Bioengenharia: transplante de células-tronco espermatogoniais em mamíferos / Bioengineering: spermatogonial stem cells transplantation in mammals

O transplante de espermatogônias tronco (SSCs, do inglês Spermatogonial Stem Cell) é uma biotecnologia que consiste na transferência de células tronco testiculares de um doador fértil para um receptor cuja espermatogênese endógena foi suprimida. Essa técnica pode ser aplicada para a produção de machos que gerem uma progênie com características genotípicas do doador selecionado. Especialmente na bovinocultura, tanto de leite como de corte, o transplante de SSCs tem o potencial de substituir a inseminação artificial (IA). Pode-se também, colocar SSCs de um mesmo doador (de genética superior) em mais de um receptor o que aumentaria o número de filhos desse doador. Além disso, possui outras aplicações como a restauração da fertilidade em homens após o tratamento de câncer, conservação de espécies ameaçadas de extinção e tratamento de causas específicas de infertilidade. Assim, com esta revisão tem-se como propósito discorrer acerca de uma biotecnologia da reprodução que permitirá a propagação do valor genético de doadores de sêmen considerados de alto valor zootécnico.

Spermatogonial Stem Cell (SSCs) transplantation is a biotechnology that consists in the transfer of testicular stem cells from a fertile donor to a recipient whose endogenous spermatogenesis has been depleted. This technique can be applied to the production of males that generate a progeny with genotypic characteristics of the selected donor. Especially in beef and dairy cattle, SSCs transplantation has the potential to replace artificial insemination (AI). In addition, it has other applications such as restoring fertility in human species after cancer treatment, conserving endangered species and treating specific causes of infertility. Thus, this aim of this review is to discuss the perspectives of reproductive biotechnology that allows the propagation of the genetic material of high pedigree males.

Bioengenharia: transplante de células-tronco espermatogoniais em mamíferos / Bioengineering: spermatogonial stem cells transplantation in mammals

O transplante de espermatogônias tronco (SSCs, do inglês Spermatogonial Stem Cell) é uma biotecnologia que consiste na transferência de células tronco testiculares de um doador fértil para um receptor cuja espermatogênese endógena foi suprimida. Essa técnica pode ser aplicada para a produção de machos que gerem uma progênie com características genotípicas do doador selecionado. Especialmente na bovinocultura, tanto de leite como de corte, o transplante de SSCs tem o potencial de substituir a inseminação artificial (IA). Pode-se também, colocar SSCs de um mesmo doador (de genética superior) em mais de um receptor o que aumentaria o número de filhos desse doador. Além disso, possui outras aplicações como a restauração da fertilidade em homens após o tratamento de câncer, conservação de espécies ameaçadas de extinção e tratamento de causas específicas de infertilidade. Assim, com esta revisão tem-se como propósito discorrer acerca de uma biotecnologia da reprodução que permitirá a propagação do valor genético de doadores de sêmen considerados de alto valor zootécnico.(AU)

Spermatogonial Stem Cell (SSCs) transplantation is a biotechnology that consists in the transfer of testicular stem cells from a fertile donor to a recipient whose endogenous spermatogenesis has been depleted. This technique can be applied to the production of males that generate a progeny with genotypic characteristics of the selected donor. Especially in beef and dairy cattle, SSCs transplantation has the potential to replace artificial insemination (AI). In addition, it has other applications such as restoring fertility in human species after cancer treatment, conserving endangered species and treating specific causes of infertility. Thus, this aim of this review is to discuss the perspectives of reproductive biotechnology that allows the propagation of the genetic material of high pedigree males.(AU)

RIQUEZA, ABUNDÂNCIA, E DIVERSIDADE DA HERPETOFAUNA E BIOLOGIA REPRODUTIVA DE ANFÍBIOS ANUROS EM TRÊS BREJOS DE ALTITUDE DO NORDESTE DO BRASIL

No nordeste brasileiro, pouco conhecimento tem sido produzido sobre a diversidade da herpetofauna, particularmente em áreas de altitude elevada onde as temperaturas podem ser mais amenas. Ademais, acessar a biologia reprodutiva de representantes de anura nesses ecossistemas e testar se fatores históricos teriam influência sobre a dinâmica reprodutiva dessas populações pode ser estratégico para confrontar diversas hipóteses sobre ecologia de populações em ambientes neotropicais mais frios. Os brejos de altitude, áreas de estudo da presente tese, estão localizados em Caruaru-PE, (Brejo dos Cavalos), Bezerros-PE (Brejo de Serra Negra), e Taquaritinga do Norte-PE (Brejo de Taquaritinga). Expedições a campo foram conduzidas sistematicamente durante dois anos (2017-2019) para identificar a diversidade da herpetofauna nesses três brejos de altitude. Ademais, exploramos a biologia reprodutiva de algumas populações de anuros que ocorrem nas áreas de estudo. Esta tese é, portanto, composta de quatro capítulos. Capítulo 1: Diversidade taxonômica da herpetofauna em três brejos de altitude no nordeste brasileiro. Avaliei, por meio de intensivas expedições a campo, a diversidade da herpetofauna em três brejos de altitude no nordeste brasileiro. Os resultados deste capítulo evidenciaram uma riqueza elevada em todos os brejos de altitude amostrados. O Brejo dos Cavalos apresentou a maior riqueza, com 88 espécies (54 de répteis, 34 de anfíbios) de um total de 90 encontradas nos três brejos. Comparando essa diversidade com outros três brejos de altitude investigados em Pernambuco, identificamos elevada similaridade de espécies entre os seis brejos pernambucanos. No entanto, a composição faunística não é a mesma, havendo maior predominância de espécies de Caatinga nos brejos localizados mais a oeste do que dos brejos localizados a leste. É notória a importância de florestas relictuais para a manutenção de espécies típicas da Mata Atlântica nos brejos de altitude estudados, algumas delas, ameaçadas de extinção. Capítulo 2: Weight snout-vent length relationships in anurans from brejos de altitude ecoregions located in northeastern Brazil, onde foi estudada a relação entre peso e comprimento rostro-cloacal em seis espécies de anuros em três brejos de altitude do nordeste brasileiro durante 18 meses. Identificamos correlação positiva entre massa e tamanho na mesma proporção em todas as espécies estudadas e constatamos que as seis espécies possuem o mesmo ganho. Capítulo 3: Boana albomarginata (spix, 1824) (anura, hylidae) spermatogenesis in an altitude swamp in Pernambuco, Brazil. Boana albomarginata (Spix, 1824) apresentou maior produtividade de espermatozóides imediatamente antes do período chuvoso, tendo características de modo reprodutivo do tipo contínuo. Capítulo 4: Biologia reprodutiva de Boana crepitans (wied-neuwied, 1824) e Rhinella crucifer (Wiedi-Neuwied, 1821), em brejos de altitude no nordeste do Brasil. Analisamos a espermatogênese das espécies de anuros Boana crepitans (Wied-Neuwied, 1824) e Rhinella crucifer (Wied-Neuwied, 1821), nos três brejos de altitude investigados e identificamos que a maior produção de espermatozoides ocorre antes do período chuvoso, com algumas distinções interespecíficas. Boana crepitans apresentou modo reprodutivo do tipo contínuo enquanto Rhinella crucifer é do tipo explosivo.

Scarce scientific knowledge has been produced concerning the richness, abundance and diversity of amphibians and reptiles in the Northeast Brazil, particularly in high altitude areas, called Brejos de Altitude where temperatures can be colder. Furthermore, accessing the reproductive biology of anuran representatives in these ecosystems and testing whether historical factors influence the reproductive dynamics of these populations can be strategic in confronting various hypotheses regarding population ecology in colder Neotropical environments. Brejos de altitude (altitude swamps), the study areas of this thesis, were located in Caruaru-PE, (Brejo dos Cavalos), in Bezerros-PE (Brejo de Serra Negra), and in Taquaritinga do Norte - PE (Brejo de Taquaritinga). Field expeditions were systematically conducted during two years (2017-2019) aiming at identifying the richness, abundance and diversity of herpetofauna in these three areas. In addition, I also explored the reproductive biology of some anuran populations that occur in the study areas. This present thesis is, therefore, composed of four chapters. Chapter 1: Taxonomic herpetofauna diversity at three brejos de altitude in northeastern Brazil. Intensive field expeditions assessed herpetofauna diversity at three brejos de altitude in northeastern Brazil. The results indicate high richness in all sampled brejos de altitude. Brejo dos Cavalos presented the highest richness, comprising 88 species (54 reptiles and 34 amphibians) out of 90 found in these three brejos de altitude. Concerning total numbers of species, the studied localities were similar to other six brejos de altitude in Pernambuco. However, the species composition is not the same, with a greater predominance of Caatinga species in the brejos de altitude located further west than those located more to the east. The importance of relictual forests regarding the maintenance of species typically from the Atlantic Rainforest in the studied brejos de altitude is noteworthy, some of which are threateneds with extinction. Chapter 2: Weight and snout-vent length relationships in anurans from brejos de altitude ecoregions located in northeastern Brazil. The relationship between weight and snout-vent length in six anuran species from three brejos de altitude in northeastern Brazil were investigated for 18 months. I found positive correlation between mass and body size varying in the same proportion in all studied species. Chapter 3: Boana albomarginata (Spix, 1824) (Anura, Hylidae) spermatogenesis in a brejo de altitude in Pernambuco, Brazil. The spermatogenesis of Boana albomarginata (Spix, 1824) at Brejo dos Cavalos presented higher spermatozoa productivity immediately before the rainy season, displaying continuous type reproductive characteristics. Chapter 4: Reproductive biology of Boana crepitans (Wied-Neuwied, 1824) and Rhinella crucifer (Wied-Neuwied, 1821), in highland swamps in northeastern Brazil. The spermatogeneses of the anurans Boana crepitans (Wied-Neuwied, 1824) and Rhinella crucifer (Wied-Neuwied, 1821) were investigated in the three areas and both species presented greater sperm production before the rainy season, with some interspecific distinctions. Boana crepitans presented continuous reproduction period, while Rhinella crucifer presented explosive reproduction.

Avaliação do processo espermatogênico de touros GIR

Objetivou-se com esta pesquisa avaliar a morfologia funcional da espermatogênese de touros da raça Gir, dando ênfase na biometria do testículo e na histomorfometria do parênquima testicular. Utilizaram-se fragmentos testiculares de oito touros da raça Gir. Os fragmentos foram fixados por perfusão tecidual com solução de Karnovisck. Em seguida, a inclusão foi realizada com glicol metacrilato. Foram realizados cortes histológicos de 4 µm de espessura que foram corados com solução de azul de toluidina - borato de sódio a 1%. A idade média dos touros foi de 8,0 ± 1,3 anos e o peso corporal médio foi 467,5 ± 26,7 kg. O peso testicular foi 289,2 ± 30,5 g em média. O índice gonadossomático foi de 0,12 ± 0,02%. Os túbulos seminíferos, as células de Leydig, o estroma e o tecido intertubular ocuparam, respectivamente, 80,9 ± 1,7%, 5,4 ± 1,3%, 13,7 ± 1,1%, 19,1 ± 1,7%. O comprimento médio de túbulo seminífero por grama de testículo foi de 17 ± 0,8 m. As perdas durante a mitose espermatogonial foram em média de 75,5 ± 3,22%, enquanto na fase meiótica ficou em 30,6 ± 8,17%, o que proporcionou uma perda total de 81,49 ± 2,58% de células durante toda a espermatogênese. A média da produção espermática diária por grama de parênquima foi de 28,0 x 106 células. Conclui-se que a histometria dos parâmetros testiculares da raça Gir encontram-se inseridos na média relatada para bovinos de raças zebuínas.

The objective of this research was to evaluate the functional morphology of spermatogenesis of Gir bulls, with emphasis on testicular biometry and testicular parenchyma histomorphometry. Testicular fragments of eight Gir sires were used. The fragments were fixed by tissue perfusion with Karnovisck's solution. Then the inclusion was performed with glycol methacrylate. Histological sections of 4 µm thickness were stained with 1% sodium toluidine - borate blue solution. The mean age of the bulls was 8.0 ± 1.3 years and the mean body weight was 467.5 ± 26.7 kg. The testicular weight was 289.2 ± 30.5 g on average. The gonadosomatic index was 0.12 ± 0.02%. The seminiferous tubules, Leydig cells, stroma and intertubular tissue occupied, respectively, 80.9 ± 1.7%, 5.4 ± 1.3%, 13.7 ± 1.1%, 19.1 ± 1.7%. The mean length of seminiferous tubule per gram of 5 testis was 17 ± 0.8 m. The losses during spermatogonial mitosis were on average 75.5 ± 3.22%, whereas in the meiotic phase it was 30.6 ± 8.17%, which gave a total loss of 81.49 ± 2.58% of Cells throughout spermatogenesis. The mean daily sperm production per gram of parenchyma was 28.0 x 109 cells. It is concluded that the histometry of the testicular parameters of the Gir breed are inserted in the mean reported for cattle of zebu breeds.

Espermatogênese xenogênica pós-transplante de células tronco caninas no testículo de camundongos

As células tronco espermatogoniais (SSCs) são caracterizadas pela capacidade de autorrenovação, proliferação e transmissão das informações genéticas. Em caninos a primeira tentativa de xenotransplante não obteve o sucesso da produção de espermatozoides, no entanto, há evidências de que as células testiculares xenogênicas podem ser transplantadas no testículo do animal hospedeiro, e gerar espermatozoides viáveis do doador. Portanto, este estudo tem como objetivo realizar o xenotransplante das células germinativas caninas em camundongos imunosuprimidos, e com isto promover à produção de espermatozoides caninos viáveis, geneticamente modificados. E por meio desta técnica, analisar a eficiência da espermatogênese pós-transplante. Células germinativas testiculares foram caracterizadas, isoladas e cultivadas de cães pré-púberes, por meio de sistemas de cultura de enriquecimento e fatores de crescimento. As células foram transduzidas com um gene repórter GFP e LacZ, e por um vetor lentiviral para indentificar as SSCs nos testículos receptores. As SSCs transduzidas foram transplantadas nos testículos de camundongos (C57BL/6) tratados com Busulfan, após diferentes períodos os animais receptores foram eutanasiados e analisados. Aos 10 dias de cultivo as células germinativas adultas foram positivas para CD49f, CD117, e com 5 dias uma expressão semelhante de GFRA1 e DAZL, demonstrando a presença de SSCs e algumas células em meiose. Transplantamos 105 células e 20-43% das células transplantadas foram identificadas na membrana basal dos túbulos seminíferos do animal receptor. Portanto, o transplante das células germinativas caninas, mostrou que a purificação e o cultivo realizados são possíveis para obter SSCs caninas, as quais colonizaram os túbulos seminíferos dos camundongos imunodeficientes e mantiveram-se vivas na membrana basal por 90 dias após transplante, mesmo que estes animais tenham distância filogenética.

The spermatogonial stem cells (SSCs) are characterized by the capacity for self-renewal, proliferation and transmission of genetic information. In canines the first attempt to xenotransplantation did not achieve the success of sperm production. However, there is evidence that testicular xenogeneic cells can be transplanted into the testis of the host animal, and generate viable sperm donor. Therefore, this study aims conduct xenotransplantation of the canine germ cells in immunosuppressed mice, and thereby promote the production of viable sperm canines, genetically modified. And by this technique, analyze the efficiency of post-transplant spermatogenesis. Testicular germ cells were identified, isolated and cultured prepuberes dogs through enrichment culture systems and growth factors. Cells were modificated with a reporter gene GFP and LacZ. The SSCs canine was transplanted in mice (C57Bl/6), after different period and then the recipient animals were euthanized and analyzed. After 10 days in culture the germ cells were positive for CD49f, CD117, and 5 days a similar expression of GFRA1 and DAZL was observed, demonstrating the presence of SSCs and some cells in meiosis. 105 cells were transplanted and 20-43% of the transplanted cells were identified in the basement membrane of the seminiferous tubules after 90 days after transplantation. Therefore, the transplantation of canine germ cells showed that the cultivation and purification are performed possible for canine SSCs, it can colonize the seminiferous tubules the mice infertility remained alive in the basement membrane for 90 days after transplanting, even though these animals have phylogenetic distance.

CICLO TESTICULAR E ESPERMATOGÊNESE DE Devario aequipinnatus (CYPRINIFORMES, CYPRINIDAE) SUBMETIDO A DIFERENTES TEMPERATURAS.

A influência antrópica vem crescendo continuamente no ambiente, legitimando a importância de se investigar as causas de estresse aos animais nos sistemas naturais no qual se encontram. Como resultados a essas ações houve um aquecimento linear de 0,85 ºC nas últimas décadas e, estudos demonstram que essa temperatura pode aumentar em 4,8 ºC até 2100. A compreensão da atuação da temperatura sobre os animais aquáticos contribui significativamente para as previsões dos efeitos na população e níveis de comunidades, já que poucos fatores ambientais têm maior influência sobre a atividade animal do que a temperatura, devido a exposição física externa. O objetivo deste trabalho foi investigar a influência de diferentes temperaturas sobre o ciclo testicular e a espermatogênese de D. aequipinnatus. Para o presente estudo foram utilizados exemplares machos de D. aequipinnatus. Foram testadas três temperaturas 18º, 24º e 30º e utilizados 20 exemplares para cada temperatura. As coletas foram realizadas em um intervalo de 4 dias, totalizando 10 coletas, onde cinco indivíduos de cada tratamento foram coletados. Após aferidos dados biométricos os testículos foram submetidos a procedimentos usuais de histologia. As lâminas obtidas foram analisadas sob microscopia de luz. Para a análise estereológica, utilizou-se um grid de intersecção de 475 pontos (Motic Image Plus 2.0), sobreposto a uma área da secção histológica; foram contados os seguintes componentes: espermatogônias, espermatócitos, espermátides, espermatozoides, células de Sertoli, células com núcleo picnótico, interstício e lúmen. Para análise estatística, aplicou-se o teste de homogeneidade de Bartlett e o teste de normalidade de Shapiro Wilk. Quando atenderam as premissas, aplicou-se ANOVA e teste de Tukey (P<0.05), quando não, foi aplicado o teste de Kruskal Wallis. As fases de maturação gonadal encontradas foram maturação intermediária, maturação final - dividida em maturação final 1, maturação final 2, maturação final 3 e maturação final 4 e regressão (somente em 18º), que apresenta características de reabsorção e proliferação celular ocorrendo na mesma fase. Os maiores valores de IGS ocorreram em indivíduos em maturação final 1. A temperatura de 30º acelerou a espermatogênese, e 18 ºC proporcionou período reprodutivo mais longo; porém na temperatura de 30 ºC houveram danos a morfologia testicular, causando uma desorganização gonadal e a supressão da espermatogênese nas regiões lesadas. Em 18 ºC houve a formação de vacúolos no citoplasma e núcleo das de espermatogônias e espermatócitos. Além disso, o número de células picnóticas foi maior em 18 ºC e 30 ºC, em relação ao controle. Indivíduos mantidos a 30º apresentaram maior número de espermatogônias.

The human influence has been growing continuosly in the environment, legitimizing the importance of investigating the causes of stress to animals in natural systems in which they are. As a result of these actions there was a linear heating of 0.85 ° C in recent decades, and studies show that this temperature could increase in 4.8 ° C until 2100. Understanding the temperature acting on aquatic animals contributes significantly to the predictions of the effects on population and levels of communities, as few environmental factors have the greatest influence on animal activity than the temperature due to external physical exposure. The aim of this study was to investigate the influence of different temperatures on testicular cycle and spermatogenesis of D. aequipinnatus. For this study were used copies males D. aequipinnatus. Three temperatures were tested 18 ºC, 24 ºC and 30 ºC, and used 20 specimens for each temperature. Samples were collected in a four-day intervals, totaling 10 collections, in which five individuals from each treatment were collected. After measured biometric data testes underwent usual histology procedures. The obtained slides were examined under light microscopy. For stereological analysis, we used a 475 grid intersection points (Motic Image Plus 2.0) overlapping an area of the histological section; were counted the following components: spermatogonia, spermatocytes, spermatids, spermatozoa, Sertoli cells, cells with pyknotic nucleus, interstitium and lumen. Statistical analysis was applied Bartlett's homogeneity test and the Shapiro-Wilk normality test. When met the assumptions applied ANOVA and Tukey test (P <0.05), if not, we applied the Kruskal Wallis test. It was found of intermediate maturation, final maturation - divided into: final maturation 1, final maturing 2, final maturation 3 and final maturation 4 - and regression (only 18ºC) having cell resorption and proliferation characteristics occurring in the same phase. The highest GSI values occurred in individuals in final maturation 1. Temperature of 30 ºC accelerated spermatogenesis, and 18 ° C provided a longer reproductive period; but at the temperature of 30 ° C there were damage to testicular morphology, causing gonadal disruption and suppression of spermatogenesis in the damaged regions. At 18 ° C was the vacuole formation in the cytoplasm and nucleus of spermatogonia and spermatocytes. Furthermore, the number of cells was higher in picnotic 18 ° C and 30 ° C, compared to the control. Animals kept at 30 ºC showed greater number of spermatogonia.

MORFOMETRIA E DESENVOLVIMENTO DAS GÔNADAS DE TILÁPIAS (OREOCHROMIS NILOTICUS) SUPLEMENTADAS COM SAL MINERAL COMPOSTO POR COBRE, MANGANÊS E ZINCO

O objetivo deste trabalho foi o de avaliar o efeito da suplementação da dieta de Tilápias (Oreochromis niloticus) utilizando sal comercial composto dos microminerais cobre, manganês e zinco, sobre a histologia e o desenvolvimento das gônadas dos machos. Foram utilizados 1200 machos masculinizados de tilápia, com média de peso de 120g, suplementadas com níveis crescentes (0,00; 0,35; 0,70; 1,05; 1,40 e 1,75 mg/kg) de um produto comercial composto por Cu 13,40 g/kg; Mn 26,70 g/kg e Zn 66,70 g/kg. O experimento foi conduzido em um sistema de recirculação de água, composto por 24 tanques divididos ao meio totalizando 48 unidades experimentais. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com medidas repetidas no tempo. As biometrias e coletas foram realizadas em 16 e 32 semanas de experimento, para avaliar o desenvolvimento dos peixes. As gônadas coletadas foram preparadas e cortadas para confecção de lamina histológica, após coradas com hematoxilina e eosina, e posteriormente fotografadas, utilizando microscópio com câmera acoplada. A contagem das fotos foi realizada manualmente, e avaliou-se o número de células por mm3, para espermatogônias, espermatócitos, espermátides e espermatozoides. As correlações entre número de espermatozoides, espermatócitos, espermátides e tratamentos foi de -0,30, -0,20 e -0,30, respectivamente, demonstrando que o efeito da suplementação crescente com o sal, é prejudicial para o desenvolvimento das células reprodutivas masculinas. Foi observado que os tratamentos com adição igual ou superior a 0,70 mg/kg do sal comercial causaram danos as gônadas para os parâmetros da gametogênese de número de espermatócitos, espermátides e espermatozoides. Sendo assim, a utilização de sais que contenham combinação de Cu 13,40 g/kg; Mn 26,70 g/kg e Zn 66,70 g/kg reprodutores machos de tilápia, não é recomendada em função dos danos causados nas etapas da gametogênese, reduzindo a produção de espermatozoides.

The objective of this study was to evaluate the effect of supplementing the diet of tilapia (Oreochromis niloticus) using commercial salt compound of micro minerals copper, manganese and zinc, on the histology and gonadal development of males. A total of 1200 masculinized male tilapia were used, with 120 g average weight, supplemented with increasing levels (0.00, 0.35, 0.70, 1.05, 1.40 and 1.75 mg / kg) of a product commercial composed of Cu 13,40 g/kg; Mn 26,70 g/kg e Zn 66,70 g/kg. The trial was conducted in a water recirculation system, consisting of 24 tanks divided in half, totaling 48 experimental units. The experimental design was completely randomized with repeated measures over time. The biometry and samples were taken at 16 and 32 weeks of experiment, to evaluate the fish development. The collected gonads were prepared and sliced for making histological slide, after stained with hematoxylin and eosin, and then photographed using a microscope with attached camera. The count of the photos was performed manually, and was rated the number of cells per mm3 to spermatogonia, spermatocytes, spermatids and sperm cell. The correlations between the number of spermatozoa, spermatocytes, spermatids and treatments was of -0.30, -0.20 and -0.30, respectively, demonstrating that the effect of increasing supplementation of the salt is detrimental to the development of male reproductive cells. It was observed that the addition equal or superior to 0.70 mg / kg of commercial salt caused damage in the gonads for gametogenesis parameters number of spermatocytes, spermatids and sperma cell. Thus, the use of combination of salts containing 13.40 g Cu / kg; Mn 26.70 g / kg Zn and 66.70 g / kg breeding male tilapia is not recommended due to the damage caused in the stages of gametogenesis, reducing the sperm production.

Cinética das espermatogônias em camundongos Knockout Tex14 com ausência de pontes intercelulares.

As pontes intercelulares são canais citoplasmáticos que interconectam clones de células germinativas em um sincício. Tem sido proposto que as pontes intercelulares exercem um papel fundamental na comunicação e no sincronismo das células germinativas, me-diando o trânsito de sinais apoptóticos e mitóticos entre os clones de espermatogônias e coordenando a entrada em meiose. Camundongos knockout Tex14 são geneticamente incapazes de produzir a proteína TEX14. Essa proteína é essencial para a manutenção das pontes intercelulares e sua ausência resulta em esterilidade. Estudos prévios em ca-mundongos knockout Tex14 não investigaram, por abordagens morfológicas, detalhes dos papéis propostos atribuídos às pontes intercelulares. Assim, o presente estudo avali-ou a participação das pontes intercelulares no sincronismo do epitélio seminífero usando microscopia de luz de alta resolução, imunoistoquímica (bromodeoxiuridina BrdU para detecção de células proliferativas em tecidos vivos) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM). A morfologia espermatogonial não foi afetada pela ausência de pontes intercelulares, mas a cinética espermatogonial foi comprometida na proliferação das espermatogônias Aindiferenciadas, que originam o estoque comprometido a se diferenci-ar em A1, e das espermatogônias B, que originam o grupo de espermatócitos comprome-tidos com a meiose. Algumas espermatogônias B e espermatócitos em preleptóteno fo-ram vistos afastados da lamina basal e outros no compartimento intermediário. Na tran-sição das fases proliferativa e meiótica, houve um primeiro momento de apoptose que reduziu o número de espermatócitos primários em preleptóteno. Depois, os espermató-citos primários em paquíteno foram completamente eliminados a partir do estádio es-permatogonial 5. Os resultados confirmam a importância das pontes intercelulares na sincronização das células germinativas e coordenação de eventos críticos como diferen-ciação em A1 e meiose.

Intercellular bridges are cytoplasmic channels that interconnect clones of germ cells in a syncytium. It has been predicted that the intercellular bridges have a fundamental role in the communication and synchronization of the germ cells, mediating the transit of apop-totic and mitotic signals between spermatogonial clones and for coordinating the entry into meiosis. Tex14 knockout mice are genetically unable to produce the protein TEX14. This protein is essential for the maintenance of the intercellular bridges and its absence results in sterility. Previous studies on Tex14 knockout mice did not investigate details of the proposed roles attributed to the intercellular bridges by morphological approaches. Hence, the present study evaluated the intercellular bridges participation in the seminiferous epithelial synchronism using high-resolution light microscopy (HRLM), immunohistochemistry (bromodeoxyuridine BrdU for detection of pro-liferating cells in living tissues) and transmission electron microscopy (TEM). The spermatogonial morphology was not affected by the lack of intercellular bridges, but spermatogonial kinetics was impaired in the proliferation of the Aundifferentiated spermato-gonia, which generate the pool committed to differentiate to A1, and B spermatogonia, that generate the pool of spermatocytes committed to meiosis. Some B spermatogonia and the preleptotene spermatocytes were seen far from the basal lamina and others in the intermediated compartment. In the transition of proliferative and meiotic phases, there was a first moment of apoptosis that reduced the number of preleptotene primary spermatocytes. Afterwards, pachytene primary spermatocytes were completely depleted from spermatogonial stage 5 onwards. The results confirm the importance of intercellu-lar bridges in the synchronization of the germ cells and coordination of the critical events like differentiation into A1 and meiosis.

Sexual plasticity of rainbow trout germ cells

The sexual plasticity of fish gonads declines after the sex-differentiation period; however, the plasticity of the germ cells themselves after this stage remains poorly understood. We characterized the sexual plasticity of gonial germ cells by transplanting them into sexually undifferentiated embryonic gonads in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Spermatogonia or oogonia isolated from the meiotic gonads of vasa-green fluorescent protein (Gfp) gene transgenic trout were transplanted into the peritoneal cavity of newly hatched embryos of both sexes, and the behavior of the GFPlabeled donor cells was observed. The transplanted spermatogonia and oogonia migrated towards the recipient gonadal anlagen, and were subsequently incorporated into them. We also confirmed that the donor-derived gonial germ cells resumed gametogenesis in the recipient somatic microenvironment synchronously with the endogenous germ cells. Surprisingly, the donor-derived spermatogonia started to proliferate and differentiate into oocytes in female recipients. At 2 years post-transplantation, the eggs from mature female recipients were artificially inseminated with sperm from intact male rainbow trout. Normal, live offspring with the donor-derived haplotype were obtained. In addition, oogonia-derived sperm were produced in the male recipients. These donor-derived sperm were shown to be fully functional, as live offspring carrying GFP-labeled germ cells with the donor haplotype were obtained in the first filial (F1) generation. These findings indicate that rainbow trout pre-meiotic germ cells, which are likely to be spermatogonial or oogonial stem cells, possess a high level of sexual plasticity, and that the sexual differentiation of germ cells is controlled solely by the somatic microenvironment, rather than being cell autonomous.

Sexual plasticity of rainbow trout germ cells

The sexual plasticity of fish gonads declines after the sex-differentiation period; however, the plasticity of the germ cells themselves after this stage remains poorly understood. We characterized the sexual plasticity of gonial germ cells by transplanting them into sexually undifferentiated embryonic gonads in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Spermatogonia or oogonia isolated from the meiotic gonads of vasa-green fluorescent protein (Gfp) gene transgenic trout were transplanted into the peritoneal cavity of newly hatched embryos of both sexes, and the behavior of the GFPlabeled donor cells was observed. The transplanted spermatogonia and oogonia migrated towards the recipient gonadal anlagen, and were subsequently incorporated into them. We also confirmed that the donor-derived gonial germ cells resumed gametogenesis in the recipient somatic microenvironment synchronously with the endogenous germ cells. Surprisingly, the donor-derived spermatogonia started to proliferate and differentiate into oocytes in female recipients. At 2 years post-transplantation, the eggs from mature female recipients were artificially inseminated with sperm from intact male rainbow trout. Normal, live offspring with the donor-derived haplotype were obtained. In addition, oogonia-derived sperm were produced in the male recipients. These donor-derived sperm were shown to be fully functional, as live offspring carrying GFP-labeled germ cells with the donor haplotype were obtained in the first filial (F1) generation. These findings indicate that rainbow trout pre-meiotic germ cells, which are likely to be spermatogonial or oogonial stem cells, possess a high level of sexual plasticity, and that the sexual differentiation of germ cells is controlled solely by the somatic microenvironment, rather than being cell autonomous.(AU)