Investigation of Tritrichomonas foetus in cryopreserved bovine semen by culture and polymerase chain reaction / Pesquisa por Tritrichomonas foetus em sêmen bovino criopreservado mediante isolamento e reação em cadeia da polimerase

Bovine Trichomoniasis (BT) is an infectious disease caused by Tritrichomonas foetus that can be transmitted either sexually or by fomites. In males, the disease is asymptomatic and permanent. T. foetus has been detected in semen samples where it is able to remain viable even when frozen. The objective of this study was to investigate the presence of T. foetus in 27 samples of commercial frozen bovine semen by culture and Polymerase Chain Reaction (PCR). Samples were thawed in water at 37°C. Part of the samples was inoculated in a test tube containing Diamond's medium and incubated at 35°C. Growth was evaluated every 24 hours via direct examination under a microscope. The other part was placed in an Eppendorf tube and frozen for later molecular analysis. After 10 days of culture, all samples were negative for T. foetus. The Quick-DNA Miniprep Kit (Zymo Research) without proteinase K was used for DNA extraction. The primers used in PCR were TRF3 and TRF4. PCR results were negative for all samples. In conclusion, bovine semen samples were negative for T. foetus in both diagnostic methods, according to the adopted methodology.(AU)

A tricomonose genital bovina (TGB), uma doença infectocontagiosa causada pelo Tritrichomonas foetus, é transmitida por via venérea e fômites contaminados. Em machos a doença é assintomática e permanente. O agente já foi encontrado em amostras de sêmen e é capaz de permanecer viável quando congelado. Este trabalho teve por objetivo investigar a presença de T. foetus em 27 amostras de sêmen bovino comercial congelado, por meio de cultivo e reação em cadeia da polimerase (PCR). As amostras foram descongeladas em água a 37ºC; parte foi inoculada em tubo de ensaio contendo meio Diamond, incubada a 35ºC com consequente avaliação de crescimento e avaliada a cada 24 horas, via exame direto em microscópio, e a outra parte foi diluída em PBS para análise molecular. Após 10 dias de cultivo, todas as amostras foram negativas. Para a detecção molecular foi utilizado o kit Quick-DNA Miniprep (Zymo Research) sem proteinase K para extração do DNA. Os iniciadores utilizados na PCR foram TRF3 e TRF4. O resultado da PCR foi negativo para todas as amostras. Conclui-se que as amostras utilizadas foram realmente negativas para a presença do patógeno em ambos os métodos diagnósticos, o que comprovou a inocuidade do sêmen testado.(AU)

Occurrence of Campylobacter fetus subsp. venerealis and Tritrichomonas foetus dna in bulls from Alagoas State, Brazil / Ocorrência de dna de Campylobacter fetus subsp. venerealis e Tritrichomonas foetus em touros no Estado de Alagoas, Brasil

The aim of the present study is to diagnose the occurrence of infections caused by Campylobacter fetus subsp. venerealis and Tritrichomonas foetus in reproducer bulls from Alagoas State breeders, Brazil. The total of 162 preputial smegma samples were collected from nelore bulls from ten rural properties in the East, Agreste and Sertão mesoregions. The samples were subjected to the Polymerase Chain Reaction (PCR) technique in order to assess C. fetus subsp. venerealis and Tritrichomonas foetus DNA and cultivated in Modified Diamond Medium (DMM) for Tritrichomonas foetus isolation. Four point nine percent (4.9% - 8/162) of the evaluated bulls were infected with C. fetus subsp. venerealis and 3.0% (5/162) of the sample were infected with T. foetus, which was not isolated in any of the assessed animals. Based on our results, there was C. fetus subsp. venerealis and T. foetus DNA in bulls from Alagoas State, Brazil. Accordingly, it is necessary performing laboratory examinations in animals living in properties breeding animals for reproduction purpose in order to monitor and control such infections.(AU)

Objetivou-se com esta pesquisa diagnosticar a ocorrência das infecções por Campylobacter fetus subsp. venerealis e Tritrichomonas foetus em touros, provenientes de propriedades localizadas no estado de Alagoas, Brasil. Foram coletadas 162 amostras de esmegma prepucial de touros da raça nelore, procedentes de dez propriedades rurais das mesorregiões Leste, Agreste e Sertão. Para a pesquisa de DNA de C. fetus subsp. venerealis e Tritrichomonas foetus as amostras foram submetidas à técnica Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e para isolamento de Tritrichomonas foetus foram cultivadas em Meio Diamond Modificado (DMM). Observou-se a ocorrência da infecção por C. fetus subsp. venerealis em 4,9% (8/162) dos touros analisados e 3,0% (5/162) para T. foetus. Não foi isolado T. foetus em nenhuma das amostras analisadas. Os resultados deste estudo confirmam a ocorrência de DNA de C. fetus subsp. venerealis e T. foetus em touros no estado de Alagoas, Brasil. Desta forma, constata-se a necessidade da realização de exames laboratoriais em propriedades de bovinos destinadas à reprodução para um monitoramento e controle dessas infecções.(AU)

Ocorrência da infecção por Campylobacter fetus subsp. venerealis e Tritrichomonas foetus em búfalos no estado de Pernambuco, Brasil / Infection occurrence of Campylobacter fetus subsp. venerealis and Tritrichomonas foetus in buffaloes in the state of Pernambuco, Brazil

Objetivou-se com estudo determinar a ocorrência da infecção por Campylobacter fetus subsp. venerealis e Tritrichomonas foetus em búfalos no estado de Pernambuco, Brasil. Foram coletadas 133 amostras biológicas (muco cervicovaginal e raspado prepucial) de animais, procedentes de oito propriedades, de diferentes regiões do estado. O material biológico coletado foi transferido para solução salina tamponada (PBS) e, posteriormente, inoculado em meios de transporte específicos, Lander para diagnóstico de C. fetus subsp. venerealis e Diamond para T. foetus. Para o diagnóstico das infecções por Campylobacter fetus subsp. venerealis e Tritrichomonas foetus, as amostras foram submetidas à reação em cadeia da polimerase (PCR) e cultivadas em meio ágar Columbia acrescido de antibiótico e Diamond, respectivamente. Para pesquisa de C. fetus subsp. venerealis, observou-se uma ocorrência de 1,8% (2/113) de animais positivos no exame microbiológico com confirmação pela PCR. Em relação à procedência, observou-se que 100% das amostras positivas pertenciam a dois machos do mesmo rebanho. Nenhum animal foi positivo na pesquisa de T. foetus. Este é o primeiro registro da infecção por C. fetus subsp. venerealis em búfalos no Brasil. Apesar da baixa ocorrência, recomenda-se adoção de medidas de controle, com o intuito de se evitar a disseminação do agente para outros rebanhos.(AU)

The objective this study was to determine the occurrence of infection with Campylobacter fetus subsp. venerealis and Tritrichomonas foetus in buffaloes in the State of Pernambuco, Brazil. Biological samples were collected (cervico vaginal mucus and shaved prepucial) of 113 animals, coming from 8 properties in different regions of the state. The biological material collected was transferred into phosphate buffered saline (PBS) and inoculated in the specific transport, Lander for diagnosis of C. fetus subsp. venerealis and Diamond for T. fetus subsequently. For the diagnosis of infection by Campylobacter fetus subsp. venrealis and Tritrichomonas foetus the samples were submitted to Polymerase Chain Reaction (PCR) grown in Columbia agar plus antibiotics and Diamond, respectively. There was an occurrence of 1.8% (2/113) of positive animals in the microbiological examination with confirmation by PCR, for C. fetus subsp. venerealis. We observed that 100% of positive samples were from two (2) males from the same herd. No animals were positive for T. foetus. This is the first report of infection with C. fetus subsp. venerealis in buffaloes in Brazil. Despite rare occurrence, control measures are recommended in order to prevent the spread of the agent to other herds.(AU)

Ocorrência da infecção por Campylobacter fetus subsp. venerealis e Tritrichomonas foetus em búfalos no estado de Pernambuco, Brasil / Infection occurrence of Campylobacter fetus subsp. venerealis and Tritrichomonas foetus in buffaloes in the state of Pernambuco, Brazil

Objetivou-se com estudo determinar a ocorrência da infecção por Campylobacter fetus subsp. venerealis e Tritrichomonas foetus em búfalos no estado de Pernambuco, Brasil. Foram coletadas 133 amostras biológicas (muco cervicovaginal e raspado prepucial) de animais, procedentes de oito propriedades, de diferentes regiões do estado. O material biológico coletado foi transferido para solução salina tamponada (PBS) e, posteriormente, inoculado em meios de transporte específicos, Lander para diagnóstico de C. fetus subsp. venerealis e Diamond para T. foetus. Para o diagnóstico das infecções por Campylobacter fetus subsp. venerealis e Tritrichomonas foetus, as amostras foram submetidas à reação em cadeia da polimerase (PCR) e cultivadas em meio ágar Columbia acrescido de antibiótico e Diamond, respectivamente. Para pesquisa de C. fetus subsp. venerealis, observou-se uma ocorrência de 1,8% (2/113) de animais positivos no exame microbiológico com confirmação pela PCR. Em relação à procedência, observou-se que 100% das amostras positivas pertenciam a dois machos do mesmo rebanho. Nenhum animal foi positivo na pesquisa de T. foetus. Este é o primeiro registro da infecção por C. fetus subsp. venerealis em búfalos no Brasil. Apesar da baixa ocorrência, recomenda-se adoção de medidas de controle, com o intuito de se evitar a disseminação do agente para outros rebanhos.(AU)

The objective this study was to determine the occurrence of infection with Campylobacter fetus subsp. venerealis and Tritrichomonas foetus in buffaloes in the State of Pernambuco, Brazil. Biological samples were collected (cervico vaginal mucus and shaved prepucial) of 113 animals, coming from 8 properties in different regions of the state. The biological material collected was transferred into phosphate buffered saline (PBS) and inoculated in the specific transport, Lander for diagnosis of C. fetus subsp. venerealis and Diamond for T. fetus subsequently. For the diagnosis of infection by Campylobacter fetus subsp. venrealis and Tritrichomonas foetus the samples were submitted to Polymerase Chain Reaction (PCR) grown in Columbia agar plus antibiotics and Diamond, respectively. There was an occurrence of 1.8% (2/113) of positive animals in the microbiological examination with confirmation by PCR, for C. fetus subsp. venerealis. We observed that 100% of positive samples were from two (2) males from the same herd. No animals were positive for T. foetus. This is the first report of infection with C. fetus subsp. venerealis in buffaloes in Brazil. Despite rare occurrence, control measures are recommended in order to prevent the spread of the agent to other herds.(AU)

Prevalence of Tritrichomonas foetus and Campylobacter fetus subsp. venerealis among bulls slaughtered in the state of Minas Gerais, Brazil / Prevalência de Tritrichomonas foetus, Campylobacter fetus subsp. venerealis e de Campylobacter fetus subsp. fetus em touros abatidos no Estado de Minas Gerais, Brasil

Bovine genital campylobacteriosis (BGC) and bovine genital trichomonosis (BGT) are globally widespread, predominantly sexually transmitted diseases that mainly affect herds in which natural mating takes place. Bulls serve as good epidemiological indicators for studying the causative agents of these diseases in cattle herds. The objective of the present work was to determine the prevalence of BGC and BGT among bulls sent to slaughterhouses in southern Minas Gerais, Brazil. Samples of preputial smegma from 200 sexually mature, non-castrated bulls of several ancestries were collected in 2013 from four regional slaughterhouses. The polymerase chain reaction (PCR) was employed to detect Tritrichomonas foetus, Campylobacter fetus subsp. fetus, and C. fetus subsp. venerealis. Isolation also was used aiming to diagnosis of BGT. All smegma samples were negative in culture for T. foetus. Molecular tests revealed 8% (16/200) of animals to be positive for T. foetus, 17.5% (35/200) for Campylobacter. fetus subsp. fetus, and 13.5% (27/200) for C. fetus subsp. venerealis. The results of the present study indicate that T. foetus, C. fetus subsp. venerealis, and C. fetus subsp. fetus are present among bulls slaughtered in southern Minas Gerais, and that BGC and BGT occur in this region. These diseases therefore need to be considered during differential diagnosis of reproductive diseases affecting cattle herds in which natural mating is employed.(AU)

A Campilobacteriose Genital Bovina (CGB) e a Tricomonose Genital Bovina (TGB) são doenças de transmissão predominantemente venérea, de ampla disseminação mundial, acometendo principalmente rebanhos submetidos à monta natural. Touros constituem bons indicadores epidemiológicos para a pesquisa destes agentes nos rebanhos. O objetivo deste estudo foi determinar a prevalência da CGB e da TGB em touros encaminhados a abatedouros da região sul de Minas Gerais, Brasil. Amostras de esmegma prepucial de 200 touros (machos não castrados em idade compatível com a monta) de diversas genealogias foram coletadas em quatro abatedouros da região, no ano de 2013. A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi utilizada para detecção dos patógenos Tritrichomonas foetus, Campylobacter fetus subsp. fetus e Campylobacter fetus subsp. venerealis. O isolamento também foi utilizado para o diagnóstico da TGB. Todas as amostras analisadas apresentaram resultado negativo na cultura para isolamento de T. foetus. Por meio dos testes moleculares, verificaram-se prevalências de 8% (16/200) de animais positivos para T. foetus; 17,5% (35/200) para C. fetus subsp. fetus e de 13,5% (27/200) para C. fetus subsp. venerealis. Os dados do presente estudo apontaram a presença de T. foetus, C. fetus subsp. venerealis e C. fetus subsp. fetus em touros abatidos na região sul de Minas Gerais, evidenciando a ocorrência da TGB e da CGB nesta região e a necessidade de inclusão destas enfermidades no diagnóstico diferencial das doenças da reprodução em rebanhos bovinos submetidos à monta natural.(AU)

Pesquisa de Campylobacter fetus subsp. venerealis e Tritrichomonas foetus em sêmen de centrais de inseminação artificial e touros de propriedades destinadas à reprodução

Objetivou-se com este estudo pesquisar a ocorrência de Campylobacter fetus subsp. venerealis e Tritrichomonas foetus em touros. Foram coletadas 162 amostras de esmegma prepucial de reprodutores da raça nelore, procedentes de dez propriedades rurais do estado de Alagoas, 60 amostras de sêmen congelado procedentes de seis centrais de coleta e processamento de sêmen (CCPS) do País e 50 amostras de sêmen fresco procedentes de touros de propriedades destinadas à reprodução nos estados de Alagoas e Pernambuco. Para a pesquisa de DNA de C. fetus subsp. venerealis e Tritrichomonas foetus as amostras foram submetidas à técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e para isolamento de Tritrichomonas foetus as amostras foram cultivadas em Meio Diamond Modificado (DMM). Para as amostras de esmegma prepucial, observou-se a ocorrência do DNA de C. fetus subsp. venerealis em 4,9% (8/162) dos touros analisados e 3,0% (5/162) para T. foetus. Não foi isolado T. foetus em nenhum dos touros analisados. Nas amostras de sêmen congelado e fresco não foi detectado DNA de nenhum dos agentes pesquisados. Os resultados deste estudo confirmam a presença de DNA de C. fetus subsp. venerealis e T. foetus em amostras de esmegma de touros no estado de Alagoas, Brasil. Desta forma, constata-se a necessidade da realização de exames laboratoriais em propriedades de bovinos destinadas à reprodução para um monitoramento e controle desses agentes.

The aim of this study was to investigate the occurrence of Campylobacter fetus subsp. venerealis and Tritrichomonas foetus in bulls. A total of 162 samples of preputial smegma of Nellore breeders were collected from ten rural properties in the state of Alagoas, 60 samples of frozen semen from six semen collection and processing centers (CCPS) from Brazil and 50 samples of fresh bull semen in the states of Alagoas and Pernambuco. For the DNA research of C. fetus subsp. venerealis and Tritrichomonas foetus, the samples were submitted to the Polymerase Chain Reaction (PCR) technique and for the isolation of Tritrichomonas foetus the samples were cultured in Modified Diamond Medium (DMM). From the preputial smegma samples, the DNA of C. foetus subsp. venerealis were identified in 4.9% (8/162) of the analyzed bulls and 3.0% (5/162) of T. foetus. T. foetus was not isolated in any of the samples bulls. In both frozen and fresh semen samples, no DNA was detected from any of the investigated agents. The results of this study confirm the presence of C. fetus subsp. venerealis and T. foetus in samples of smegma from bulls from Alagoas state, Brazil. Therefore, it is necessary perform out laboratory tests on breeding bulls for monitoring and control of these agents.

IDENTIFICAÇÃO DE PARABASALÍDEOS EM AMOSTRAS FECAIS DE PEQUENOS RUMINANTES E SUÍNOS

CARREIRO, Caroline Cunha, Isolamento de Parabasalideos de Amostras Fecais de Pequenos Ruminantes e Suínos, Seropédica; UFRRJ, 2018. 109 p. Tese (Medicina Veterinária) Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, 2018. Tricomonose é causada por protozoários pertencentes ao filo Parabasalia, que são encontrados parasitando o trato digestório e geniturinário de diferentes espécies animais, inclusive humanos. Anteriormente esses parabasalídeos não eram considerados responsáveis por infecções emergentes por apresentar-se envolvidos não só em regiões específicas de infecção, como também hospedeiro-específico. No entanto, vem sendo observada a presença de um mesmo protozoário com uma grande diversidade de hospedeiros, sendo estes atribuídos a diferentes distúrbios clínicos. Em suínos, esses flagelados são descritos no trato intestinal, e estão associados a quadro de diarreia; na cavidade nasal, está associado à rinite atrófica, além de outros distúrbios respiratórios. No entanto, pouco se sabe a respeito das possíveis espécies de parabasalídeos envolvidas no parasitismo nos pequenos ruminantes. O objetivo desse estudo foi diagnosticar as espécies de parabasalídeos encontradas no trato gastrointestinal de caprinos, ovinos e suíno. Para tal, este estudo foi dividido em partes. Na primeira foi feito a triagem das amostras fecais, com avaliação de frequência destes protozoários, isolamento e cultivo, além da caracterização morfológica em nível de filo e identificação molecular dos isolados. A segunda e terceira partes consistiram na tipificação do comportamento de Tetratrichomonas sp isolados de amostras fecais de pequenos ruminantes em meio de cultivo e a caracterização morfológica dessa espécie, respectivamente. A frequência de parabasalídeos encontrada foi de 42,85 % em caprinos (6/14), 68% em ovinos (30/44) e 71,25% em suínos (57/80). O meio de cutivo CHD foi o melhor entre os testados para o isolamento desses flagelados; todos os isolados apresentaram características morfológicas compatíveis com o filo Parabasalia. O sequenciamento revelou que todos os isolados de pequenos ruminantes detinham 100% de similaridades com Tetratrichomonas sp isolados de prepúcio de touro. Em suínos, além de diagnosticadas diferentes espécie do gênero Tetratrichomonas, ainda foi isolado Pentatrichomonas hominis. Estes flagelados estão envolvidos em diversos distúrbios clínicos em diferentes hospedeiros, e o papel destes animais como reservatórios de parabasalídeos devem ser cautelosamente considerados. Este estudo foi o primeiro a relatar a ocorrência de Tetratrichomonas sp em pequenos ruminantes, e realizar a cinética de crescimentos destes espécimes em meio de cultivo. Palavras chave: tricomonose, Pentatrichomonas hominis, Tetratrichomonas, Cultivo in vitro, morfologia.

CARREIRO, Caroline Cunha, Isolation of Parabasalids in Fecal Samples: Small Ruminants and Pigs, Seropédica; UFRRJ, 2018. 109 p. Tese (Medicina Veterinária) Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, 2018. Trichomoniasis is caused by protozoa belonging to the phylum Parabasalia, which are found parasitizing the digestive tract and genitourinary tract of different animal species, including humans. Previously, these parabasalids were not considered to be responsible for emerging infections because they were involved not only in specific infection regions, but also in host specific regions. However, the presence of a same protozoan with a great diversity of hosts has been observed, being these attributed to different clinical disorders. In swine, these flagellates are described in the intestinal tract, and are associated with diarrhea; in the nasal cavity, is associated with atrophic rhinitis, in addition to other respiratory disorders. However, little is known about the possible parabasalid species involved in parasitism in small ruminants. The objective of this study was to diagnose the parabasalid species found in the gastrointestinal tract of goats, sheep and swine. For this, this study was divided into parts. In the first one the fecal samples were screened, with frequency evaluation of these protozoa, isolation and cultivation, besides the morphological characterization at phylum level and molecular identification of the isolates. The second and third parts consisted in typing the behavior of Tetratrichomonas sp isolated from fecal samples of small ruminants in culture medium and the morphological characterization of this species, respectively. The frequency of parabasalids was 42.85% in goats (6/14), 68% in sheep (30/44) and 71.25% in pigs (57/80). The CHD assay medium was the best among the tested for the isolation of these flagellates; all isolates showed morphological characteristics compatible with the Parabasalia phylum. Sequencing revealed that all isolates of small ruminants had 100% similarities with Tetratrichomonas sp isolated from bull prepuce. In pigs, in addition to diagnosed different species of the genus Tetratrichomonas, Pentatrichomonas hominis was still isolated. These flagellates are involved in several clinical disorders in different hosts, and the role of these animals as parabasalid reservoirs should be carefully considered. This study was the first to report the occurrence of Tetratrichomonas sp in small ruminants, and to perform the kinetics of growth of these specimens in culture medium. Key words: Trichomoniasis, Pentatrichomonas hominis, Tetratrichomonas, In vitro culture, morphology

SITUAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA DAS INFECÇÕES POR Tritrichomonas foetus E Campylobacter fetus subsp. venerealis EM BOVINOS NA MICRORREGIÃO GEOGRÁFICA DO BREJO PARAIBANO

Objetivou-se com este estudo determinar a situação epidemiológica das infecções por Tritrichomonas foetus e Campylobacter fetus subsp. venerealis em bovinos na microrregião do Brejo Paraibano, região Nordeste do Brasil, identificando os possíveis fatores de risco associados à infecção por T. foetus. Para pesquisa de T. foetus foram coletadas 349 amostras de muco cérvico vaginal e esmegma em bovinos de corte e leite (290 fêmeas e 59 machos) em 31 propriedades e para pesquisa de C. fetus subsp. venerealis foram coletadas 273 amostras de muco cérvico vaginal de vacas leiteiras procedentes de 19 propriedades. Para a pesquisa do DNA dos agentes utilizou-se a Reação em Cadeia da Polimerase e cultivo com meio Diamond Modificado para isolamento de T. foetus. Para análise dos fatores de risco associados à infecção por Tritrichomonas foetus na espécie bovina, foi realizada uma análise univariada das variáveis de interesse pelo teste qui-quadrado de Pearson, ou Exato de Fisher, quando necessário. Posteriormente foi realizada uma regressão logística considerando como variável dependente para Tricomonose a PCR (positivo ou negativo). Foram elaborados mapas temáticos com as distribuições das prevalências na área estudada. A prevalência da infecção por C. fetus subsp. venerealis em vacas foi 7,7% (21/273) (I.C. 95%; 4,8 - 11,5%) e 31,6% (6/19) das propriedades apresentaram ao menos um animal positivo. A prevalência da infecção por T. foetus foi 3,7% (13/349) (I.C. 95%; 2,1 6,4%). Em relação ao sexo, observou-se uma prevalência da infecção por T. foetus de 4,5% (fêmeas) e 0,0% (machos). A porcentagem de propriedades que apresentaram ao menos um animal positivo para T. foetus foi de 19,3% (6/31). No cultivo, nenhuma amostra foi positiva para T. foetus. O fator de risco associado à infecção por T. foetus identificado neste estudo foi contato de fêmeas com touros de outras propriedades (OR 5,9; I.C. 1,5 22,4). Este é o primeiro relato da infecção por C. fetus subsp. venerealis em vacas leiteiras nesta região do Brasil e o primeiro na microrregião do Brejo Paraibano a analisar a infecção por T. foetus em bovinos. Para diminuir os riscos de infecção, recomenda-se a adoção de um programa de inseminação artificial nas propriedades com sêmen de touros negativos, bem como um programa de vacinação contra a Campilobacteriose Genital Bovina para estimular a imunidade, com o intuito de reduzir a ocorrência da infecção e possíveis problemas reprodutivos. O contato das fêmeas com machos de outras propriedades deve ser evitado, principalmente quando não se conhece o status sanitário desses touros em relação a estas duas infecções.

The objective of this study was to determine the epidemiological situation of infection by Tritrichomonas foetus and Campylobacter fetus subsp. venerealis in cattle at Brejo Paraibano microregion, Northeastern Brazil, identifying the possible risk factors associated with T. foetus infection. For the study of T. foetus, 349 samples of cervico-vaginal mucus and smegma were collected in beef and dairy cattle (290 females and 59 males) in 31 farms and for C. fetus subsp. venerealis, 273 samples of cervico-vaginal mucus from dairy cows from 19 farms were collected. Polymerase Chain Reaction was used to identify the DNA of the agents and culture with Modified Diamond medium for isolation of T. foetus. For analysis of risk factors associated with Tritrichomonas foetus infection in bovine species, univariate analysis of the variables of interest was performed by the Pearson chi-squared test, or Fisher's exact test, when necessary. Subsequently, logistic regression was performed considering PCR (positive or negative) as the dependent variable for trichomoniasis. Thematic maps were prepared with prevalence distributions in the studied area. The prevalence of C. fetus subsp. venerealis infection in cows was 7.7% (21/273) (CI 95% 4.8% 11.5%), and 31.6% (6/19) of the farms showed at least one positive animal. The prevalence of T. foetus infection was 3.7% (13/349) (CI 95%, 2.1 - 6.4%). Regarding the gender, a prevalence of T. foetus infection of 4.5% (females) and 0.0% (males) was observed. The percentage of farms that had at least one positive animal for T. foetus was 19.3% (6/31). In culture, no samples were positive for T. foetus. The risk factor associated with T. foetus infection identified in this study was contact of females with bulls of other farms (OR 5.9; CI 1.5 - 22.4). This is the first report of C. fetus subsp. venerealis infection in dairy cows in this region of Brazil and the first in Brejo Paraibano microregion that analyzed T. foetus infection in cattle. To reduce risk of infection, it is recommended to adopt an artificial insemination program on the farms with negative bull semen, as well as a vaccination program against Bovine Genital Campylobacteriosis to stimulate immunity to reduce the occurrence of infection and possible reproductive problems. Contact of females with males of other farms should be avoided, especially when the health status of these bulls is not known regarding these two infections.

Construção de iniciadores e otimização de ensaios de PCR e de nested-PCR para a detecção específica de Tritrichomonas foetus

Tritrichomonas foetus is a pathogenic protozoan that causes a venereal disease in cattle known as bovine genital tricomonosis. In spite of the efficacy to recognize the target genomic DNA, the protocols so far developed for the diagnosis of this organism by PCR promote some inespecific amplifications or they are unable to discriminate T. foetus against other species within the genus. The objective of this study was to assess and optimize PCR and nested-PCR assays for the specific diagnosis of T. foetus, using novel primers selected from the alignment of sequences of the genes 18S rRNA, 5.8S rRNA, 28S rRNA and of the internal transcribed spacers of the rDNA (ITS1 and ITS2). A pair of primers was constructed for the genus-specific amplification of a 648 bp fragment and two others to amplify T. foetus species-specific fragments of 343 and 429 bp. No cross amplification was observed against Bos taurus genomic DNA neither against the DNA of usual bovine genital pathogens. Both, single and nested-PCR assays, presented analytical sensitivity to detect at least two T. foetus organisms.

Tritrichomonas foetus é um protozoário patogênico responsável por doença venérea em bovinos conhecida por tricomonose genital bovina. A tricomonose bovina é uma doença venérea causada pelo protozoário cujo habitat natural é o trato genital. Os protocolos já desenvolvidos para o diagnóstico deste parasito por PCR, apesar de serem eficazes na identificação do DNA genômico alvo, promovem algumas amplificações inespecíficas ou são incapazes de distinguir T. foetus das outras espécies do gênero. O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de estabelecer e otimizar protocolos de ensaio de PCR e nested-PCR para o diagnóstico específico de T. foetus, empregando-se novos iniciadores, selecionados do alinhamento das seqüências dos genes 18S rRNA, 5,8S rRNA, 28S rRNA e dos espaços transcritos do rDNA (ITS1 e ITS2). Um par de iniciadores foi construído para amplificação gênero-específica de um fragmento de 648 pares de base e outros dois para a obtenção de produtos espécie- específicos de 343 e 429 pb. Nenhuma reação cruzada foi observada frente ao DNA genômico de Bos taurus ou de microrganismos responsáveis por infecções genitais. A sensibilidade dos ensaios de PCR e de nested-PCR apresentados neste estudo permitiu um limiar de detecção de até dois parasitos.

Occurrence of Campylobacter fetus subsp. venerealis and Tritrichomonas foetus dna in bulls from Alagoas State, Brazil / Ocorrência de dna de Campylobacter fetus subsp. venerealis e Tritrichomonas foetus em touros no Estado de Alagoas, Brasil

The aim of the present study is to diagnose the occurrence of infections caused by Campylobacter fetus subsp. venerealis and Tritrichomonas foetus in reproducer bulls from Alagoas State breeders, Brazil. The total of 162 preputial smegma samples were collected from nelore bulls from ten rural properties in the East, Agreste and Sertão mesoregions. The samples were subjected to the Polymerase Chain Reaction (PCR) technique in order to assess C. fetus subsp. venerealis and Tritrichomonas foetus DNA and cultivated in Modified Diamond Medium (DMM) for Tritrichomonas foetus isolation. Four point nine percent (4.9% - 8/162) of the evaluated bulls were infected with C. fetus subsp. venerealis and 3.0% (5/162) of the sample were infected with T. foetus, which was not isolated in any of the assessed animals. Based on our results, there was C. fetus subsp. venerealis and T. foetus DNA in bulls from Alagoas State, Brazil. Accordingly, it is necessary performing laboratory examinations in animals living in properties breeding animals for reproduction purpose in order to monitor and control such infections.

Objetivou-se com esta pesquisa diagnosticar a ocorrência das infecções por Campylobacter fetus subsp. venerealis e Tritrichomonas foetus em touros, provenientes de propriedades localizadas no estado de Alagoas, Brasil. Foram coletadas 162 amostras de esmegma prepucial de touros da raça nelore, procedentes de dez propriedades rurais das mesorregiões Leste, Agreste e Sertão. Para a pesquisa de DNA de C. fetus subsp. venerealis e Tritrichomonas foetus as amostras foram submetidas à técnica Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e para isolamento de Tritrichomonas foetus foram cultivadas em Meio Diamond Modificado (DMM). Observou-se a ocorrência da infecção por C. fetus subsp. venerealis em 4,9% (8/162) dos touros analisados e 3,0% (5/162) para T. foetus. Não foi isolado T. foetus em nenhuma das amostras analisadas. Os resultados deste estudo confirmam a ocorrência de DNA de C. fetus subsp. venerealis e T. foetus em touros no estado de Alagoas, Brasil. Desta forma, constata-se a necessidade da realização de exames laboratoriais em propriedades de bovinos destinadas à reprodução para um monitoramento e controle dessas infecções.

Prevalence of Tritrichomonas foetus and Campylobacter fetus subsp. venerealis among bulls slaughtered in the state of Minas Gerais, Brazil / Prevalência de Tritrichomonas foetus, Campylobacter fetus subsp. venerealis e de Campylobacter fetus subsp. fetus em touros abatidos no Estado de Minas Gerais, Brasil

Bovine genital campylobacteriosis (BGC) and bovine genital trichomonosis (BGT) are globally widespread, predominantly sexually transmitted diseases that mainly affect herds in which natural mating takes place. Bulls serve as good epidemiological indicators for studying the causative agents of these diseases in cattle herds. The objective of the present work was to determine the prevalence of BGC and BGT among bulls sent to slaughterhouses in southern Minas Gerais, Brazil. Samples of preputial smegma from 200 sexually mature, non-castrated bulls of several ancestries were collected in 2013 from four regional slaughterhouses. The polymerase chain reaction (PCR) was employed to detect Tritrichomonas foetus, Campylobacter fetus subsp. fetus, and C. fetus subsp. venerealis. Isolation also was used aiming to diagnosis of BGT. All smegma samples were negative in culture for T. foetus. Molecular tests revealed 8% (16/200) of animals to be positive for T. foetus, 17.5% (35/200) for Campylobacter. fetus subsp. fetus, and 13.5% (27/200) for C. fetus subsp. venerealis. The results of the present study indicate that T. foetus, C. fetus subsp. venerealis, and C. fetus subsp. fetus are present among bulls slaughtered in southern Minas Gerais, and that BGC and BGT occur in this region. These diseases therefore need to be considered during differential diagnosis of reproductive diseases affecting cattle herds in which natural mating is employed.

A Campilobacteriose Genital Bovina (CGB) e a Tricomonose Genital Bovina (TGB) são doenças de transmissão predominantemente venérea, de ampla disseminação mundial, acometendo principalmente rebanhos submetidos à monta natural. Touros constituem bons indicadores epidemiológicos para a pesquisa destes agentes nos rebanhos. O objetivo deste estudo foi determinar a prevalência da CGB e da TGB em touros encaminhados a abatedouros da região sul de Minas Gerais, Brasil. Amostras de esmegma prepucial de 200 touros (machos não castrados em idade compatível com a monta) de diversas genealogias foram coletadas em quatro abatedouros da região, no ano de 2013. A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi utilizada para detecção dos patógenos Tritrichomonas foetus, Campylobacter fetus subsp. fetus e Campylobacter fetus subsp. venerealis. O isolamento também foi utilizado para o diagnóstico da TGB. Todas as amostras analisadas apresentaram resultado negativo na cultura para isolamento de T. foetus. Por meio dos testes moleculares, verificaram-se prevalências de 8% (16/200) de animais positivos para T. foetus; 17,5% (35/200) para C. fetus subsp. fetus e de 13,5% (27/200) para C. fetus subsp. venerealis. Os dados do presente estudo apontaram a presença de T. foetus, C. fetus subsp. venerealis e C. fetus subsp. fetus em touros abatidos na região sul de Minas Gerais, evidenciando a ocorrência da TGB e da CGB nesta região e a necessidade de inclusão destas enfermidades no diagnóstico diferencial das doenças da reprodução em rebanhos bovinos submetidos à monta natural.

CONSTRUÇÃO DE PRIMERS E OTIMIZAÇÃO DE ENSAIOS DE PCR E DE NESTED-PCR PARA A DETECÇÃO ESPECÍFICA DE Tritrichomonas foetus

A tricomonose bovina é uma doença venérea que causa infertilidade e aborto em bovinos. O agente etiológico é o protozoário Tritrichomonas foetus, cujo habitat é o trato genital destes animais. Os protocolos desenvolvidos até o presente para o diagnóstico deste parasito por PCR, apesar de serem eficazes na identificação do DNA genômico alvo, promovem algumas amplificações inespecíficas ou são incapazes de distinguir T. foetus de outras espécies do gênero. Com o objetivo de buscar maior especificidade no diagnóstico molecular desta enfermidade, os estudos foram conduzidos na tentativa de avaliar e otimizar ensaios de PCR e nested-PCR, empregando-se novos primers selecionados a partir do alinhamento das seqüências dos genes 18S rRNA, 5,8S rRNA, 28S rRNA e do primeiro e segundo espaços transcritos do rDNA (ITS1 e ITS2). As seqüências foram obtidas junto ao GenBank referentes ao gênero Tritrichomonas e outros organismos da família Trichomonadidae. Foi construído um par de primers para reação espécie-específica e outro para a amplificação gênero-específica. A análise pelo BLASTn (basic local alignment search tool nucleotide GenBank) indicou a especificidade para cada primer. A avaliação da especificidade foi complementada então pelos ensaios de PCR testando os seguintes DNAs genômicos: Bos taurus, Herpesvirus bovino tipo-1, seis espécies de Brucella, 24 sorovares de L. interrogans, Campylobacter fetus venerealis, Campylobacter fetus fetus, Ureaplasma diversum, Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma bovis, Listeria monocytogenes e Neospora caninum. Nenhuma reação cruzada foi observada nestas reações. No entanto, a reação de PCR espécie-específica, reconheceu, além do DNA genômico de T. foetus, o de Tritrichomonas suis. A sensibilidade dos ensaios de PCR e de nested-PCR apresentados neste estudo permitiram um limiar de detecção de até dois parasitos em meio de cultura para diagnóstico