Comparative study of RFLP-IS6110 and MIRU-VNTR from Mycobacterium tuberculosis isolated in the state of Minas Gerais, Brazil

DNA genotyping of Mycobacterium tuberculosis has been widely applied in the understanding of disease transmission in many countries. The purpose of this study was to genotype the strains of M. tuberculosis isolated in patients with new tuberculosis (TB) cases in Minas Gerais, as well as to compare the similarity, discriminatory power, and agreement of the clusters between the IS6110 Restriction Fragment Length Polymorfism (RFLP) and 12 loci Variable Number Tandem Repeat - Mycobacterial Interspersed Repetitive Units (MIRU-VNTR) techniques. It was observed that 32% (66/204) of the isolated strains in the RFLP-IS6110 and 50.9% (104/204) of the isolated strains in the MIRU-VNTR presented a similarity of equal to or above 85%. The RFLP-IS6110 and MIRU-VNTR proved to contain a high discriminatory power. The similarity index resulting from the RFLP showed no recent transmission. Good agreement was observed between the techniques when clusters were detected; however, the best epidemiological relationship was found when using the RFLP-IS6110.(AU)

Genetic profiles of Mycobacterium bovis from a cattle herd in southernmost Brazil / Perfis genéticos de Mycobacterium bovis em um rebanho bovino no extremo sul do Brasil

Mycobacterium bovis is the agent of bovine tuberculosis, a disease endemic to all Brazilian states. Molecular typing techniques help to stratify and refine data, providing information that facilitates epidemiological research. In this study, MIRU-VNTR, targeting 24 loci, was employed to identify and characterize the genetic groups of M. bovis isolates obtained from an outbreak of bovine tuberculosis. Eighteen acid-fast bacilli isolates, obtained from bovine tissue samples, and reactive to the comparative cervical tuberculin test, were identified as species of the M. tuberculosis complex, and were genotyped by MIRU-VNTR with 24 primer pairs. Genotyping revealed three genetic profiles comprising one with 15 isolates (83.3%), one with two isolates (11.1%), and one profile with one unique isolate (5.6%). This distinction was achieved with the MIRU 31 primer, which resulted in clustering of two isolates into the same profile, and ETR A, B, and C, which discriminated the isolate with a unique profile. The occurrence of clustered isolates is indicative of recent transmission, whereas isolates with a unique profile suggest reactivation of latent infection. The presence of different M. bovis genotypes in the same herd suggests movement of infected animals or different sources of intra-herd infection. Use of the MIRU-VNTR molecular epidemiology technique in M. bovis isolates obtained from an outbreak of bovine tuberculosis in Rio Grande do Sul state demonstrated the genetic diversity of circulating strains, despite the presence of a predominant group.

Mycobacterium bovis é o agente da tuberculose bovina, enfermidade endêmica diagnosticada em todos os estados brasileiros. As técnicas de tipagem molecular auxiliam a estratificar e refinar dados, fornecendo informações que facilitam as atividades epidemiológicas. Neste estudo aplicou-se a técnica MIRU-VNTR com 24 loci para caracterizar e identificar os agrupamentos genéticos de isolados de M. bovis oriundos de um foco de tuberculose bovina. Dezoito isolados de bacilos álcool-ácido resistentes, obtidos de amostras de tecido de bovinos reagentes ao teste cervical comparativo e identificados como espécies do complexo M. tuberculosis, foram genotipados por meio de MIRU-VNTR com 24 pares de iniciadores. A genotipagem revelou três perfis genéticos distintos: um para 15 isolados (83,3%); um para dois isolados (11,1%) e, por fim, um isolado com perfil único (5,6%). Os iniciadores responsáveis por essa distinção foram MIRU 31, que agrupou dois isolados em um perfil, e ETR A, B e C, que discriminaram o isolado de perfil único. A ocorrência de agrupamentos de isolados é indicativa de transmissão recente, ao passo que isolados de perfil único sugerem reativação de infecção latente. A presença de diferentes genótipos de M. bovis no mesmo rebanho sugere haver circulação de animais doentes ou existirem diferentes fontes de infecção intrarrebanho. A aplicação da técnica de epidemiologia molecular MIRU-VNTR a isolados de M. bovis obtidos a partir de um foco de tuberculose bovina no Rio Grande do Sul demonstrou haver diversidade genética entre as estirpes em circulação, embora exista um agrupamento predominante.

Genetic profiles of Mycobacterium bovis from a cattle herd in southernmost Brazil / Perfis genéticos de Mycobacterium bovis em um rebanho bovino no extremo sul do Brasil

Mycobacterium bovis is the agent of bovine tuberculosis, a disease endemic to all Brazilian states. Molecular typing techniques help to stratify and refine data, providing information that facilitates epidemiological research. In this study, MIRU-VNTR, targeting 24 loci, was employed to identify and characterize the genetic groups of M. bovis isolates obtained from an outbreak of bovine tuberculosis. Eighteen acid-fast bacilli isolates, obtained from bovine tissue samples, and reactive to the comparative cervical tuberculin test, were identified as species of the M. tuberculosis complex, and were genotyped by MIRU-VNTR with 24 primer pairs. Genotyping revealed three genetic profiles comprising one with 15 isolates (83.3%), one with two isolates (11.1%), and one profile with one unique isolate (5.6%). This distinction was achieved with the MIRU 31 primer, which resulted in clustering of two isolates into the same profile, and ETR A, B, and C, which discriminated the isolate with a unique profile. The occurrence of clustered isolates is indicative of recent transmission, whereas isolates with a unique profile suggest reactivation of latent infection. The presence of different M. bovis genotypes in the same herd suggests movement of infected animals or different sources of intra-herd infection. Use of the MIRU-VNTR molecular epidemiology technique in M. bovis isolates obtained from an outbreak of bovine tuberculosis in Rio Grande do Sul state demonstrated the genetic diversity of circulating strains, despite the presence of a predominant group.(AU)

Mycobacterium bovis é o agente da tuberculose bovina, enfermidade endêmica diagnosticada em todos os estados brasileiros. As técnicas de tipagem molecular auxiliam a estratificar e refinar dados, fornecendo informações que facilitam as atividades epidemiológicas. Neste estudo aplicou-se a técnica MIRU-VNTR com 24 loci para caracterizar e identificar os agrupamentos genéticos de isolados de M. bovis oriundos de um foco de tuberculose bovina. Dezoito isolados de bacilos álcool-ácido resistentes, obtidos de amostras de tecido de bovinos reagentes ao teste cervical comparativo e identificados como espécies do complexo M. tuberculosis, foram genotipados por meio de MIRU-VNTR com 24 pares de iniciadores. A genotipagem revelou três perfis genéticos distintos: um para 15 isolados (83,3%); um para dois isolados (11,1%) e, por fim, um isolado com perfil único (5,6%). Os iniciadores responsáveis por essa distinção foram MIRU 31, que agrupou dois isolados em um perfil, e ETR A, B e C, que discriminaram o isolado de perfil único. A ocorrência de agrupamentos de isolados é indicativa de transmissão recente, ao passo que isolados de perfil único sugerem reativação de infecção latente. A presença de diferentes genótipos de M. bovis no mesmo rebanho sugere haver circulação de animais doentes ou existirem diferentes fontes de infecção intrarrebanho. A aplicação da técnica de epidemiologia molecular MIRU-VNTR a isolados de M. bovis obtidos a partir de um foco de tuberculose bovina no Rio Grande do Sul demonstrou haver diversidade genética entre as estirpes em circulação, embora exista um agrupamento predominante.(AU)

Association of number of tandem repeats in two important adhesins in Mycoplasma hyopneumoniae / Associação entre os números de repetições em tandem em duas importantes adesinas de Mycoplasma hyopneumoniae

Diversidade genética de Mycoplasma hyopneumoniae tem sido relatada em análise múltipla de repetições em tandem em número variável (MLVA). O objetivo deste estudo foi descrever a distribuição espacial e a heterogeneidade genética de tipos de M. hyopneumoniae no Brasil, bem como investigar a correlação entre regiões de repetição 1 (RR1) e 3 (RR3) de duas adesinas importantes (P97 e P146). Foram identificados 39 tipos de MLVA baseados no número de repetições em tandem em P97 RR1 e RR3 P146. A correlação negativa significativa (Spearman's rho = -0,26; P = 0,022) entre P97 RR1 e RR3 P146 foi observada, o que sugere um possível mecanismo compensatório que permitiria a bactéria manter a sua capacidade de adesão. Os resultados contribuem para compreender a epidemiologia das M. hyopneumoniae no quarto maior país produtor de suínos do mundo.(AU)

Association of number of tandem repeats in two important adhesins in Mycoplasma hyopneumoniae / Associação entre os números de repetições em tandem em duas importantes adesinas de Mycoplasma hyopneumoniae

Diversidade genética de Mycoplasma hyopneumoniae tem sido relatada em análise múltipla de repetições em tandem em número variável (MLVA). O objetivo deste estudo foi descrever a distribuição espacial e a heterogeneidade genética de tipos de M. hyopneumoniae no Brasil, bem como investigar a correlação entre regiões de repetição 1 (RR1) e 3 (RR3) de duas adesinas importantes (P97 e P146). Foram identificados 39 tipos de MLVA baseados no número de repetições em tandem em P97 RR1 e RR3 P146. A correlação negativa significativa (Spearman's rho = -0,26; P = 0,022) entre P97 RR1 e RR3 P146 foi observada, o que sugere um possível mecanismo compensatório que permitiria a bactéria manter a sua capacidade de adesão. Os resultados contribuem para compreender a epidemiologia das M. hyopneumoniae no quarto maior país produtor de suínos do mundo.(AU)

DDRT-PCR approaches applied for preeminent results in the isolation of DETs from fish brain tissues / Aplicação de abordagens de DDRT-PCR para aprimoramento de resultados no isolamento de DETs a partir de tecido cerebral de peixes

Differential Display (DD) is a technique widely used in studies of differential expression. Most of these analyses, especially those involving fish species, are restricted to species from North America and Europe or to commercial species, as salmonids. Studies related to South American fish species are underexplored. Thus, the present work aimed to describe DD technique modifications in order to improve outcomes related to the isolation of DETs (Differentially Expressed Transcripts), using Leporinus macrocephalus, a large commercially exploited South American species, as a fish design. Different DDRT-PCR approaches were applied to brain samples and the products of the reactions were analyzed on 6% polyacrylamide gels stained with 0.17% Silver Nitrate (AgNO3). The use of PCR reactions under high stringency conditions and longer oligonucleotides based on VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) core sequences led to better results when compared to low stringency PCR conditions and the use of decamer oligonucleotides. The improved approach led to the isolation of differentially expressed transcripts on adult males and females of L. macrocephalus. This study indicates that some modifications on the DDRT-PCR method can ensure isolation of DETs from different fish tissues and the development of robust data related to this approach.(AU)

Display Diferencial (DD) é uma técnica amplamente utilizada em estudos de expressão diferencial. A maioria desses estudos envolvendo espécies de peixes está restrita a espécies da América do Norte e Europa ou a espécies comerciais, como os salmoniformes. Estudos relacionados a peixes da América do Sul são ainda pouco explorados. Desse modo, o presente trabalho teve como objetivo descrever modificações na técnica de DD, a fim de melhorar os resultados relacionados ao isolamento de DETs (Transcritos Diferencialmente Expressos), utilizando Leporinus macrocephalus, peixe explorado comercialmente na América do Sul, como espécie para tal delineamento. Diferentes abordagens de DDRT-PCR foram desenvolvidas a partir de amostras de tecido cerebral e os produtos das reações foram analisados em gel de poliacrilamida 6% corados com 0,17% de nitrato de Prata (AgNO3). A utilização de reações de PCR sob condições de elevada estringência e oligonucleotídeos mais longos, com base em sequências cerne de VNTR (Número Variável de Repetições em Tandem), mostrou melhores resultados quando comparada a condições de baixa estringência e ao uso de oligonucleotídeos decâmeros. A estratégia empregada permitiu o isolamento de transcritos diferencialmente expressos em machos e fêmeas adultos de L. macrocephalus. Este estudo evidencia que modificações no método de DDRT-PCR garantem o melhor isolamento de DETs a partir de diferentes tecidos de peixes e asseguram a obtenção de dados mais sólidos relacionados a essa abordagem.(AU)

Molecular typing of Argentinian Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis isolates by multiple-locus variable number-tandem repeat analysis

Multiple-locus variable number-tandem repeat analysis (MLVA) of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) isolates may contribute to the knowledge of strain diversity in Argentina. Although the diversity of MAP has been previously investigated in Argentina using IS900-RFLP, a small number of isolates were employed, and a low discriminative power was reached. The aim of the present study was to test the genetic diversity among MAP isolates using an MLVA approach based on 8 repetitive loci. We studied 97 isolates from cattle, goat and sheep and could describe 7 different patterns: INMV1, INMV2, INMV11, INMV13, INMV16, INMV33 and one incomplete pattern. INMV1 and INMV2 were the most frequent patterns, grouping 76.3% of the isolates. We were also able to demonstrate the coexistence of genotypes in herds and co-infection at the organism level. This study shows that all the patterns described are common to those described in Europe, suggesting an epidemiological link between the continents.(AU)

Detection, quantification and genetic variability of Mycoplasma hyopneumoniae from apparently healthy and pneumonic swine / Detecção, quantificação e variabilidade genética de Mycoplasma hyopneumoniae a partir de suínos pneumônicos e aparentemente saudáveis

Molecular differences among Mycoplasma hyopneumoniae strains present in pneumonic lungs of swine have been largely studied. However, no comparative studies concerning the strains present in apparently healthy pigs have been carried out. This study aimed to detect, quantify and perform molecular analysis of M. hyopneumoniae strains in pig lungs with and without pneumonic lesions. The detection of M. hyopneumoniae was performed using multiplex PCR (YAMAGUTI, 2008), real-time PCR (STRAIT et al., 2008) and multiple VNTR amplification (VRANCKX et al., 2011). Molecular characterization of the strains was achieved by analysis of the VNTR copy number in P97R1, P146R3, H2R1 and H4. M. hyopneumoniae was detected in samples from healthy and pneumonic pigs and the amount of M. hyopneumoniae positive samples detected varied with the type of assay. The greater number of positive samples was identified by the multiple VNTR amplification combined with capillary electrophoresis. Using real-time PCR, 4.9*104 M. hyopneumoniae genome copies/mL was detected in apparently healthy lungs. A mean quantity of 3.9*106 M. hyopneumoniae genome copies/mL was detected in pneumonic lungs. The analysis of VNTR copy number demonstrated a high genetic variability of the M. hyopneumoniae strains present in apparently healthy and pneumonic lungs. Strains having 3 VNTR copy number in P97R1, were detected only in pneumonic lungs and strains having 40 and 43 VNTR copy number in P146R3 were detected only in apparently healthy lungs. Despite the genetic variability of M. hyopneumoniae, predominant strains in the swine farms could be identified(AU)

As diferenças moleculares entre as estirpes de Mycoplasma hyopneumoniae presentes em pulmões de suínos com pneumonia tem sido estudadas. Porém, estudos comparativos relativos as estirpes presentes nos suínos aparentemente saudáveis não foram levados a cabo. O objetivo do estudo foi a detecção, quantificação e analise molecular de M. hyopneumoniae nos pulmões suínos com e sem lesões pneumônicas. Para a detecção de M. hyopneumoniae usaramse o PCR Multiplo (YAMAGUTI, 2008), o PCR a Tempo Real (STRAIT et al., 2008) e a amplificação de múltiplo VNTR (VRANCKX et al., 2011). A caracterização molecular das estirpes foi realizada mediante a análise do número de copias de VNTR em P97R1, P146R3, H2R1 e H4. O M. hyopneumoniae foi detectado em amostras de suínos saudáveis e pneumônicos e a quantidade de M. hyopneumoniae nas amostras positivas variou com o tipo de ensaio. O maior número de amostras positivas foi identificado pela amplificação de múltiplas VNTR combinado com a eletroforese de capilares. Usando o PCR a Tempo Real, 4.9*104 copias de genoma/mL de M. hyopneumoniae foram detectadas em pulmões aparentemente saudáveis. Uma quantidade média de 3.9*106 copias de genoma/mL de M. hyopneumoniae foi detectada em pulmões pneumônicos. A análise do número de copias de VNTR demonstrou uma elevada variabilidade(AU)

Diversidade genética de isolados de Mycobacterium bovis em rebanhos bovinos de diferentes localidades do Brasil

A tuberculose bovina é uma doença causada pelo Mycobacterium bovis que afeta, principalmente, bovinos e búfalos. Para compreender melhor a distribuição da tuberculose bovina no país o presente trabalho teve como objetivo proceder a caracterização molecular de isolados de M. bovis de diferentes regiões do Brasil. No total 289 isolados provenientes de 11 estados brasileiros foram genotipados pelas técnicas de Spoligotyping e VNTR-MIRU com 24 marcadores diferentes, sendo o primeiro estudo com isolados de diferentes regiões do Brasil caracterizados por meio dessas técnicas. Foram identificados 42 espoligotipos e os perfis SB0121, SB0295, SB1380, SB0140 e SB1050 foram os mais frequentes, além disso três novos espoligotipos foram descritos. Por meio da técnica de VNTR-MIRU 173 perfis distintos foram caracterizados, mostrando alta diversidade desse agente no Brasil. Os marcadores com maior diversidade alélica foram: ETR-A, QUB11b, MIRU 16, MIRU 27, ETR-B, ETR-C, Mtub21 e QUB 26, sugerindo esse conjunto de marcadores capaz de caracterizar os isolados de M. bovis no Brasil.

Bovine tuberculosis is a disease caused by Mycobacterium bovis that mainly affects cattle and buffalo. To better understand the distribution of bovine tuberculosis in the country, the present work aimed to characterize the molecular isolates of M. bovis from different regions of Brazil. In total, 289 isolates from 11 Brazilian states were genotyped by the Spoligotyping and VNTR-MIRU with 24 different markers, being the first study with isolates from different regions of Brazil characterized by these techniques. Forty-two spoligotypes were identified and the profiles SB0121, SB0295, SB1380, SB0140 and SB1050 were the most frequent, in addition three new spoligotypes were described. Through the VNTR-MIRU technique 173 distinct profiles were characterized, showing high diversity of this agent in Brazil. The markers with the highest allelic diversity were: ETR-A, QUB11b, MIRU 16, MIRU 27, ETR-B, ETR-C, Mtub21 and QUB 26, suggesting this set of markers capable of characterizing M. bovis isolates in Brazil.

Caracterização genética de isolados de Mycobacterium bovis no Estado de Mato Grosso, Brasil

Técnicas de genotipificação do Mycobacterium bovis baseadas na amplificação do DNA via PCR como MIRU-VNTR constituem importantes ferramentas na investigação epidemiológica da tuberculose bovina (TB) em áreas de baixa prevalência, como no Estado de Mato Grosso. Isto posto e diante de limitadas informações a respeito dos genótipos grassantes no Estado, foi realizado monitoramento nas linhas de inspeção sanitária pós-abate em 35 matadouros-frigoríficos sob inspeção oficial para detectar lesões granulomatosas sugestivas de TB e proceder a coleta e análise de amostras. Foram processadas e analisadas 167 amostras mediante isolamento bacteriano e técnicas moleculares. Através do método de genotipagem MIRU-VNTR, 49 isolados de M. bovis foram analisados aplicando-se 24 pares de primers diferentes. Desses, 20 marcadores de VNTR mostraram polimorfismo genético. O locus QUB26 apresentou alto poder discriminatório (h=0,66) enquanto ETRC (0,54), Mtub21 (0,5), QUB11b (0,33) e Mtub34 (0,31) mostraram moderada diversidade alélica. Os outros 15 loci (Mtub 04, 29 e 39; MIRU 04, 16, 23, 24, 26, 27, 31, 39 e 40; ETR A; ETR B; QUB 4156) revelaram baixo poder discriminatório (h=0,02 - 0,27). Quatro loci (MIRU 2, 10 e 20; Mtub30) não apresentaram diversidade alélica. Foram observados 28 perfis genéticos (V1-V28) nos isolados de M. bovis obtidos em 35 propriedades rurais. Dentre essas, 30 (85,71%) apresentaram somente 1 tipo de perfil genético. Apenas 19 amostras (38,77%) apresentaram perfil MIRU-VNTR único revelando a existência de isolados com o mesmo perfil MIRU-VNTR entre diferentes regiões geográficas no Estado. O isolamento, seguido da identificação molecular e discriminação genotípica por MIRU-VNTR em isolados de M. bovis constituíram fontes de relevantes informações auxiliares no desenvolvimento de estratégias de erradicação da TB na região de estudo.

Mycobacterium bovis genotyping techniques based on PCR amplification as MIRU-VNTR are important tools in the epidemiological investigation of bovine tuberculosis in areas of low prevalence, such as in the state of Mato Grosso. Based on limited information about the genotypes in state, post-slaughter sanitary inspection lines were monitored in 35 slaughterhouses under official inspection to detect granulomatous lesions suggestive of TB and to collect and analyze samples. 167 Samples were processed and analyzed by bacterial isolation and molecular techniques. Through the MIRU-VNTR genotyping method, 49 M. bovis isolates were analyzed by applying 24 different primer pairs. Of these, 20 VNTR markers showed genetic polymorphism. The QUB26 locus presented high discriminatory power (h = 0.66) while ETRC (0.54), Mtub21 (0.5), QUB11b (0.33) and Mtub34 (0.31) showed moderate allelic diversity. The other 15 loci (Mtub 04, 29 e 39; MIRU 04, 16, 23, 24, 26, 27, 31, 39 e 40; ETR A; ETR B; QUB 4156) showed low discriminatory power (h = 0.02 - 0.27). Four loci (MIRU2, MIRU10, MIRU20 and Mtub30) did not present allelic diversity. Twenty-eight genotypes (V1-V28) were observed in the M. bovis isolates obtained from 35 rural properties. Among these, 30 (85.71%) presented only 1 genotype type. Only 19 samples (38.77%) presented a single MIRU-VNTR profile revealing the existence of isolates with the same MIRU-VNTR profile among different geographic regions in the State. Isolation, followed by molecular identification and genotypic discrimination by MIRU-VNTR in M. bovis isolates were sources of relevant auxiliary information in the development of strategies to eradicate TB in the study region

Characterization of a virulent Leptospira interrogans strain isolated from an abandoned swimming pool

Pathogenic Leptospira spp. are the etiological agents of leptospirosis, an important disease of both humans and animals. In urban settings, L. interrogans serovars are the predominant cause of disease in humans. The purpose of this study was to characterize a novel Leptospira isolate recovered from an abandoned swimming pool. Molecular characterization through sequencing of the rpoB gene revealed 100% identity with L. interrogans and variable-number tandem-repeat (VNTR) analysis resulted in a banding pattern identical to L. interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae, serovar Copenhageni or Icterohaemorrhagiae. The virulence of the strain was determined in a hamster model of lethal leptospirosis. The lethal dose 50% (LD50) was calculated to be two leptospires in female hamsters and a histopathological examination of infected animals found typical lesions associated with severe leptospirosis, including renal epithelium degeneration, hepatic karyomegaly, liver-plate disarray and lymphocyte infiltration. This highly virulent strain is now available for use in further studies, especially evaluation of vaccine candidates.(AU)

Mycobacterium tuberculosis belonging to family LAM and sublineage RD Rio: common strains in Southern Brazil for over 10 years

A sublineage of Mycobacterium tuberculosis called RD Rio was described in 2007. Although only recently described, this strain may have been present previously in the population, and its identification in clinical isolates will elucidate bacterial transmission dynamics and host-pathogen interactions. This study evaluated the clonal diversity of the RD Rio sublineage in clinical isolates from Rio Grande-RS obtained between 1998 and 2001. Among the 45 samples analyzed by the MIRU-VNTR method, there were six clusters with two samples each and 33 orphan strains with unique pattern. The strains were distributed across several different lineages including LAM (34.04%), X (14.89%), Haarlem (12.77%), UgandaI (10.64%), S (4.26%), NEW-1 (2.13%) and Cameroon (2.13%); 14.89% of the strains matched to multiple lineages. RD Rio strains were present in 28.9% of the samples and 81.25% of the identified strains belonged to the LAM family. The high clonal diversity observed in this study is a constant feature in this region. The RD Rio sublineage has been in Rio Grande-RS since 1998. The continued monitoring of RD Rio in clinical isolates will enhance the understanding of its epidemiological significance.

Mapeamento e distribuição dos isolados do complexo Mycobacterium tuberculosis provenientes de casos de tuberculose bovina em Moçambique

A tuberculose bovina (bTB) é um problema sanitário importante em Moçambique e ainda a espera de uma ação organizada por parte dos Serviços Veterinários Oficiais. O presente estudo teve por objetivo investigar e mapear os genótipos de Mycobacterium bovis circulantes no país e paralelamente maximizar a utilização de abatedouros como fonte de informação epidemiológica da bTB. Durante o período de outubro de 2016 a abril de 2017 foram colhidas um total de 90 amostras de lesões sugestivas de tuberculose bovina nos abatedouros Municipais de Maputo e Maxixe e dois abatedouros privados da província de Maputo. Essas amostras, juntamente com outras 10, disponibilizadas pelo Laboratório Central de Veterinária e 72 do banco de amostras de Faculdade de Veterinária de Moçambique foram processadas para isolamento, identificação e discriminação molecular (MIRU-VNTR e spoligotyping) de micobactérias. Nos abatedouros foram coletados dados para calcular as prevalências de carcaças com lesões sugestivas de tuberculose e foi estimada em 0,63% e 80% das carcaças condenadas por tuberculose apresentaram lesões compatíveis com generalização da infecção. Foram obtidos 104 isolados identificados como gênero Mycobacterium, dos quais 80 foram compatíveis com o MTBC e 10 MNT. Destes 80 MTBC, 70 foram identificados como M. bovis. O MIRU-VNTR discriminou os 70 isolados de M. bovis em 47 perfis, agrupados em 3 complexos clonais e cinco singletons. Dos 24 loci estudados, os que apresentaram maiores polimorfismos foram MIRU 960, 2996 e QUB-4052. Em relação ao spoligotyping, foram identificados cinco perfis, dos quais o mais prevalente foi o SB0961, seguido do SB0140, SB2306, SB2481 (novo) e SB1099. Dos 70 isolados submetidos a análises dos complexos clonais africano 1, africano 2, europeu 1 e europeu 2, foram detectados apenas 18,5% de europeu. O distrito de Machanga foi o que apresentou maior diversidade de isolados e o Govuro maior número de isolados de M. bovis. Quando comparados as técnicas, o MIRU-VNTR apresentou maior poder de discriminação em relação ao spoligotyping. O complexo clonal europeu 1 está relacionado com o SB0140 que por sua vez é característico de isolados do Reino Unido e de países que tiveram trocas comerciais de bovinos com o país, incluindo os circunvizinhos a Moçambique e de onde há registros da importação de animais para Moçambique. A não identificação precisa dos complexos clonais dos spoligotyping SB0961, SB2306, SB2481 relacionados, podem ser derivados do BCG, que é sugestivo de evolução clonal própria de Moçambique e os complexos clonais até hoje existentes não são suficientes para discriminar os isolados de Moçambique. Embora os dados de abatedouros sugeriram que a prevalência da tuberculose bovina em Moçambique está entre as mais baixas dos países africanos, a predominância de carcaças com lesões generalizadas significa alto risco de exposição de animais e humanos, sobretudo das populações rurais que têm estreito contato com esses animais. Esse risco é ampliado em função da alta prevalência de humanos que vivem com HIV/AIDS no país. Assim, recomenda-se que Moçambique estruture programa de controle da doença nos animais e métodos de diagnóstico que detectem a infecção por M. bovis na população humana.

Bovine tuberculosis (bTB) is a major sanitary problem in Mozambique and awaits organized action by the Official Veterinary Services. The aim of this work was to investigate and map the circulating Mycobacterium bovis genotypes in the country and to maximize the use of slaughterhouses as a source of epidemiological information for bTB. During the period from October 2016 to April 2017, a total of 90 samples with lesions suggestive of bovine tuberculosis were collected from Maputo and Maxixe Municipal abattoirs and two private abattoirs from the province of Maputo. These samples, together with 10 others provided by the Central Veterinary Laboratory and 72 from the Veterinary Faculty sample bank were processed for isolation, identification and molecular discrimination (MIRU-VNTR and spoligotyping) of mycobacteria. Samples collected in the slaughterhouses were analyzed by calculating the prevalence of carcasses with lesions suggestive of bTB, which was estimated at 0.63% and 80% of carcasses condemned for tuberculosis presented lesions compatible with generalized infection. A total of 104 isolates were identified as M. bovis as Mycobacterium genus were obtained, of which 80 were compatible with MTBC and 10 MNT. Of these 80 MTBC, 70 were identified as M. bovis. The MIRU-VNTR discriminated the 70 isolates of M. bovis in 47 profiles, grouped in 3 clonal complexes and 5 singletons. Of the 24 loci studied, the ones with the highest polymorphisms were MIRU 960, 2996 and QUB-4052. In relation to spoligotyping, five profiles were identified; SB0961 was the most prevalent, being SB0961, followed by SB0140, SB2306, SB2481 (new) and SB1099. Of the 70 isolates submitted to analyzes of the clonal complexes African 1, African 2, European 1 and European 2, only 18.5% of European complex were detected. Machanga district presented the greatest diversity of isolates, while Govuro district had largest number of isolates of M. bovis. The MIRU-VNTR presented greater power of discrimination in relation to spoligotyping. The European clonal complex 1 was related to SB0140 which in turn is characteristic of isolates from the United Kingdom and from countries that have had commercial trade in cattle with UK including those surrounding Mozambique and where there are records of imports of animals for Mozambique. The precise identification of the clonal complexes of the SB0961, SB2306 and SB2481 related spoligotypings subject to the BCG derivatives, is suggestive of the clonal evolution of Mozambique and that the clonal complexes to date are not sufficient to discriminate against the isolates from Mozambique. Although data from slaughterhouses suggested that the prevalence of bovine tuberculosis in Mozambique is among the lowest in African countries, the predominance of carcasses with generalized lesions means a high risk of animal and human exposure, especially of rural populations that have close contact with these animals. This risk is amplified due to the high prevalence of people that living with HIV/AIDS in the country. Thus, it is recommended that Mozambique structure a disease control program in animals and diagnostic methods that detect M. bovis infection in the human population.

IDENTIFICAÇÃO E GENOTIPAGEM DO VÍRUS DA SÍNDROME DA MANCHA BRANCA (WSSV) ISOLADO DE Litopenaeus vannamei NO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE MOSSORÓ - RN 2016

A síndrome da mancha branca é uma doença notificável cujo agente etiológico é o Vírus da Síndrome da Mancha Branca (White Spot Syndrome Virus - WSSV) responsável por graves perdas econômicas na carcinicultura mundial. Desde 2012, têm sido verificados registros oficiais da presença do vírus no estado do Rio Grande do Norte - RN , região de extensa produção camaroneira. Apesar da importância, pouca informação tem sido produzida quanto às origens e biodiversidade dos virus circulantes. Diante disso, objetivou-se investigar a presença do vírus em criações de Litopenaues vannamei oriundos de fazendas do RN, bem como realizar a genotipagem dos isolados. Um total de cinco fazendas foram submetidas ao estudo, das quais foram coletadas 10 amostras de cada. Foram selecionados dois viveiros de cada uma das fazendas, escolhidos mediante suspeita clínica de WSSV. O DNA genômico foi extraído para investigação da presença ou ausência do vírus através da reação em cadeia da polimerase (PCR). Posteriormente, foi realizada por PCR a genotipagem dos isolados utilizando as repetições em tandem de número variável VNTR (ORFs 75, 94 e 125). Os resultados revelaram a presença do vírus em apenas uma das 5 fazendas analisadas. As regiões (ORF 75 e ORF 94) foram identificadas nos isolados da fazenda positiva e não houve amplificação para o ORF 125. O número de unidades repetidas (RUs) foi calculado, sendo verificado 9 repetições para o ORF 75 e 10 para o ORF 94, um padrão que ainda não havia sido descrito, alertando para a necessidade de mais isolados caracterizados geneticamente para o rastreamento e vigilância epidemiológica da doença.

White spot syndrome is an acute conatgious disease whose etiologic agent is the White Spot Syndrome Virus (WSSV) responsible for serious economic losses in world acquaculture. Since 2012, it has been notified WSSV occurrence in the state of Rio Grande do Norte - RN, one of most important shrimp production region. Despite its importance, there is a lack of information about the origins and biodiversity of circulating virus. The aim of investigation was to detect WSSV in Litopenaeus vannamei from farms in the RN as well as perform genotyping of the isolates. A total of five farms were surveyed, from which 10 samples were collected each one. We selected two ponds of each of the farms, chosen because clinical suspicion of WSSV. Genomic DNA was extracted to detect the virus by polymerase chain reaction (PCR). Subsequently, was performed by PCR genotyping of the positive DNA samples analysing variable number of tandem repeats - VNTR in three molecular markers (ORFs 75, 94 and 125). The results revealed the presence of virus in only one of the 5 analyzed farms. The loci ORF 75 and ORF 94 were identified in isolates from positive farm and no amplification failure for ORF 125. The number of repeating units (RUs) was calculated, and found to 9 repetitions ORF 75 and 10 RUs to ORF 94, a pattern that had not been described, stressing the need for more strain typing for screening and surveillance of the disease.

GENOTIPAGEM E PESQUISA DE RESISTÊNCIA FENOTÍPICA E GENÉTICA À RIFAMPICINA E ISONIAZIDA EM LINHAGENS DE MYCOBACTERIUM BOVIS ISOLADAS DE LINFONODOS DE BOVINOS DE ABATEDOURO NA REGIÃO CENTRO-OESTE DO ESTADO DE SÃO PAULO

A tuberculose causada por Mycobacterium bovis (bTB) é uma zoonose de distribuição mundial com ampla gama de hospedeiros. Nos países onde a bTB é prevalente, 10 a 20% dos casos de tuberculose humana são causados por M. bovis. São escassos em todo o mundo estudos que investigam a resistência à isoniazida (INH) e rifampicina (RMP) em linhagens de M. bovis de origem bovina, reservatórios silvestres, e em casos humanos de tuberculose. Foi investigada a diversidade genotípica de 67 linhagens de M. bovis isoladas de bovinos de abatedouro, obtidas de 100 linfonodos com lesão caseosa, pelas técnicas de Spoligotyping e MIRU-VNTR, bem como foi determinado o perfil fenotípico de resistência à INH e RMP pela técnica de REMA, e pesquisadas possíveis bases genéticas para resistência aos antimicrobianos. Dentre os isolados, 11 (16%) foram classificados como MDR-TB, 8 (12%) resistentes à INH e 2 (3%) resistentes à RMP. A pesquisa pelo GenoType MTBDRplus ver. 2.0 não acusou a presença de mutações em nenhum dos isolados fenotipicamente resistentes. Foram identificados 16 spoligotipos entre as linhagens. A subfamília BOV_1 predominou com 52 (77,6%) isolados, com os SIT 481, 482, 594, 665, 691, 698, 1021, 1667, 1852, 2141 e dois isolados sem shared type. A BOV_2 foi identificada em 8 (11,9%) isolados, com o SIT 683. Os SIT 982, 1851 e 1853 foram agrupados na família BOV. Dois isolados não foram classificados em família ou subfamília. A análise de MIRU-VNTR com painel de 12 MIRUs, identificou 31 isolados pertencentes ao MIT 49, um ao MIT 5 e 35 órfãos. A junção das análises de Spoligotyping e MIRU-VNTR possibilitou o agrupamento dos isolados em 12 clusters (contendo, ao todo, 46 isolados) e 21 isolados diferenciados em perfis únicos. Ressalta-se a elevada frequência de M. bovis nos linfonodos processados, e a multirresistência de certas linhagens a fármacos de primeira linha utilizados no tratamento humano da tuberculose, fato que gera preocupações em saúde pública. Futuros estudos são necessários para elucidar as bases da resistência aos fármacos e a ocorrência da diversidade genotípica em linhagens de M. bovis de origem bovina.

Tuberculosis caused by Mycobacterium bovis (bTB) is a zoonosis of worldwide distribution with broad host range. In countries where bTB is prevalent, 10-20% of the human cases of tuberculosis are caused by M. bovis. All over the world there are few studies investigating the resistance to isoniazid (INH) and rifampicin (RMP) in M. bovis strains from cattle, wild reservoirs, and human cases of tuberculosis. The genotypic diversity of 67 M. bovis strains obtained out of 100 lymph nodes with caseous lesions from slaughtered animals was investigated by Spoligotyping and MIRU-VNTR techniques, as well as the assessment of their phenotypic profile of resistance to INH and RMP by REMA method and the search of possible genetic basis for antimicrobial resistance. Among the obtained isolates, 11 (16%) were classified as MDR-TB, 8 (12%) INH-resistant and 2 (3%) RMP-resistant. The use of GenoType MTBDRplus ver. 2.0 did not pointed the presence of genetic mutations in any of the phenotypically resistant isolates. Sixteen different spoligotype patterns were identified. The BOV_1 subfamily predominated with 52 (77.6%) isolates, with SITs 481, 482, 594, 665, 691, 698, 1021, 1667, 1852, 2141 and two isolates without a given SIT. BOV_2 was identified in 8 (11.9%) isolates, within SIT 683. The SITs 982, 1851 and 1853 were grouped in BOV family. Two isolates were not classified in family or subfamily. The MIRU-VNTR analysis using the 12 classical MIRUs, identified a cluster of 31 isolates belonging to the MIT 49, one on MIT 5 and 35 orphans isolates. The combination of Spoligotyping and MIRU-VNTR analysis allowed the grouping of the isolates in 12 clusters (containing, in total, 46 isolates) and 21 isolates with unique profiles. The study highlights the high frequency of M. bovis among the sampled lymph nodes, emphasizing the impact of the pathogen as the causal agent of lymphadenitis and tuberculosis in cattle herds in the study area. In addition, points up the multidrug-resistance of M. bovis lineages to first-line drugs used in the human treatment of tuberculosis, a fact that raises public health concerns. Further studies are required to elucidate the basis of drug resistance and the occurrence of genotypic diversity in M. bovis strains.

Isolation and characterization of Leptospira interrogans from pigs slaughtered in São Paulo State, Brazil

With the aim of isolating Leptospira spp., blood serum, kidney, liver and genital tract of 137 female swine (40 sows and 97 gilts) and also urine samples from 22 sows were collected in a slaughterhouse in the State of São Paulo, from April 2003 to August 2004. Four isolates were obtained from animals that presented microagglutination test (MAT) titers > 100 for the serovar Pomona and one was obtained from an animal negative by MAT in which Leptospira was isolated from the liver and reproductive tract. The presence of leptospiral DNA was investigated by PCR, and positive results were found in kidneys of 11 females, liver of two, genital tract of two and urine of one of them. Nephrosis, interstitial multifocal nephritis, moderate to severe changing, hyalines cylinders and hemorrhagic focuses, hepatic and uterine horns congestion were histological lesions observed in higher frequency in animals positive for leptospira. The silver impregnation (Warthin Starry) confirmed the presence of spirochetes in renal tubules of four females with positive leptospira cultures from kidneys. The serogroup of the five isolates was identified as Pomona by cross agglutination with reference polyclonal antibodies. Molecular characterization of the isolates was carried out by variable-number tandem-repeats analysis. All the isolates revealed a pattern distinct from the L. interrogans Pomona type strain, but identical to a previously identified pattern from strains isolated in Argentina belonging to serovar Pomona.

Amostras de soro sanguíneo, rim, fígado e trato genital de 137 fêmeas suínas (40 matrizes e 97 marrãs) e de urina de 22 matrizes foram colhidas em abatedouro no Estado de São Paulo, no período de abril de 2003 a agosto de 2004 tendo como objetivo o isolamento de Leptospira spp. Quatro estirpes foram isoladas de animais que apresentaram títulos, no teste de soroaglutinação microscópica (SAM) > 100, para o sorovar Pomona e de um animal, não reagente na SAM, em que houve isolamento de leptospiras do fígado e aparelho reprodutor. A presença do DNA de leptospira foi investigada pela técnica da PCR e foram observados resultados positivos nos rins de 11 fêmeas, no fígado de duas, no aparelho reprodutor de duas e na urina de uma delas. Nefrose, nefrite intersticial multifocal variando de moderada a severa, cilindros hialinos e focos hemorrágicos, congestão hepática e de cornos uterinos foram lesões histológicas evidenciadas com freqüência mais alta em animais positivos para leptospira. A impregnação argêntica (Warthin Starry) confirmou a presença de espiroquetas nos túbulos renais das quatro fêmeas onde houve cultura positiva para leptospiras dos rins. O sorogrupo dos cinco isolados foi identificado como Pomona pela técnica de aglutinação cruzada com anticorpos policlonais de referência. A caracterização molecular dos isolados foi realizada pela análise do número variável de repetições em tandem (VNTR). Os mesmos revelaram um padrão distinto da estirpe padrão de L. interrogans sorovar Pomona, porém idêntico a um padrão previamente identificado em estirpes isoladas na Argentina, pertencentes ao sorovar Pomona.

Isolamento de leptospiras em bovinos abatidos em frigoríficos de Pelotas/RS

A leptospirose é uma zoonose de ampla distribuição mundial causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira. Tanto a leptospirose humana quanto a animal são doenças subdiagnosticadas e negligenciadas no mundo. A leptospirose bovina além de resultar em graves prejuízos para a economia dos países acometidos, ela é considerada como um fator de risco ocupacional para veterinários, magarefes e produtores rurais. Além disso, as vacinas disponíveis para a enfermidade em bovinos são bacterinas, as quais são constituídas por sorovares alóctones, e por isso, são consideradas ineficazes para o controle da leptospirose bovina no Brasil. Desta forma, este trabalho teve como objetivo o isolamento de leptospiras em bovinos abatidos em frigoríficos de Pelotas/RS. Para a caracterização dos isolados, realizou-se o teste de virulência em modelo animal, sorogrupagem, seqüenciamento de DNA e a técnica Variable-Number Tandem-Repeat (VNTR). Como resultados, três cepas foram isoladas a partir do cultivo renal de três bovinos machos, adultos, os quais eram procedentes dos municípios de Capão do Leão e Pedro Osório. As cepas isoladas foram denominadas de BOV3, BOV14 e BOV15. O resultado do teste de virulência revelou que apenas duas cepas (BOV3 e BOV15) foram capazes de reproduzir os principais achados clínicos e patológicos da leptospirose experimental. A sorogrupagem classificou as três cepas como pertencentes ao sorogrupo Canicola. Já o conjunto de técnicas empregadas para a tipificação genotípica não foi capaz de identificar a espécie das três leptospiras isoladas de forma conclusiva. Este resultado é inédito para o nosso grupo de pesquisas, já que anteriormente havíamos isolado cepas de humanos, caninos, camundongos e ovinos

Sistema de detecção de focos de tuberculose bovina no Estado de São Paulo utilizando métodos moleculares e epidemiológicos / A molecular and epidemiological based-work system for detection of bovine tuberculosis focus in the state of São Paulo

Foi estabelecida uma parceria entre o Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal (VPS) da FMVZ-USP, a Coordenadoria de Defesa Agropecuária do Estado de São Paulo e o Serviço de Inspeção Federal (SIF) para organizar um sistema capaz de detectar focos de tuberculose bovina no Estado, com base nas rotinas de inspeção de carcaças em abatedouros, cujos objetivos foram: 1) conhecer a diversidade genética de isolados de Mycobacterium bovis em bovinos no Estado de São Paulo; 2) estudar a distribuição espacial desses focos; 3) estudar a tipologia das unidades de criação de bovinos caracterizadas como focos de tuberculose; 4) verificar se é possível, com a atual infra-estrutura existente em São Paulo, operar um sistema de vigilância para detecção de focos de tuberculose bovina. Assim, foi estruturado um sistema de coleta, envolvendo as redes SISP (Sistema de Inspeção do Estado de São Paulo) e SIF, que realizou as coletas de materiais e informações de maio de 2002 a janeiro de 2004. Todo o material seguiu para o VPS, onde foram processados. As propriedades caracterizadas como focos foram rastreadas e delas foi coletada outro conjunto de informações. Seguem os resultados alcançados: 1) foram identificados 33 diferentes espoligotipos dentre os 248 isolados de M. bovis de bovinos no Estado de São Paulo. Os isolados do espoligotipo SB0295 foram re-discriminados em 13 novos perfis genéticos de M. bovis pela técnica MIRU-VNTR; 2) dentre os dois espoligotipos mais prevalentes estudados (SB0295 e SB0121), apenas o SB0295 apresentou-se de forma agrupada nas análises espaciais; 3) foram geradas várias informações sobre a tipologia e o manejo das unidades de criação de bovinos caracterizadas como focos de tuberculose; 4) a atual infra-estrutura existente no Estado de São Paulo foi capaz de operar um sistema de detecção de focos de tuberculose bovina

A partnership between the Department of Preventive Veterinary Medicine and Animal Health (VPS) of the FMVZ-USP, the Coordination of Agriculture and Animal Defense of the State of São Paulo, and the Federal Inspection Service (SIF) was established to organize a work system for detection of bovine tuberculosis focus in the state, based on routine methods of carcass inspection in the abattoir, with the following objectives: 1) to determine the genetic diversity of the isolates of Mycobacterium bovis from bovines in the state of São Paulo; 2) to study the spatial distribution of the focuses; 3) to study the typology of the bovine breading units (farms), which were characterized as tuberculosis focus; 4) to verify the possibility of operating a surveillance system for detection of bovine tuberculosis focus based on the current network in the state of São Paulo. Thus, it was performed a system for data collection involving the current systems SISP (System of Inspection of the State of São Paulo) and SIF, who performed the collection of biological samples and information from May 2002 to January 2004. All samples were addressed to the VPS, where they were processed. Farms characterized as focus were traced to obtain new information. The results obtained in this study follow: 1) A total of 33 different spoligotypes were determined out of 248 bovine isolates of M. bovis in the state of São Paulo. The spoligotype SB0295 isolates were re-discriminated into 13 new M. bovis genetic profiles by the MIRU-VNTR technique; 2) From the two most prevalent spoligotypes analyzed in this study (SB0295 e SB0121), only SB0295 showed a cluster presentation by the spatial analyses; 3) Several information about typology and bovine breeding unit management were generated regarding the status of tuberculosis focus; 4) the current network in the state of São Paulo was capable of operating a system for detection of bovine tuberculosis focus