Molecular characterization of ureaplasmas isolated from reproductive tract of goats and sheep from Brazil

Ovine/caprine ureaplasmas have not yet been assigned a species designation, but they have been classified into nine serotypes. Herein ureaplasmas were searched for in 120 samples of vulvo vaginal mucous from sheep and 98 samples from goats at 17 farms. In addition, semen samples were collected from 11 sheep and 23 goats. The recovered ureaplasma were from sheep and goats from animals without any reproductive disorder symptoms, but not all animals presented positive cultures. In sheep, 17 (68%) cultures of vulvovaginal mucous were positive for ureaplasma and 11 (27%) samples of semen presented positive cultures in animals with clinical signs of orchitis, balanoposthitis or low sperm motility. In goats four ureaplasma isolates were obtained from vulvovaginal mucus, but the semen samples were all negative. The isolates were submitted to Pulsed-field gel electrophoresis methodology and their 16S rRNA genes were sequenced. Fifty percent of ureaplasma recovered from sheep allowed for PFGE typing. Eleven isolates showed eight profiles genetically close to the bovine ureaplasmas. The 16S rRNA gene sequencing showed differences or similarities of isolates from sheep and goats, and the reference strains of bovine and human ureaplasma. Four clinical isolates from sheep were grouped separately. The studied ureaplasma isolates showed to be a diverse group of mollicutes.(AU)

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE MOLLICUTES ASSOCIADO A FATORES DE RISCO E QUALIDADE DO LEITE EM BOVINOS LEITEIROS

A pecuária leiteira é uma das principais atividades do agronegócio brasileiro. Apesar do aumento na produção e consumo de leite, a produtividade dos rebanhos ainda é baixa. Dentre as causas de origem sanitária, destacam-se as mastites e as doenças reprodutivas. Em bovinos, Mollicutes são bactérias relacionadas a tais patologias sendo Mycoplasma bovis o agente de maior importância nas mastites, enquanto Ureaplasma diversum está associado a distúrbios reprodutivos. O objetivo deste estudo foi investigar a presença de Mollicutes em leite e trato reprodutivo de vacas leiteiras, identificar alterações no leite decorrentes da colonização intramamária, determinar fatores de risco associados à colonização intramamária e genital e identificar genotipicamente cepas de ureaplasmas circulantes. Foram obtidas amostras de leite (n=387) e de suabe vaginal (n=392) de vacas em lactação de rebanhos do Sudeste brasileiro, estados de Minas Gerais, Rio de Janeiro e São Paulo. O leite foi submetido à reação em cadeia da polimerase (PCR) para detecção de Mollicutes e de espécies de micoplasmas associadas à colonização intramamária, à contagem de células somáticas (CCS), análise microbiológica e de composição centesimal. O material de trato reprodutivo, à PCR para detecção de Mollicutes e de U. diversum. Concomitantemente, foi aplicado o questionário epidemiológico para analisar fatores de risco, avaliados pelo teste de Qui-quadrado, sendo as variáveis estatisticamente significativas submetidas ao odds ratio (IC=95%). As amostras positivas para U. diversum foram sequenciadas a partir da região intergênica 16S-23S rRNA. Mollicutes foram detectados em 21% (4/19) dos rebanhos e 4,1% (16/387) dos animais, sendo 1,3% (5/387) positivos para M. bovis e 2,8% (11/387) para M. arginini. Nas propriedades onde houve Mollicutes no leite, rebanho maior que 150 animais [OR=3,51 (IC 95%; 1,11-11,08)], ordenha manual [OR=9,97 (IC 95%; 2,80-35,49)] e ausência de linha de ordenha [OR=6,54 (IC 95%; 1,92-22,29)] foram fatores de risco; as concentrações de gordura (2,27±1,96 g/100g), extrato seco total (11,15±1,91 g/100g) e a CCS (1213,19±2151,98 CS/mL) foram superiores às propriedades onde não houve a detecção (p<0,05). Quanto ao material de trato reprodutivo, 45,4% (178/392) e 21,7% (85/392) das amostras foram positivas para Mollicutes e U. diversum, respectivamente. Rebanho maior que 100 animais [OR=1,95 (95% IC 1,28-2,98)], produção média de leite superior a 500kg [OR=5,79 (IC 95%; 2,31-14,48)], novilhas [OR=4,04 (IC 95%; 1,10-14,85)], raça Holandesa [OR=2,29 (IC 95%; 1,45-3,60)], uso de inseminação artificial associada à transferência de embriões [OR=1,42 (IC 95%; 1,20-1,69)] e histórico de doença reprodutiva [OR=2,28 (IC 95%; 1,37-3,80)] foram associadas à infecção por Mollicutes, enquanto rebanho maior que 100 animais [OR=1,91 (IC 95%; 1,12-3,27)] foi associada com a infecção por U. diversum (p<0,05). A frequência de detecção no leite foi baixa, sendo este o primeiro relato de M. bovis no Rio de Janeiro e de M. arginini nos estados estudados. No trato reprodutivo, a frequência dos agentes foi alta e diferentes cepas de U. diversum estão disseminadas pelos estados, provavelmente pela grande movimentação de animais. Os fatores de risco elencados sinalizam a necessidade de adoção de boas práticas de manejo para evitar a disseminação dos agentes em rebanhos bovinos leiteiros criados sob condições semelhantes.

Dairy farming is one of the main activities of Brazilian agribusiness. Despite the increase in milk production and consumption, productivity in herds is still low. Among the causes of sanitary origin, mastitis and reproductive diseases stand out. In cattle, Mollicutes are bacteria related to such pathologies, Mycoplasma bovis being the most important agent in mastitis, while Ureaplasma diversum is associated with reproductive disorders. The aim of the study was to investigate the presence of Mollicutes in milk and reproductive tract of dairy cows, identify changes in milk resulting from intramammary colonization, determine risk factors associated with intramammary and genital colonization and genotypically identify strains of circulating ureaplasmas. Milk (n=387) and vaginal swab (n=392) samples were collected from lactating cows in herds in Southeastern Brazil, Minas Gerais, Rio de Janeiro and São Paulo states. Milk was subjected to polymerase chain reaction (PCR) to detect Molicutes and Mycoplasma species associated with intramammary colonization, somatic cell count (CCS), microbiological analysis and chemical composition. The material of reproductive tract, to PCR for detection of Mollicutes and U. diversum. Concomitantly, an epidemiological questionnaire was applied to analyze risk factors, analyzed by Chi-square test, with the variables being statistically related to odds ratio (CI=95%). Positite swab samples for U. diversum were sequenced from 16S-23S rRNA intergenic region. Molicutes were detected in 21% (4/19) of the herds and 4.1% (16/387) of the animals, being 1.3% (5/387) positive for M. bovis and 2.8% (11/387) for M. arginini. In properties where Mollicutes were in milk, herds greater than 150 animals [OR=3.51 (95% CI; 1.11-11.08)], manual milking [OR=9.97 (95% CI; 2.80-35.49)] and absence of a milking line [OR=6.54 (95% CI; 1.92-22.29)] were risk factors; fat concentration (2.27±1.96 g/100g), total dry extract (11.15±1.91 g/100g) and CCS (1213.19±2151.98 CS/mL) were superior to the properties where there was no detection (p<0.05). Considering the reproductive tract material, 45.4% (178/392) and 21.7% (85/392) of samples were positive for Mollicutes and U. diversum, respectively. Herds greater than 100 animals [OR=1.95 (95% CI 1.28-2.98)], average milk production greater than 500kg [OR=5.79 (95% CI; 2.31-14.48 )], heifers [OR=4.04 (95% CI; 1.10-14.85)], Holstein breed [OR=2.29 (95% CI; 1.45-3.60)], use of artificial insemination associated with embryo transfer [OR=1.42 (95% CI; 1.20-1.69)] and history of reproductive disease [OR=2.28 (95% CI; 1.37-3.80 )] were associated with Mollicutes infection, while herds greater than 100 animals [OR=1.91 (95% CI; 1.12-3.27)] was associated with U. diversum infection (p<0.05). The frequency of detection in milk was low, and it was the first report of M. bovis in Rio de Janeiro and M. arginini in the studied states. In the reproductive tract, the frequency of the agents was high and different strains of U. diversum were spread across the states, probably due to the large movement of animals. The listed risk factors highlights the need for the adoption of good management practices to prevent the spread of the agents in dairy cattle herds raised under similar conditions.

Recovery of Mollicutes from the reproductive tract of dairy cattle in the state of Pernambuco, Brazil / Recuperação de Mollicutes do trato reprodutivo de bovinos leiteiros no Estado de Pernambuco

The aim of the present study was to report the occurrence of members of the Mollicutesclass in the reproductive system of dairy cattle in Brazil. Five farms containing dairy cattle were visited in January of 2012. In total, 100 cows of different ages, breeds and stages of lactation were examined in the present study. The cows were part of intensive or semi-intensive management systems and were submitted to mechanical milking or hand milking. The samples were collected after washing the vulvar region with water and soap, and then drying it with paper towels and disinfecting the area with alcohol (70°GL). Vaginal mucous was collected using a sterile alginate cotton swab, which was rubbed on the vagina, as well as the lateral and internal walls. Vulvovaginal mucous samples were cultured in both liquid and solid modified Hayflick´s medium, for mycoplasmas, and UB medium, for ureaplasmas. The PCR assays for Mollicutesand Ureaplasmaspp. were performed according to the standard protocols described in the current literature. During isolation, the frequency of Mycoplasmaspp. was of 13.0% (13/100) and for Ureaplasmaspp. was of 6.0% (6/100). In the PCR assays the frequency of Mollicuteswas of 26.0% (26/100) and for Ureaplasmaspp. was of 13.0% (13/100) in the dairy cattle studied. This is the first report of these agents in reproductive system of bovine of the Pernambuco state. Further studies are necessary to determine the pathogenic potential and species of these field isolates.(AU)

O presente estudo relata a ocorrência de membros da Classe Mollicutesno sistema reprodutivo de bovinos leiteiros no Brasil. Foram visitadas em janeiros de 2012 cinco fazendas de bovinos leiteiros. Um total de 100 vacas de diferentes idades, raças e estágios de lactação foram examinadas. Os animais foram mantidos em sistema de manejo intensivo e/ou semi-intensivo, sendo submetidos aos sistemas de ordenha manual ou mecânica. As amostras de muco foram colhidas após a lavagem da região vulvar com água e sabão, com posterior desinfecção com álcool (70°GL). O muco vaginal foi colhido com suabe alginado estéril que foi friccionado nas paredes internas da vagina. Em seguida, as amostras foram cultivadas em meio Hayflick´s modificado, para micoplasmas, e em meio UB, para ureaplasmas, ambos caldo e placa. Os ensaios da PCR para Mollicutese Ureaplasmaspp. foram realizados de acordo com protocolo padrão descrito na literatura. No isolamento, a frequência de Mycoplasmaspp. foi de 13% (13/100) e para Ureaplasmaspp. foi de 6% (6/100). Nas reações da PCR a frequência para Mollicutesfoi de 26% (26/100) e para Ureaplasmas spp. foi de 13% (13/100) nos rebanhos bovinos leiteiros estudados. Este é o primeiro relato destes agentes no trato reprodutivo de bovinos no Estado de Pernambuco. Estudos adicionais são necessários para determinar as espécies e o potencial patogênico destes isolados de campo.(AU)

Ocorrência de Mollicutes e Ureaplasma spp. em surto de doença reprodutiva em rebanho bovino no Estado da Paraíba / Occurrence of Mollicutes and Ureaplasma spp. in outbreak of reproductive disease in cattle herds, State of Paraíba, Brazil

Em março de 2012 foi diagnosticado um surto de doença reprodutiva em rebanho bovino no Estado da Paraíba, Brasil. Foram examinadas 32 vacas e dois touros da raça Girolando. As vacas apresentaram sinais de doença reprodutiva como repetição de cio, vulvovaginite granular, infertilidade e abortos. As amostras de suabes vaginais e prepuciais foram colhidas e submetidas a isolamento bacteriano e PCR. As reações da PCR para Mollicutes e Ureaplasma spp. foram realizadas com os iniciadores MGSO-GPO3 e UGP'F-UGP'R, respectivamente. Na Nested PCR para Ureaplasma diversum, os iniciadores usados foram UD1, UD2, UD3 e UD4. Para isolamento bacteriano, as amostras foram diluídas de 10-1 até 10-5, semeadas em meio "UB", líquido e placa, sendo incubadas por até 21 dias a 37ºC em jarra de microaerofilia. A frequência de Mollicutes detectada na PCR foi de 65,6% e para Ureaplasma spp. foi de 50,0%, enquanto que para U. diversum foi de 15,6%. No isolamento a frequência de Mollicutes foi de 57,1% e para Ureaplasma spp. foi de 28,6%. No ágar "UB" foi visualizado o crescimento misto de Mycoplasma spp. e Ureaplasma spp. em seis amostras. Foi confirmado o envolvimento de micro-organismos da Classe Mollicutes em surto de doença reprodutiva em vacas no sertão paraibano.(AU)

In March of 2012 was investigated a reproductive disease outbreak in cattle herds from Paraíba State, Brazil. Were examined 32 cows and two bulls Giroland breed. The cows showed signs and symptoms of reproductive failure such as repeat breeding, granular vulvovaginitis, infertility and abortions. Vaginal and preputial mucous samples were collected for analysis by PCR and isolation. The PCR reactions for Mollicutes and Ureaplasma spp. were realized with primers MGSO and GPO3, and UGP'F and UGP'R respectively. The nested PCR assay for Ureaplasma diversum was realized with primers UD1, UD2, UD3 and UD4. For bacteriologic isolation, obtained samples were diluted up to 10-1 at 10-5, inoculated into liquid and solid "UB" medium, and incubated for up to 21 days, at 37ºC in microaerophilie jar. In the PCR reactions the frequency of Mollicutes detected in the analyzed vaginal mucous samples was 65.6, for Ureaplasma spp. was 50.0, while for U. diversum was 15.6. The frequency for isolation of Mollicutes was of 57.1 and for Ureaplasma spp. was of 28.6. In the UB agar was visualized growth of Mycoplasma spp. and Ureaplasma spp., associated in six of the samples. In the cows the presence of Mollicutes and Ureaplasma spp. was confirmed for the reproductive disease outbreak in the semiarid region of Paraiba.(AU)

Antibiotic susceptibility profiles of Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum isolated during a population-based study concerning women infertility in northeast Romania

The study was carried out on 1068 infertile women under initial evaluation. For Mycoplasma hominis, the highest resistance rates were registered for ciprofloxacin (72.22%), followed by macrolides and ofloxacin. For Ureaplasma urealyticum, the ciprofloxacin resistance was also high (51.72%), while the resistance rates to other tested antibiotics were significantly lower.

Antibiotic susceptibility profiles of Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum isolated during a population-based study concerning women infertility in northeast Romania

The study was carried out on 1068 infertile women under initial evaluation. For Mycoplasma hominis, the highest resistance rates were registered for ciprofloxacin (72.22%), followed by macrolides and ofloxacin. For Ureaplasma urealyticum, the ciprofloxacin resistance was also high (51.72%), while the resistance rates to other tested antibiotics were significantly lower.

Isolamento e PCR para detecção de Mollicutes em muco vaginal e sua associação com problemas reprodutivos em ovinos criados na região de Piedade, São Paulo, Brasil

It was evaluated the presence of Mycoplasma spp, Ureaplasma spp and Acholeplasma laidlawiii in 60 samples of ovine vaginal mucous with the presence or absence of vulvovaginitis in the specific exam of the reproductive tract. The microorganisms were characterized based on bacteriological culture and DNA detection by Polymerase Chain Reaction (PCR) with specific primers to Mollicutes (GPO and MGSO), Ureaplasma (UGPF and UGPS) and Acholeplasma laidlawii (UNI and ACH3). The presence of mycoplasmas could not be associated with reproductive disorders in animals. The PCR to Acholeplasma laidlawii detected only one positive sample. However, all isolations of Ureaplasma spp were from animals presenting reproductive disorders, suggesting a possible involvement of this agent in reproductive diseases.

Pesquisou-se Mycoplasma spp, Ureaplasma spp e Acholeplasma laidlawiii em amostras de muco vaginal de 60 ovinos, criados na região de Piedade no Estado de São Paulo, Brasil, que apresentavam ou não vulvovaginite no exame específico do sistema genital. A caracterização desses microrganismos baseou-se no cultivo e detecção do respectivo DNA pela Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) com os primers para classe Mollicutes (GPO e MGSO), para o gênero Ureaplasma (UGPF e UGPS) e a espécie Acholeplasma laidlawii (UNI e ACH3). A presença de micoplasmas não foi associada com distúrbios do trato reprodutivo dos animais, entretanto todos os isolados obtidos de Ureaplasma spp foram provenientes de animais com distúrbios reprodutivos, sugerindo o possível envolvimento desse agente nas enfermidades da reprodução. A PCR para a espécie Acholeplasma laidlawii detectou somente uma amostra positiva.

Isolamento e PCR para detecção de Mollicutes em muco vaginal e sua associação com problemas reprodutivos em ovinos criados na região de Piedade, São Paulo, Brasil

It was evaluated the presence of Mycoplasma spp, Ureaplasma spp and Acholeplasma laidlawiii in 60 samples of ovine vaginal mucous with the presence or absence of vulvovaginitis in the specific exam of the reproductive tract. The microorganisms were characterized based on bacteriological culture and DNA detection by Polymerase Chain Reaction (PCR) with specific primers to Mollicutes (GPO and MGSO), Ureaplasma (UGPF and UGPS) and Acholeplasma laidlawii (UNI and ACH3). The presence of mycoplasmas could not be associated with reproductive disorders in animals. The PCR to Acholeplasma laidlawii detected only one positive sample. However, all isolations of Ureaplasma spp were from animals presenting reproductive disorders, suggesting a possible involvement of this agent in reproductive diseases.

Pesquisou-se Mycoplasma spp, Ureaplasma spp e Acholeplasma laidlawiii em amostras de muco vaginal de 60 ovinos, criados na região de Piedade no Estado de São Paulo, Brasil, que apresentavam ou não vulvovaginite no exame específico do sistema genital. A caracterização desses microrganismos baseou-se no cultivo e detecção do respectivo DNA pela Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) com os primers para classe Mollicutes (GPO e MGSO), para o gênero Ureaplasma (UGPF e UGPS) e a espécie Acholeplasma laidlawii (UNI e ACH3). A presença de micoplasmas não foi associada com distúrbios do trato reprodutivo dos animais, entretanto todos os isolados obtidos de Ureaplasma spp foram provenientes de animais com distúrbios reprodutivos, sugerindo o possível envolvimento desse agente nas enfermidades da reprodução. A PCR para a espécie Acholeplasma laidlawii detectou somente uma amostra positiva.

Isolamento e PCR para detecção de Mollicutes em muco vaginal e sua associação com problemas reprodutivos em ovinos criados na região de Piedade, São Paulo, Brasil

It was evaluated the presence of Mycoplasma spp, Ureaplasma spp and Acholeplasma laidlawiii in 60 samples of ovine vaginal mucous with the presence or absence of vulvovaginitis in the specific exam of the reproductive tract. The microorganisms were characterized based on bacteriological culture and DNA detection by Polymerase Chain Reaction (PCR) with specific primers to Mollicutes (GPO and MGSO), Ureaplasma (UGPF and UGPS) and Acholeplasma laidlawii (UNI and ACH3). The presence of mycoplasmas could not be associated with reproductive disorders in animals. The PCR to Acholeplasma laidlawii detected only one positive sample. However, all isolations of Ureaplasma spp were from animals presenting reproductive disorders, suggesting a possible involvement of this agent in reproductive diseases.

Pesquisou-se Mycoplasma spp, Ureaplasma spp e Acholeplasma laidlawiii em amostras de muco vaginal de 60 ovinos, criados na região de Piedade no Estado de São Paulo, Brasil, que apresentavam ou não vulvovaginite no exame específico do sistema genital. A caracterização desses microrganismos baseou-se no cultivo e detecção do respectivo DNA pela Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) com os primers para classe Mollicutes (GPO e MGSO), para o gênero Ureaplasma (UGPF e UGPS) e a espécie Acholeplasma laidlawii (UNI e ACH3). A presença de micoplasmas não foi associada com distúrbios do trato reprodutivo dos animais, entretanto todos os isolados obtidos de Ureaplasma spp foram provenientes de animais com distúrbios reprodutivos, sugerindo o possível envolvimento desse agente nas enfermidades da reprodução. A PCR para a espécie Acholeplasma laidlawii detectou somente uma amostra positiva.

Detecção de Mycoplasma spp. e Ureaplasma diversum em vacas com distúrbios reprodutivos / Detection of Mycoplasma spp. and Ureaplasma diversum in cown with reproductive disorders

Foram utilizadas 112 amostras de muco vulvovaginal, coletados de vacas com distúrbios reprodutivos, para pesquisa de Mycoplasma e Ureaplasma. Para isolamentos, foram usados meios específicos para micoplasmas (SP-4) e para ureaplasmas. PCR genérica, PCR específica para Mycoplasma bovis e nested-PCR em tubo único para Ureaplasma diversum foram realizados com os DNAs extraídos das amostras. Mycoplasma spp. e U. diversum foram detectados em 12,5 e 25,0 por cento, respectivamente. A PCR genérica resultou em reações positivas em 63,4 por cento das amostras transportadas em SP-4 e em 69,6 por cento das transportadas em meio de ureaplasma. M. bovis foi detectado, na PCR específica, em 9,8 por cento das amostras e U. diversum, na nested-PCR, em 37,5 por cento. Houve maior sensibilidade na metodologia da PCR quando comparada à técnica de cultivo para Mycoplasma e Ureaplasma(AU)

In the study, 112 samples of vulvovaginal mucus of cows bearing reproductive disturbance were investigated for Mycoplasma and Ureaplasma. Specific media for the culture of mycoplasmas (SP-4) and ureaplasmas were used. PCR with general primers, PCR specific for Mycoplasma bovis, and nested-PCR in a single tube for Ureaplasma diversum were performed to detect DNA of the sample. Mycoplasma spp. and U. diversum were isolated in 12.5 and 25.0 percent, respectively. With generic PCR, positive reaction was obtained in 63.4 percent of the samples transported in SP-4 and 69.6 percent in ureaplasma medium. M. bovis was detected in 9.8 percent of samples and nested-PCR in a single tube for U. diversum resulted in 35.0 percent of positive reaction. Results demonstrated increased sensitivity of PCR methodology compared with culture technique applied to the search of microorganisms of Mycoplasma and Ureasplasma genera(AU)

Isolates of Ureplasma diversum genotyped by single-enzyme amplified length polymorphism

Isolates of Ureaplasma diversum recovered from bovines with reproductive disorders and healthy ones of four premises were compared by SE-AFLP. Twenty-eight SE-AFLP profiles without monomorphic fragments were obtained. The ureaplasma studied were divided in clusters A and B. Cluster A was divided in subclusters A1 and A2, while A1 was divided in subclusters A1a and A1b. Cluster B grouped only the reference strains. The clusters obtained were not associated with the reproductive disorders. The dendrogram obtained showed high heterogeneity among the studied ureaplasmas and indicated a low genomic stability as detected in other species of microorganisms of class Mollicutes.

Cepas de referência e 30 estirpes de Ureaplasma diversum isoladas do muco vaginal de bovinos apresentando ou não distúrbios reprodutivos, de quatro diferentes propriedades, foram comparadas por meio da metodologia da SE-AFLP (single-enzyme amplified fragment length polymorphism). Foram obtidos 28 perfis, com ausência de fragmentos monomórficos. No dendrograma, as amostras foram divididas em grupos A e B. O grupo A foi subdividido em A1 e A2 e o A1 dividiu-se em A1a e A1b. As amostras de referência formaram o grupo B. Não houve diferenciação entre as estirpes isoladas de animais doentes ou sadios. Evidenciou-se grande heterogeneidade entre os ureaplasmas estudados indicando baixa estabilidade genômica, como detectado em outras espécies dos microrganismos da classe Mollicutes.

Determinação da concentração inibitória mínima de antibióticos contra ureaplasmas isolados de bovinos pela inibição de crescimento e citometria de fluxo / Determination of minimum inhibitory concentration of ureaplasmas isolated from cattle by inhibition of growth and flow citometry

Os Mollicutes causam doenças em várias espécies animais de importância econômica, inclusive em bovinos. Neste estudo, foi avaliada por concentração inibitória mínima (CIM) e citometria de fluxo, a atividade de oito agentes antibacterianos (enrofloxacina, ciprofloxacina, gentamicina, claritromicina, cloranfenicol, oxitetraclina, tiamulina e tilosina) contra Ureaplasma diversum. Foram analisadas 24 amostras de isolados de campo oriundas da mucosa genital de fêmeas bovinas. As amostras foram confirmadas por crescimento em caldo, placa e por PCR. Os inóculos foram submetidos à analise de suscetibilidade aos antibióticos pelo método da microdiluição em microplaca e posteriormente analisados pelo citômetro de fluxo a fim de avaliar a atividade antimicrobiana nas células. A claritromicina apresentou os maiores índices de inibição in vitro, sendo a gentamicina considerada o antibiótico de menor espectro de ação nesse estudo. De acordo com as análises do citômetro, a gentamicina apresentou o menor número de células viáveis enquanto a tiamulina apresentou o maior número. Embora haja resultados destoantes entre as técnicas utilizadas, o citômetro de fluxo pode ser utilizado como uma boa ferramenta para auxiliar a avaliação da suscetibilidade desses microrganismos a antibióticos.

The Mollicutes cause disease in several economically important species, including cattle. In this study, was evaluated by minimum inhibitory concentration (MIC) and flow cytometry, the activity of eight antibacterial agents (enrofloxacin, ciprofloxacin, gentamicin, clarithromycin, chloramphenicol, oxitetraclina, tiamulin and tylosin) against Ureaplasma diversum. We analyzed 24 samples of field isolates originating from the genital mucosa of cows. The samples were confirmed by growth in broth, plate, and PCR. The inoculations were subjected to analysis of susceptibility to antibiotics by the method of micro-dilution plate and then analyzed by flow cytometry to assess the antimicrobial activity in cells. Clarithromycin showed the highest levels of inhibition in vitro, the antibiotic gentamicin considered lower spectrum of action in this study. According to the analysis of the flow cytometer, gentamicin showed the lowest number of viable cells as tiamulin showed the greatest number. Although there are divergent results between the techniques used, flow cytometry can be used as a good tool even help assess the susceptibility of microorganisms to antibiotics.

Determinação da concentração inibitória mínima de antibióticos contra ureaplasmas isolados de bovinos pela inibição de crescimento e citometria de fluxo / Determination of minimum inhibitory concentration of ureaplasmas isolated from cattle by inhibition of growth and flow citometry

Os Mollicutes causam doenças em várias espécies animais de importância econômica, inclusive em bovinos. Neste estudo, foi avaliada por concentração inibitória mínima (CIM) e citometria de fluxo, a atividade de oito agentes antibacterianos (enrofloxacina, ciprofloxacina, gentamicina, claritromicina, cloranfenicol, oxitetraclina, tiamulina e tilosina) contra Ureaplasma diversum. Foram analisadas 24 amostras de isolados de campo oriundas da mucosa genital de fêmeas bovinas. As amostras foram confirmadas por crescimento em caldo, placa e por PCR. Os inóculos foram submetidos à analise de suscetibilidade aos antibióticos pelo método da microdiluição em microplaca e posteriormente analisados pelo citômetro de fluxo a fim de avaliar a atividade antimicrobiana nas células. A claritromicina apresentou os maiores índices de inibição in vitro, sendo a gentamicina considerada o antibiótico de menor espectro de ação nesse estudo. De acordo com as análises do citômetro, a gentamicina apresentou o menor número de células viáveis enquanto a tiamulina apresentou o maior número. Embora haja resultados destoantes entre as técnicas utilizadas, o citômetro de fluxo pode ser utilizado como uma boa ferramenta para auxiliar a avaliação da suscetibilidade desses microrganismos a antibióticos. (AU)

The Mollicutes cause disease in several economically important species, including cattle. In this study, was evaluated by minimum inhibitory concentration (MIC) and flow cytometry, the activity of eight antibacterial agents (enrofloxacin, ciprofloxacin, gentamicin, clarithromycin, chloramphenicol, oxitetraclina, tiamulin and tylosin) against Ureaplasma diversum. We analyzed 24 samples of field isolates originating from the genital mucosa of cows. The samples were confirmed by growth in broth, plate, and PCR. The inoculations were subjected to analysis of susceptibility to antibiotics by the method of micro-dilution plate and then analyzed by flow cytometry to assess the antimicrobial activity in cells. Clarithromycin showed the highest levels of inhibition in vitro, the antibiotic gentamicin considered lower spectrum of action in this study. According to the analysis of the flow cytometer, gentamicin showed the lowest number of viable cells as tiamulin showed the greatest number. Although there are divergent results between the techniques used, flow cytometry can be used as a good tool even help assess the susceptibility of microorganisms to antibiotics. (AU)

Estudo comparativo entre técnicas de isolamento e pcr para detecção de mycoplasma e ureaplasma diversum em muco prepucial e sêmen in natura de touros de monta natural e central de inseminação artificial

ABSTRACT With the objective of improving the diagnostic methods in mycoplasmosis, a study was carried out using bovine prepucial mucus and fresh semen from natural breeding and one Artificial Insemination Center with the aim to reduce the time necessary for the emission of results and to increase the detection levels, assuming bacterial isolation, on technique that depends on microbial viability, as the gold standard test. One hundred and seventy-five prepucial mucus samples and 143 fresh semen samples were studied. By PCR (Polymerase Chain Reaction) technique, a previous screening using the MGSP/GPO-1 system was tested for Mollicutes detection. Species-specific primers for Mycoplasma bovigenitalium and Ureaplasma diversumwere used subsequently. By isolation there were observed 45.1% (79/175) of positivity for Mollicutes and 66.5% (115/173) for U. diversum in prepucial mucus. Comparatively, PCR revealed 63.7% (109/171) of positive samples by MGSP/GPO-1, 42.6% (72/169) of positive samples for M. bovigenitalium and 72.9% (124/170) for U. diversum. The semen samples study presented 22.5% (32/142) of positivity for Mollicutes and 51.7% (74/143) for U. diversum, by isolation. By PCR, 24.1% of positive samples were detected (33/137) using the MGSP/GPO-1 system, 27.4% (34/124) of positive samples for M. bovigenitalium and 56.6% (73/129) for U. diversum. The McNemar test for the Mollicutes presence in prepucial mucus (p = 0.57) showed that theMGSP/GPO-1 system can have a considerable value when associated with specific detection of U. diversum, showing good sensitivity (75.2%), however lower specificity (58.9%). The statistical analysis showed that the screening by MGSP/GPO-1 system could substitute the preliminary isolation of Mycoplasma spp. in semen samples (p = 0.86).

RESUMO Com o objetivo de aprimorar os métodos diagnósticos em micoplasmoses foi realizado um estudo utilizando-se muco prepucial e sêmen innatura de touros de monta natural e de uma central de inseminação artificial com o objetivo de reduzir o tempo necessário para a emissão de resultados e aumentar os níveis de detecção, assumindo o isolamento bacteriano, técnica dependente da viabilidade microbiana, como teste gold standard. Cento e setenta e cinco amostras de muco prepucial e 143 amostras de sêmen fresco foram estudadas. Através da técnica de PCR (Reação da Polimerase em Cadeia), uma triagem prévia das amostras foi realizada para detecção de Mollicutes, utilizando-se o sistema MGSP/GPO-1. Primers espécie-específicos para Mycoplasma bovigenitalium e Ureaplasma diversum foram posteriormente utilizados. Ao isolamento, foram observados 45,1% (79/175) de positivos para Mollicutes e 66,5% (115/173) para U. diversum em muco de prepucial. Comparativamente, a PCR revelou 63,7% (109/171) de amostras positivas através de sistema de MGSP/GPO-1, 42,6% (72/169) de amostras positivas para M. bovigenitalium e 72,9% (124/170) para U. diversum. O estudo das amostras de sêmen apresentou 22,5% (32/142) de positivos para Mollicutes e 51,7% (74/143) para U. diversum, através do isolamento. Pela PCR, foram detectadas 24,1% (33/137) de amostras positivas no sistema MGSP/GPO-1, 27,4% (34/124) de amostras positivas para M. bovigenitalium e 56,6% (73/129) para U. diversum. O teste de McNemar para presença de Mollicutes em muco de prepucial (p = 0,57), mostrou que o sistema MGSP/GPO-1 pode ter um valor considerável quando associado à detecção específica de U. diversum, apresentando uma boa sensibilidade (75,2%), porém baixa especificidade (58,9%). A análise estatística mostrou que o sistema MGSP/GPO-1 de triagem poderia substituir o isolamento preliminar para Mycoplasma spp. em amostras de sêmen (p = 0,86).

Isolamento de ureaplasma e micoplasma do trato reprodutivo de ovinos e caprinos e tipificação genotípica por meio da PFGE e seqüenciamento do gene 16S rRNA / Isolation of ureaplasma and mycoplasma from reproductive tract of sheep and goats and genotypic typification by PFGE and 16S rRNA gene sequencing

Micoplasmas e ureaplasmas têm sido isolados de pequenos ruminantes, mas existem poucos estudos. O Mycoplasma ovine/caprine sorotipo 11, conhecido como cepa 2D, ainda não classificado como espécie, vem sendo relacionado a casos de vulvovaginite e problemas reprodutivos em ovinos e caprinos. Os ureaplasmas apresentam a habilidade em induzirem doenças no trato genital, confirmada por inoculações experimentais de isolados obtidos de animais doentes em animais saudáveis, resultando em moderada granularidade e hiperemia na vulva. Estes ureaplasmas não receberam ainda a designação de espécie, sendo apenas conhecidas suas características sorológicas, nas quais é fundamentada a classificação em nove sorotipos, sendo o IX relacionado a infertilidade e aborto em ovelhas. Este trabalho teve como objetivo o isolamento de micoplasmas e ureaplasmas do trato reprodutivo de fêmeas e machos das espécies caprina e ovina e tipificação genotípica dos isolados por meio de PFGE e sequenciamento do gene 16S rRNA. Foram obtidos 20 isolamentos de ureaplasma no trato reprodutivo de fêmeas e machos da espécie ovina, um isolamento de micoplasma e sete com crescimento misto de micoplasma e ureaplasma. Nas fêmeas da espécie caprina foram obtidos cinco isolamentos, sendo quatro de ureaplasma e um de micoplasma. Dos isolados submetidos a PFGE , 11 de origem ovina resultaram em oito diferentes perfis confirmando a capacidade da técnica em tipificar ureaplasma de origem ovina. O sequenciamento do gene 16S rRNA, analisado pelo UPGMA, permitiu agrupar seis isolados ao Ureaplasma diversum ATCC 49782, e quatro não foram agrupados com nenhuma outra espécies de ureaplasma, quando utilizado o ponto de corte 97%. Em nosso estudo, os isolados de ovino e caprino agrupados às referências de U. diversum não permite concluir que sejam da mesma espécie. A utilização do gene 16S rRNA gera grande quantidade de informações úteis para inferências filogenéticas e pode ser a primeira escolha na investigação de novas espécies. Técnicas filogenéticas como sequenciamento do espaço intergênico 16S-23S rRNA, e gene da urease podem auxiliaram futuramente na classificação dos isolados obtidos de ovino e caprino

Mycoplasmas and or ureaplasmas have been isolated from small ruminants but are few studied. Mycoplasma ovine/caprine serotype 11, known as 2D strain, has not been classified yet as specie. However, it has been associated to vulvovaginitis and reproductive disorder in caprine and ovine. Ureaplasmas may cause genital tract diseases. Experimental infections with isolates recovered from sick animals resulted in granularity and hyperemia of the vulva. These have not been designated as specie but are divide in nine serological characteristics types. The serotype IX is associated to infertility and abortion in sheep. The present study aims the isolation of mycoplasmas and ureaplasmas from reproductive tract of ovine and caprine, genotyping of isolates by PFGE, and sequencing of their 16S rRNA. Ureaplasma isolates were recovered from the reproductive tract of 20 ovine, being them, male and female. Mycoplasma was isolated alone in one sample. A mixture of mycoplasma and ureaplasma was obtained in seven samples. On the material obtained from female caprine, five isolations were performed. Four of them were ureaplasma and one was a mycoplasma. Eleven isolates from ovine showed eight distinct profiles at PFGE, confirm that the method can typify ovine origin ureaplasmas. Six isolates were grouped to the Ureaplasma diversum ATCC 49782, through the sequencing of their 16S rRNA using the UPGMA. However, when using a 97% cutoff, four isolates could not be grouped to none of the ureaplasma specie. The isolates from ovine and caprine grouped to U. diversum, do not allow conclude that they are all the same specie. The use of 16S rRNA sequencing showed many useful information to phylogenetic inference, and can be the first choice for when investigating new species. Phylogenetic techniques, as sequencing of the intergenic space 16S-23S rRNA and urease gene, can be used to help the classification of new ureaplasma isolates from ovine and caprine

Avaliação clínica e estudo da ocorrência de fêmeas ovinas infectadas por micoplasmas na região de Piedade - SP - \"Avaliação da infecção sobre a produtividade do rebanho\" / Clinical avaliation and ocurrence studies of mycoplasmas infected ovine female in the Piedade region - State of São Paulo- \"Avaliation of the infection in the productivity of the herd\"

Com a crescente demanda por produtos ovinos, tem crescido o número de empresários dispostos a investir nessas atividades. Estudos sobre a importância das micoplasmoses e suas diferentes espécies já conhecidas ainda devem ser realizadas no Brasil. Foram estudadas 60 fêmeas da espécie ovina. O material clínico selecionado para analisar foi muco vulvovaginal obtido através de colheita por zaragatoa. Foi obtido o isolamento através de cultivo e a detecção pela técnica de reação em cadeia da polimerase de Mycoplasma spp., Ureaplasma spp. e Acholeplasma laidlawii em fêmeas de ovinos pela primeira vez no Brasil na região vulvovaginal. A porcentagem de micoplasma genérico detectada nas amostras foi de 75%, de Ureaplasma spp. foi de 66,7% e de Acholeplasma laidwaii foi de 1,7%. Houve isolamento em placa de 11,7% de Ureaplasma spp. do total de amostras processadas e de Micoplasma spp. em 8,3%. Não foi possível a identificação da espécie envolvida. Não houve associação da presença de micoplasmas com alterações no trato reprodutivo de fêmeas ovinas. Foi comprovada a infecção de uma fêmea ovina através de monta natural por um macho infectado, provando que uma das principais fontes de infecção dos animais é através do coito

Sheep industry is growing rapidly in Brazil. However many diseases are the principal bottleneck to the increasing these activities. Among the reproductive diseases the vulvo-vaginites caused by Mycoplasma play an important role. Although no studies has been carried out in brazilian sheep herd so far. For that 60 ewes were ramdomly from different flocks selected at the county of Piedade state of São Paulo, Brazil. The mucus from vulvovagina was obtained by swab for isolation and detectetion of Mycoplasma spp., Ureaplasma spp. and Acholeplasma laidlawii. Generic Mycoplasma was detected in 75% of the samples, Ureaplasma spp. in 66,7% and Acholeplasma laidwaii in 1,7%. Mycoplasma spp. was isolated 8,3% and Ureaplasma spp. in 11,7%. It was not possible the identification of the species found. There was no association of mycoplasmas in the muco on the presence of reproductive problems in the herds. At least in one case, ram with presence of Mycoplasma in the semen infected a negative ewe, suggesting the importance of the ram in spreading the bacteria in the heard