Abortion in association with transplacental Theileria equi infection in a mare from the State of Espírito Santo, southeast Brazil: case report / Aborto equino associado à infecção transplacentária de Theileria equi, Espírito Santo, Brasil: relato de caso

Equine piroplasmosis is a tick-borne disease caused by the protozoan parasites Babesia caballi and Theileria equi. We report a case of abortion in association with transplacental Theileria equi infection in a mare from the State of Espírito Santo, southeast Brazil. An apparently healthy mare aborted at the tenth month of gestation. At necropsy, the subcutaneous tissue, skeletal muscles, and visible mucosae of the aborted fetus were pale, and there was moderate hydrothorax and marked splenomegaly. Microscopic findings included splenic lymphoid hyperplasia and nephrosis. Merozoite-infected erythrocytes were found within blood vessels of all organs examined and were most numerous in the brain. DNA extracted from the spleen, liver, kidney, and thymus was used as a template for PCR. Generic primers were employed for the detection of piroplasm 18S ribosomal gene. All samples were positive for piroplasm DNA by PCR. Amplicons were purified and then sequenced. Sequencing analysis of these amplicons revealed 98% identity to T. equi sequences. Based on our findings, we suggest that abortion in this case resulted from transplacental Theileria infection.(AU)

A piroplasmose equina é transmitida por carrapatos, sendo causada pelos protozoários Babesia caballi e Theileria equi. O objetivo deste trabalho foi relatar um caso de aborto equino associado à piroplasmose fetal. Uma égua gestante, aparentemente saudável, abortou no 10º mês de gestação. Na necropsia do feto, foi observada palidez de subcutâneo, da musculatura esquelética e das mucosas visíveis, moderado hidrotórax e acentuada esplenomegalia. Histologicamente, havia hiperplasia linfoide esplênica e nefrose. Muitos merozoítos foram observados em eritrócitos nos vasos sanguíneos de todos os órgãos examinados, com maior intensidade no encéfalo. Amostras de DNA do baço, fígado, rim e timo foram utilizadas para PCR com primers genéricos para detecção de sequências do gene 18S ribossomal de piroplasmas, com resultado positivo para todas as amostras. Em seguida, os amplicons das amostras de baço foram purificados, sequenciados e, após análise, mostraram 98% de identidade com a sequência de T. equi. Portanto, as alterações microscópicas, os resultados de PCR e sequenciamento confirmam aborto associado à T. equi por transmissão transplacentária.(AU)

Abortion in association with transplacental Theileria equi infection in a mare from the State of Espírito Santo, southeast Brazil: case report / Aborto equino associado à infecção transplacentária de Theileria equi, Espírito Santo, Brasil: relato de caso

Equine piroplasmosis is a tick-borne disease caused by the protozoan parasites Babesia caballi and Theileria equi. We report a case of abortion in association with transplacental Theileria equi infection in a mare from the State of Espírito Santo, southeast Brazil. An apparently healthy mare aborted at the tenth month of gestation. At necropsy, the subcutaneous tissue, skeletal muscles, and visible mucosae of the aborted fetus were pale, and there was moderate hydrothorax and marked splenomegaly. Microscopic findings included splenic lymphoid hyperplasia and nephrosis. Merozoite-infected erythrocytes were found within blood vessels of all organs examined and were most numerous in the brain. DNA extracted from the spleen, liver, kidney, and thymus was used as a template for PCR. Generic primers were employed for the detection of piroplasm 18S ribosomal gene. All samples were positive for piroplasm DNA by PCR. Amplicons were purified and then sequenced. Sequencing analysis of these amplicons revealed 98% identity to T. equi sequences. Based on our findings, we suggest that abortion in this case resulted from transplacental Theileria infection.(AU)

A piroplasmose equina é transmitida por carrapatos, sendo causada pelos protozoários Babesia caballi e Theileria equi. O objetivo deste trabalho foi relatar um caso de aborto equino associado à piroplasmose fetal. Uma égua gestante, aparentemente saudável, abortou no 10º mês de gestação. Na necropsia do feto, foi observada palidez de subcutâneo, da musculatura esquelética e das mucosas visíveis, moderado hidrotórax e acentuada esplenomegalia. Histologicamente, havia hiperplasia linfoide esplênica e nefrose. Muitos merozoítos foram observados em eritrócitos nos vasos sanguíneos de todos os órgãos examinados, com maior intensidade no encéfalo. Amostras de DNA do baço, fígado, rim e timo foram utilizadas para PCR com primers genéricos para detecção de sequências do gene 18S ribossomal de piroplasmas, com resultado positivo para todas as amostras. Em seguida, os amplicons das amostras de baço foram purificados, sequenciados e, após análise, mostraram 98% de identidade com a sequência de T. equi. Portanto, as alterações microscópicas, os resultados de PCR e sequenciamento confirmam aborto associado à T. equi por transmissão transplacentária.(AU)

Expressão heteróloga da EMA-2 (equi merozoite antigen) de Theileria equi em Pichia pastoris com potencial utilização em imunobiológicos / Heterologous expression of EMA-2 (equi merozoite antigen) of Theileria equi in Pichia pastoris with potential use in immunobiologics

A piroplasmose equina causada por Theileria equi acomete os equinos de forma endêmica no Brasil e em diversos outros países tropicais e subtropicais. Considerada uma das mais importantes doenças de equinos, causa danos à saúde animal e perdas econômicas. A proteína equi merozoite antigen (EMA-2) é uma das principais proteínas de superfície, expressa nos diversos estágios do ciclo do parasita, estimula resposta imune em animais infectados, tornando-se um possível candidato para utilização em diagnóstico. O gene EMA-2 foi clonado e expresso na levedura Pichia pastoris. A proteína EMA-2 recombinante (rEMA-2) foi caracterizada antigenicamente por Western Blot e por ELISA indireto, utilizando-se soro de equino positivo para theileriose. O resultado do ELISA demonstrou uma especificidade de 90,9% e sensibilidade de 83,3%, quando comparado ao padrão, sendo superior à imunofluorescência (80,6% de especificidade e 75,0% de sensibilidade), o que sugere que a rEMA-2 expressa em P. pastoris é um promissor antígeno para ser utilizado como ferramenta no imunodiagnóstico de theileriose equina.(AU)

Theileria equi, the causative agent of equine piroplasmosis, is endemic in Brazil and many other tropical and subtropical countries. It is considered one of the most important diseases of horses causing animal health problems and significant economic loss. The Protein equi merozoite antigen-2 (EMA-2) is a major surface protein that is expressed in different parasite cycle stages and induces immune response in infected animals, being a possible candidate to be used in diagnose. EMA-2 gene was cloned and expressed in the yeast Pichia pastoris, and the recombinant protein EMA-2 (rEMA-2) was characterized by Western Blot and indirect ELISA using equine positive sera. The ELISA results demonstrated a specificity of 90.9% and a sensitivity of 83.3% compared to the standard ELISA and being superior to immunofluorescence (80.6% of specificity and 75.0% of sensitivity) suggesting that the rEMA-2 expressed in P. pastoris is a promising antigen to be used as a tool in immunodiagnostic of theileriasis.(AU)

Agentes da Piroplasmose equina: variabilidade genética de Theileria equi e Babesia caballi em equinos naturalmente infectados do estado do Rio de Janeiro e a dinâmica da infecção de Theileria equi em Rhipicephalus (Boophilus) microplus

Os objetivos deste trabalho foram caracterizar molecularmente Theileria equi e Babesia caballi de amostras de equinos do Rio de Janeiro, bem como realizar um estudo da dinâmica da infecção de T. equi em Rhipicephalus (Boophilus) microplus. No primeiro capítulo realizou-se a caracterização molecular de um fragmento do gene rap-1 de B. caballi e a análise do grau de heterogeneidade do gene 18S rDNA em T. equi em amostras de equinos naturalmente infectados, do estado do Rio de janeiro. Foram obtidas vinte sequências do gene 18S rDNA de T. equi. As análises filogenéticas foram realizadas baseadas no ARB-Silva. Para a caracterização molecular de um fragmento do gene rap-1 de B. caballi foram utilizadas amostras positivas por cELISA e qPCR. Uma nested PCR foi desenvolvida para amplificar um fragmento do gene rap-1, e uma PCR convencional, para o gene completo. As sequências de aminoácidos e nucleotídeos sequenciados foram submetidas ao método Maximum- Likelihood. Na análise das sequências do 18S rDNA de T. equi, doze diferentes isolados foram observados em equinos no estado do Rio de Janeiro, sendo agrupados em dois dos três clados formados (I, II). As sequências de T. equi se agrupam dentro de um clado diferente dos demais Theilerídeos. Uma das 23 sequências de aminoácidos do gene rap-1 apresentou doze pontos de mutação. Na análise de agrupamentos, as amostras brasileiras agruparam no clado A, sendo estas analisadas como aminoácidos (152 aas) ou nucleotídeos (1244 pb). No segundo capítulo foram avaliados aspectos da dinâmica da infecção de T. equi em R. (B.) microplus alimentados em equino cronicamente infectado. Larvas de uma colônia livre de hemoparasitos foram utilizadas. Carrapatos e sangue do equino foram coletados de dois em dois dias. Os carrapatos foram dissecados e armazenados inteiros em pools de acordo com o dia pós-infestação, estágio evolutivo e gênero. Amostras de glândula salivar e ovário foram armazenados para Microscopia Eletrônica de Transmissão. As amostras foram testadas pela qPCR. Com relação aos carrapatos inteiros, mais de 90% das amostras foram positivas para T. equi. A carga parasitária média das amostras de carrapatos inteiros e glândulas salivares apresentaram aumento gradual com o avançar do período de alimentação. Das 45 amostras de glândula salivar, 77,78% foram positivas para T. equi e tiveram maior taxa de infecção no final do período experimental. Foi possível observar positividade em carrapatos recém emergidos, ninfas e adultos, indicando a ocorrência de transmissão transestadial. A positividade de amostras de ovários foi de 84,38%. A maior permanência de machos sobre o equino, associado à alta positividade deste tipo de amostra indicam que o macho pode ter participação significativa na transmissão. Visualizaram-se estruturas morfologicamente compatíveis com um piroplasma através de micrografia de transmissão em ovários e glândulas salivares de em R. (B.) microplus. A análise do gene 18S rDNA de T. equi e do gene rap-1 de B. caballi de amostras brasileiras demonstrou que diferentes isolados coexistem na mesma área. Experimentalmente, observou-se que R. (B.) microplus é capaz de se infectar com T. equi e que as formas multiplicam-se nas glândulas salivares e, possivelmente, em ovários.

This study aimed to perform the molecular characterization of the B. caballi rap-1 gene and to analyze the degree of heterogeneity of the T. equi 18S rDNA gene of naturally infected horses in the state of Rio de Janeiro. Complete sequences of the T. equi 18S rDNA gene (n = 20) were obtained. The PCR products were cloned and sequenced. Phylogenetic analyzes were performed on ARB-Silva basis. For the molecular characterization of a fragment of the B. caballi rap-1 gene, 32 cELISA and qPCR positive equine samples were used. A nested PCR was developed to amplify a fragment of the rap-1 gene and a conventional PCR, aiming the amplification of the complete gene. The products were sequenced. Sequences were submitted to the Maximum-Likelihood reconstruction method with Poisson model and 1000 replicates. In the analysis of T. equi, twelve different isolates were observed in equines from the state of Rio de Janeiro and were grouped into two of the three clades formed (I, II), most of them grouped in clade I (70%, n = 14/20). The sequences of T. equi are grouped within a clade different from other Theilerids. It was possible to amplify a fragment of the B. caballi rap-1 gene from 23 sequences using nested PCR, identified as single sequences. One of the sequences showed twelve mutation points. In cluster analysis, the Brazilian samples belonged to clade A, being analyzed as amino acids (152a) or nucleotides (1244 bp). The aim of the second chapter was to evaluate the dinamic of infection of T. equi in R. (B.) microplus fed in chronically infected horses. The larvae obtained from a hemoparasite-free colony were used in the infestation of an equine chronically infected by T. equi. Ticks and the horse blood were collected every two days. Ticks were dissected and stored in pools according to the pos- infestation day, evolutionary stage and gender. Some of these specimens were stored entire. Salivary gland and ovary samples were stored properly for Transmission Electron Microscopy. Some stages, prior to ecdysis, were stored in B.O.D. to molt. Samples were tested by qPCR. Regarding to entire tick samples, more than 90% of the samples were positive for T. equi. The mean of parasite load in entire ticks and salivary glands presented gradual increasing with the progress of the feeding period. Of the 45 salivary gland samples, 77.78% were positive for T. equi and had a higher infection rate at the end of the experimental period. It was found freshly molted ticks positives for T. equi by qPCR, indicating transestadial transmission. 84,38% of R. (B.) microplus ovary samples were considered positives for T. equi by molecular tools. Males of R. (B.) microplus were found parasiting the equine for 60 days. This fact associated with the high positivity for T. equi indicates males as an epidemiologically important gender. Transmission micrographs revealed morphologic structures compatible with a Piroplasmid in the acini of salivary glands and ovaries. The phylogenetic analysis of the T. equi 18S rDNA gene and of B. caballi rap-1 gene showed that different isolates co-exist in the same area in Rio de Janeiro, Brazil. Experimently, it was possible to observe that R. (B.) microplus could be infected with T. equi and that the forms of development of this parasite are capable of multiply inside salivary glands and, possibly, ovaries.

Utilização da proteína EMA-2 recombinante de Theileria equi, expressa em Pichia pastoris, como imunobiológico

A theileriose, doença endêmica no Brasil, é uma piroplasmose causada pelo protozoário intraeritrocitário, Theileria equi. Provoca perdas associadas tanto a fatores clínicos como a restrição ao trânsito de animais soropositivos. A transmissão de T. equi ocorre principalmente no repasto do carrapato, o qual inocula suas formas infectantes (esporozoítos) nos equídeos, que são os hospedeiros vertebrados. O diagnóstico e a prevenção desta enfermidade se fazem necessários em áreas endêmicas e não endêmicas devido à disseminação dos vetores e do protozoário e de sua alta prevalência. Diferentes plataformas de ELISAs têm sido desenvolvidas com a utilização de antígenos recombinantes. A proteína de superfície de merozoíto EMA-2 é liberada no citoplasma e na membrana do eritrócito, sugerindo ser um dos primeiros antígenos reconhecidos pelo sistema imune. O objetivo desse estudo foi avaliar a proteína EMA-2 de Theileria equi, expressa em Pichia pastoris, como imunobiológico. Após expressão da glicoproteína EMA-2 foi desenvolvido um ELISA indireto. O ELISA demonstrou sensibilidade de 90,9% e especificidade de 83,3% quando comparado ao kit comercial de cELISA. A proteína também demonstrou imunogenicidade ao testarmos soros de camundongos imunizados com EMA-2 recombinante, por imunofluorescência. Sendo a proteína EMA-2 antigênica e imunogênica, poderá ser usada, além dos testes de diagnóstico, como antígeno para o desenvolvimento de vacinas de subunidade.

Theileriosis, endemic disease in Brazil, is a piroplasmosis caused by intraerythrocytic protozoan, Theileria equi. Causes losses associated with both clinical factors and restriction on the movement of positive animals. Transmission of T. equi occurs mainly during tick feeding which inoculates their infective forms (sporozoites) in horses, which are the vertebrate hosts. The diagnosis and prevention of this disease is needed in endemic and non endemic areas due to the presence of vectors and protozoa. Different ELISAs platforms have been developed using recombinant antigens. EMA-2 is released into the cytoplasm and erythrocyte membrane, suggesting that one of the first antigens recognized by the immune system. The aim of this study was to evaluate the EMA-2 protein of Theileria equi, expressed in Pichia pastoris, as immunobiological. After expression of EMA-2 glycoprotein, an indirect ELISA was developed. The ELISA demonstrated sensitivity of 90.9% and specificity of 83.3% when compared to the commercial kit cELISA. The protein also showed immunogenicity when test the sera of immunized mice with recombinant EMA-2 by immunofluorescence. As the EMA-2 protein antigenic and immunogenic, it may be used diagnostic tests as well as a promising antigen for the development of subunit vaccines.

Factors associated to Theileria equi in equids of two microregions from Rio de Janeiro, Brazil / Fatores associados à Theileria equi em equídeos de duas microrregiões do Rio de Janeiro, Brasil

Serum samples from 714 equids of Itaguaí and Serrana microregions, Rio de Janeiro, southeastern Brazil, were examined by indirect fluorescent antibody test (titer 1:80) for Theileria equi. The prevalence in the microregions and factors associated with seropositivity were evaluated and the prevalence ratio (PR) calculated. The overall prevalence of T. equi infection was 81.09 percent (n = 579), with higher prevalence (p < 0.05) in the Itaguaí (85.43 percent) when compared to Serrana microregion (76.92 percent). The geographic area, altitude, farming condition and area of origin of equids were associated (p < 0.05) with seropositivity for T. equi. Equids reared in the Itaguaí microregion (PR = 1.11, p = 0.003) and at altitudes below 500 m (PR = 1.10; p = 0,014) were more likely to be seropositive for T. equi. Furthermore, when equids were born in the farm (PR = 1.10, p = 0.008) and reared with poor farming conditions (PR = 1.13, p = 0.018) they were more likely to be exposed to T. equi. The main ticks found on equids were Amblyomma cajennense and Dermacentor (Anocentor) nitens. The microregions studied are endemic areas for equine theileriosis and there exists enzootic stability for T. equi. Only factors related to the collection area of serum samples influenced the seropositivity of equids for T. equi in that region.(AU)

Amostras de soro de 714 equídeos das microrregiões de Itaguaí e Serrana, Rio de Janeiro, Brasil, foram submetidas ao teste de imunofluorescência indireta (título 1:80) para Theileria equi. A prevalência entre as microrregiões e os fatores associados à soropositividade foram avaliados e a razão de prevalência (RP) calculada. A prevalência geral para T. equi foi de 81,09 por cento (n = 579), com maior prevalência (p < 0,05) para microrregião de Itaguaí (85,43 por cento), quando comparado a Serrana (76,92 por cento). A região, altitude, nível da propriedade e origem dos equídeos foram associados (p < 0,05) com a soropositividade para T. equi. Equídeos criados na microrregião de Itaguaí (RP = 1,11; p = 0,003) e em altitudes abaixo de 500 m (RP = 1.10; p = 0,014) apresentaram maior chance de se tornarem soropositivos para T. equi. Além disso, quando são criados em propriedades de nível ruim (RP = 1,13; p = 0,018) e nascidos na propriedade (RP = 1,10; p = 0,008) apresentaram mais chance de terem contato com T. equi. As principais espécies de carrapatos encontradas parasitando os equídeos foram Amblyomma cajennense e Dermacentor (Anocentor) nitens. As microrregiões estudadas são endêmicas para theileriose equina e de estabilidade enzoótica para T. equi. Apenas os fatores relacionados à área de coleta das amostras de soro influenciaram a soropositividade dos equídeos para T. equi naquela região.(AU)