs) caracterizadas e designadas MSP1a (105 kDa), MSP1b (100 kDa), MSP2 (36 kDa), MSP3 (86 kDa), MSP4 (31 kDa), MSP5 (19 kDa). Estas proteínas estão envolvidas em importantes eventos entre as células do hospedeiro e o parasita, como respostas humoral e celular, transporte de nutrientes, adesão e invasão de eritrócitos e variação antigênica. A MSP5 é uma proteína altamente conservada entre o isolados estudados de diferentes regiões geográficas, inclusive centrale de Anaplasma centrale e A. ovis. O presente trabalho teve como objetivo padronizar e avaliar um teste imunoenzimático um teste imunoenzimático competitivo (cELISA-PR1), utilizando a rMSP5 do isolado PR1 de A. marginale desenvolvido para o diagnóstico sorológico de anaplasmose. O gene msp5 foi clonado no plasmídio pRSETB e expresso em Escherichia coli BL21 Star (DE3) One Shot (Invitrogen®). O seqüenciamento do gene msp5 mostrou 98% identidade com os isolados Florida e Saint Maries, 97% com isolados Brasil-Pernambuco e Havana; e 91% com A. centrale. A proteína recombinante rMSP5 a partir do isolado PR1 (rMSP5-PR1) foi reconhecida pelo anticorpo de monoclonal ANAF16C1 em Western blotting. O cELISA-PR1 e a IFI foram comparados com cELISA pela análise de 283 soros bovinos, sendo 135 amostras negativas oriundas da região de Santa Vitória do Palmar - RS, e 147 amostras de soros positivas de bovinos naturalmente infectados com A. marginale que obtiveram densidade óptica inferior a 0,490 em 490nm (DO490) através do cELISA foram selecionadas de 245 amostras da região Sul do Brasil. Os testes apresentaram especificidade de 100% e 99,3%, sensibilidade de 100% e 98%, com um coeficiente kappa de 0,993 e 0,978, respectivamente. Na comparação de cELISA-PR1 e IFI com cELISA, a análise de 245 amostras de soros de bovinos naturalmente infectados com A. marginale na região de Sul do Brasil apresentou uma prevalência de 77,55%, 81,63% e 76,73% respectivamente, com especificidade de 96,7% e 98,9%, sensibilidade de 98,9%, 96,3% e um coeficiente kappa de 0,956 e 0,699, respectivamente. Conclui-se, através dos resultados obtidos, que cELISA-PR1 pode ter uso semelhante ao cELISA em testes diagnósticos contra A. marginale durante a infecção aguda, avaliação sorológica, e identificação de bovinos portadores sãos. A soroprevalência de A. marginale foi determinada em 223 amostras de soros de bovinos com dois anos de idade ou mais, da Região de Centro-Sul no Estado de Paraná: região de Ponta Grossa, Guarapuava e Laranjeiras; através da pesquisa de anticorpos da classe IgG contra A. marginale por ensaio imunoenzimático de competição cELISA-PR1. De todos os soros bovinos analisados, 130 (58,74%) reagiram ao cELISA-PR1, uma porcentagem significativa de animais, sendo esta região de instabilidade de enzoótica, susceptível à infecção por A. marginale e ao desenvolvimento de anaplasmose. O tipo de exploração da propriedade, sistema de criação e manejo, a presença de outros animais (ovino, caprino, eqüinos, animais silvestres), forma de comercialização de animais não apresentou diferença significativa entre as variáveis analisadas aprese