Characterization of gene polymorphisms related to immune system physiology in Mangalarga horses / Caracterização de polimorfismos gênicos relacionados à fisiologia do sistema imune em equinos da raça Mangalarga

The objectives of this study were to standardize a PCR-RFLP genotyping method for the AY_731081:g.1900T>C SNP of the equine CD14 gene, and to characterize this SNP and two other polymorphisms (AY_005808: c.1530A>G of the TLR4 gene and AX_463789: g.133T>C of the Cε gene) in Mangalarga horses, in order to contribute to future studies investigating the association between DNA markers and traits related to immune system physiology in this breed. A total of 151 Mangalarga horses of both sexes and variable ages, representative of the population of São Paulo State, were used. PCR-RFLP was found to be adequate for genotyping of the AY_731081: g.1900T>C SNP of the equine CD14 gene. However, this polymorphism is probably not present in Mangalarga horses, thus impairing association studies using this marker in the breed. The population genetic parameters obtained for the TLR4 AY_005808:c.1530A>G and Cε AX_463789:g.133T>C polymorphisms suggest the use of these markers in association studies with immune system-related traits in Mangalarga horses.(AU)

Os objetivos deste trabalho foram a padronização da metodologia PCR-RFLP para genotipagem do SNP AY_731081:g.1900T>C do gene CD14 equino, bem como a caracterização em equinos da raça brasileira Mangalarga deste e de outros dois polimorfismos, o AY_005808: c.1530A>G do TLR4 e o AX_463789: g.133T>C do Cε, a fim de promover o embasamento necessário para futuras pesquisas visando à associação entre marcadores de DNA e características relacionadas à fisiologia do sistema imune na raça. Para tanto, foram utilizados 151 animais Mangalarga, de ambos os sexos e de idades variadas, representativos da população do estado de São Paulo. O método de PCR-RFLP mostrou-se adequado para a genotipagem do SNP AY_731081: g.1900T>C do gene CD14 equino. Entretanto, tal polimorfismo provavelmente não ocorre em equinos Mangalarga, impossibilitando estudos de associação com o marcador na raça. Os parâmetros genético-populacionais obtidos para os polimorfismos AY_005808:c.1530A>G do gene TLR4 e o AX_463789:g.133T>C do gene Cε demonstraram a possibilidade de realização de pesquisas.(AU)

Association of TLR4 polymorphisms with subclinical mastitis in Brazilian holsteins

The identification of dairy cows with greater or lower potential to develop mastits has been pursued for many years among different segments of the milk industry, including governmental organizations. Genomic studies have suggested that Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) within the pattern recognition receptors (PRR) could lead to different responses to pathogens, and consequently result in mastitis resistance or susceptibility. To investigate whether toll like receptor 4 (TLR4) gene is associated with subclinical mastitis in Holstein cows from a property in the state of Goiás, Brazil, TaqMan allelic discrimination and somatic cell count were performed. One hundred and fifty milk samples were analyzed for SCC and centesimal composition. Twenty percent of those samples with SCC above 200,000 (n=13) were screened for real-time PCR identification of microorganisms and blood samples were genotyped for TLR4 SNPs. There was a higher prevalence of Gram-positive bacteria in the analyzed samples (88.9%) and animals that had the combined genotypes AACCCC, GGTCGG and GACCGC presented the lowest somatic cell scores, and consequently those genotypes have the potential to be applied as molecular markers for assisted animal selection to improve milk quality.

PARÂMETROS INFLAMATÓRIOS E IMUNOEXPRESSÃO DE TLR-2, TLR-4, COX-2 e VEGF NA PELE DE CÃES NATURALMENTE INFECTADOS POR Leishmania infantum

A pele é a primeira barreira mecânica de proteção contra patógenos do ambiente. Na leishmaniose visceral canina (LVC), a infecção ocorre pelo rompimento da barreira da pele pelo flebotomíneo infectado que inocula o protozoário Leishmania infantum. Esses agentes infecciosos desencadeiam respostas imune e inflamatória severas no animal que podem ser avaliadas sistemicamente e no local da infecção. Na LVC, uma resposta inflamatória é desencadeada no sítio infeccioso por células sentinelas que liberam mediadores inflamatórios e citocinas e induzem ao recrutamento de células inflamatórias. Neste trabalho objetivou-se caracterizar o perfil hematológico e bioquímico e avaliar as expressões de VEGF+, COX-2+, TLR-2+ e TLR-4+ na pele de cães naturalmente infectados por L. infantum. Para tanto, cães soropositivos (n=33) foram divididos nos grupos assintomático (GA, n=10) e sintomático (GS, n=23), de acordo com a presença ou ausência de alterações dermatológicas, comparados com o grupo de animais soronegativos (GC, n=5). As principais manifestações clínicas observadas em GS foram alopecia, onicogrifose, ceratoconjuntivite e dermatites eritematosas, esfoliativas e ulcerativas. Amostras de sangue foram coletadas para avaliação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos. Biópsias da pele foram coletadas da região escapular e da ponta de orelha, processados para histologia para avaliação do infiltrado inflamatório (ausente, leve, moderado e intenso) e imunoistoquímica com anticorpos monoclonais anti-VEGF+, anti-COX-2, anti-TLR-4 e anti-TLR-2 (ausente, leve, moderado e intenso). Os animais sintomáticos para LVC apresentaram albuminemia, leucocitose e outras alterações hematológicas compatíveis com descrições da literatura. A contagem diferencial leucocitária apontou para uma neutrofilia e linfopenia significativas do GS quando comparadas aos demais grupos (p < 0,05), estando esse resultado confirmado pela razão neutrófilo:linfócito, também significativamente aumentada. Na histologia foi evidenciado infiltrado inflamatório intenso em GS em relação ao GA e GC. As expressões de VEGF+, COX-2+ e TLR-2 estavam aumentadas na pele de animais GS (intenso) quando comparadas a GA (moderado) e GC (leve), enquanto que a marcação de TLR-4, não foi alterada entre os grupos avaliados. Estes dados indicam o envolvimento de VEGF+ e COX-2, pela ativação do TLR-2, o que pode sugerir uma relação da via de transcrição do NF-kB pelo TLR-2 e não pelo TLR-4 em resposta a infecção por L. infantum.

The skin is a mechanical barrier in the protection against environmental pathogens. In Canine Leishmaniasis (CanL), the infection occurs through phlebotomine vectors that inoculate Leishmania infantum through the skin. These infectious agents elicit severe immune and inflammatory responses in the animal that can be assessed both systemically and at the site of infection. In response to the infection, sentinel cells triggered an inflammatory response trough the release of mediators and cytokines that induce recruitment of inflammatory cells to the local of infection. The objective of this study was to characterize the hematological biochemical profile and to evaluate the expression of VEGF+, COX-2+, TLR-2+ and TLR-4+ in the skin of dogs naturally infected by L. infantum. Therefore, seropositive dogs (n = 33) were divided into asymptomatic (AG, n = 10) and symptomatic (SG, n = 23) groups, according to the presence or absence of dermatological alterations, compared to the seronegative group (CG, n = 5). The main clinical manifestations observed in SG were alopecia/hypotrichosis, onychogryphosis, keratoconjunctivitis and erythematous, exfoliative and ulcerative dermatitis. Blood samples were collected for evaluation of hematological and biochemical parameters. Skin biopsies were collected from the scapular region and the ear tip, processed for histology to evaluate the inflammatory infiltrate (absent, mild, moderate and intense) and for immunohistochemistry to evaluate the expressions of VEGF+, COX-2, TLR-4 and TLR-2 (absent, mild, moderate and intense). The symptomatic animals for LVC presented albuminemia, leukocytosis and other hematological alterations compatible with descriptions in literature. The differential blood count shows a significant neutrophilia and lymphopenia in CG when compared to the other groups (p <0.05), and this result was confirmed by the neutrophil: lymphocyte ratio, also significantly increased. In the histological evaluation, both SG and AG presented inflammatory infiltrate. The expressions of VEGF +, COX-2 + and TLR-2 were increased at skin from dogs SG (intense) when compared to AG (moderate) and CG (mild), whereas TLR-4 was not detected between groups evaluated. These data indicate the involvement of TLR-2 in CanL and suggest the NF-kB transcription factor pathway to the VEGF + and COX-2 expressions in cutaneous immune system in response to L. infantum. TLR-4 not participate of this event in dogs naturally infected by L. infantum.