Acaricidal activity of extracts from different structures of Piper tuberculatum against larvae and adults of Rhipicephalus microplus / Atividade acaricida de extratos de diferentes estruturas de Piper tuberculatum sobre larvas e adultos de Rhipicephalus microplus

The strategies to control the cattle tick, Rhipicephalus microplus are based mainly on the use of synthetic pesticides. However, the emergence, establishment, and development of resistance of ticks is rendering the main chemical groups ineffective. Finding new molecules to effectively control infestations by R. microplus is necessary to maintain the productivity of cattle herds, particularly of taurine breeds established in equatorial and tropical regions of the world. Ethanol extracts from the leaves, stems, and fruits of Piper tuberculatum were evaluated in bioassays at concentrations of 50, 25, 12.50, 6.25, 3.12 and 1.56 mg mL-1. The concentrations lethal to 50% of the individuals (LC50) of tick larvae after 24 hours of exposure were 3.62, 3.99 and 5.30 mg mL-1 for fruit, stem and leaf extracts, respectively. Against the engorged females, the highest efficacy rates were obtained at the concentration of 50 mg mL-1, corresponding to 71.57%, 68.38% and 37.03% of the fruit, leaf and stem extracts, respectively. The main effect of the ethanol extracts was on the egg hatching rate of ticks, with a reduction of 55.63% for the fruit and leaf extracts, and 20.82% for the stem extract. The results show that P. tuberculatum is a promising source of molecules for use as active ingredients in pesticide formulations for R. microplus control.(AU)

Estratégias de controle do carrapato dos bovinos, Rhipicephalus microplus, fundamentam-se na utilização de pesticidas. Os principais grupos químicos utilizados atualmente mostram-se ineficazes devido ao surgimento de populações resistentes. A pesquisa de novas moléculas com eficiência acaricida é uma necessidade para manutenção da produtividade dos rebanhos bovinos estabelecidos em regiões de clima tropical. Avaliamos a atividade de Piper tuberculatum para o controle de fêmeas ingurgitadas e larvas de R. microplus através de bioensaios de imersão de adultos e de pacotes de larvas. As concentrações avaliadas foram de 50; 25; 12,50; 6,25; 3,12 e 1,56 mg mL-1 de extrato etanólico de folha, talo e fruto de P. tuberculatum. As concentrações letais para 50% dos indivíduos (CL50) após 24 horas de exposição de larvas de R. microplus foram 3,62; 3,99 e 5,30 mg mL-1 para os extratos etanólicos de fruto, talo e folha, respectivamente. Para fêmeas ingurgitadas, a maior eficácia resultou da concentração de 50 mg mL-1 de extrato de fruto (71.57%). O principal efeito dos extratos etanólicos de P. tuberculatum foi sobre a eclodibilidade, com uma redução de 55.63% para extratos de fruto e folha. P. tuberculatum mostra-se promissora como fonte de moléculas candidatas a uso em pesticidas, em formulações destinadas ao controle das infestações de R. microplus.(AU)

Encapsulamento de conídios de Metarhizium anisopliae: avaliação da estabilidade e potencial no controle de Rhipicephalus microplus

Devido aos problemas gerados pelo uso indiscriminado de acaricidas químicos para o controle de carrapatos, métodos alternativos vem sendo desenvolvidos, como o uso de fungos entomopatogênicos. No entanto, estes entomopatógenos têm sua viabilidade comprometida quando aplicados em condições naturais, sendo indispensável o desenvolvimento de formulações. Neste contexto, as tecnologias de microencapsulamento de agentes de biocontrole são promissoras, pois além de propiciar proteção contra fatores ambientais, aumentam a vida útil do microrganismo encapsulado. A gelificação iônica é uma técnica simples e financeiramente viável que vem sendo estudada para o encapsulamento de fungos entomopatogênicos.Assim, o objetivo do presente estudo foi encapsular os conídios de Metarhizium anisopliae (LCM S01) em alginato de sódio a 2 e 3%, utilizando a técnica de gelificação iônica e avaliar as micropartículas quanto a morfologia externa, concentração, viabilidade, tempo de prateleira, tolerância à irradiação UV-B, termotolerância e eficácia no controle de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus. A morfologia externa das partículas foi caracterizada através de Microscopia Eletrônica de Varredura e a viabilidade dos conídios encapsulados (EC) foi determinada pelo percentual de germinação. Para o tempo de prateleira, os conídios encapsulados em 2 (EC 2%) ou 3% (EC 3%) de alginato de sódio e os não encapsulados (NEC), foram armazenados por 1, 3, 5, 7, 9 e 11 meses em condição ambiente e em freezer. Quanto à tolerância à UV-B, os conídios EC e NEC foram expostos a dose total de 6.0 ou 8.0 kJ m-2, enquanto que para termotolerância foram submetidos a 42 ºC em banho maria por 2, 4 e 6 horas. Ainda, foram avaliados os parâmetros biológicos de fêmeas ingurgitadas expostas a 30, 60 ou 90 mg de micropartículas em condições laboratoriais. As partículas fúngicas de alginato de sódio a 2 e 3% apresentaram-se esféricas com superfície mais homogênea e heterogênea, respectivamente. O encapsulamento não provocou perdas severas de conídios e não afetou sua viabilidade. O encapsulamento aumentou a vida útil dos conídios armazenados em ambiente por 1, 3 e 5 meses em relação aos conídios NEC. Em freezer, os conídios NEC germinaram mais do que os EC. Os conídios EC e NEC apresentaram maior viabilidade em freezer do que em ambiente. A exposição ao calor por 6 horas reduziu a germinação de conídios NEC comparados com os EC 2 e 3%. A exposição às diferentes doses de UV-B também reduziu significativamente a germinação dos conídios NEC em relação aos EC. As partículas foram capazes de reduzir significativamente os parâmetros biológicos das fêmeas ingurgitadas quando comparado aos conídios NEC e ao grupo controle, no entanto não houve diferença significativa entre as diferentes quantidades de partículas avaliadas. De forma geral, não foram observadas diferenças significativas entre as concentrações de alginato de sódio utilizadas. Assim, as formulações desenvolvidas no presente estudo aumentaram o tempo de prateleira, a termotolerâcia e a tolerância à UV-B dos conídios de LCM S01 de M. anisopliae, e foram eficazes no controle de fêmeas ingurgitadas de R. microplus, apresentando potencial promissor no controle deste carrapato.

Due to the problems generated by the indiscriminate use of chemical acaricides to control ticks, alternative methods have been developed, such as the use of entomopathogenic fungi. However, these entomopathogens have their viability compromised when applied under natural conditions, being indispensable the development of formulations. In this context, microencapsulation technologies for biocontrol agents are promising; since it provides protection against environmental factors as well as increased the encapsulated microorganism shelf life. Ionic gelation is a simple and financially viable technique when employed for the entomopathogenic fungi encapsulation. Thus, the aim of the present study was encapsulate the Metarhizium anisopliae conidia (LCM S01) in 2 and 3% sodium alginate, using the ionic gelation technique and, evaluate the external morphology, concentration, viability, shelf life, tolerance of UV-B irradiation, thermotolerance and efficacy of these microparticles in the control of Rhipicephalus microplus engorged females. The external morphology was characterized by ScanningElectron Microscopy (SEM) and the encapsulated conidia (EC) viability was determined by the germination percentage. For shelf life, conidia encapsulated in 2 (EC 2%) or 3% (EC 3%) of sodium alginate and unencapsulated (NEC) were stored for 1, 3, 5, 7, 9 and 11 months at room temperature and in a freezer. For UV-B tolerance assay, EC and NEC were exposed to 6.0 or 8.0 kJ m-2, while for thermotolerance, they were submitted to 42 ºC in a water bath for 2, 4 and 6 hours. Furthermore, the biological parameters of engorged females exposed to 30, 60 or 90 mg of microparticles under laboratory conditions wereevaluated. 2 and 3% sodium alginate fungal particles were spherical with a more homogeneous and heterogeneous surface, respectively. Encapsulation did not cause severe conidia losses and did not affect their viability. Encapsulation increased the conidia shelf life stored at room temperature for 1, 3 and 5 months compared to NEC. In the freezer, NEC germinated more than EC. The EC and NEC showed greater viability in the freezer when compared to room temperature. Heat exposure for 6 hours reduced the NEC germination compared to EC 2 and 3%. Different UV-B doses exposure also significantly reduced the NEC germination compared to EC. The particles were able to reduce significantly the engorged females biological parameters when compared to NEC and the control group, however, there was no significant difference between the particles evaluated. In general, no significant differences were observed between the sodium alginate concentrations used. Thus, the formulations developed in the present study increased M. anisopliae (LCM S01) shelf life, thermotolerance and UV-B tolerance, and were effective in R. microplus engorged females control, showing promising potential to control this tick.

CONTROLE DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus UTILIZANDO Metarhizium anisopliae NO RECÔNCAVO DA BAHIA

Os objetivos deste estudo foram avaliar a patogenicidade in vitro e em condições seminaturais do fungo Metarhizium anisopliae em formulações aquosa e oleosa sobre os estágios de vida livre do carrapato Rhipicephalus microplus, e verificar o período de permanência deste microrganismo no solo. O ensaio biológico em condições seminaturais utilizou fêmeas ingurgitadas, que foram depositadas em vasos previamente cultivados com Brachiaria brizantha e pulverizados com 80 mL dos tratamentos propostos. O experimento foi composto por quatro tratamentos: controle aquoso (água destilada e Tween 80 a 0,1%); controle oleoso (água destilada + Tween 80 a 0,1% + 10% de óleo mineral); formulação aquosa (M. anisopliae + água destilada + Tween 80 a 0,1%); formulação oleosa (M. anisopliae + água destilada + Tween 80 a 0,1% + 10% de óleo mineral), com 10 vasos por grupo. A ação in vitro do fungo sobre R. microplus foi avaliada utilizando o teste de imersão de fêmeas. No teste em condições seminaturais, a patogenicidade do fungo sobre o carrapato foi avaliada por meio de vistorias diárias a fim de identificar a mortalidade das fêmeas e pela recuperação das larvas das gramíneas no 42º dia, após o tratamento. Também foi realizado o isolamento fúngico a partir das fêmeas de R. microplus mortas e do solo dos vasos. Para a avaliação da sobrevivência do fungo no solo foram coletadas amostras antes da pulverização e no 3º, 7º, 21º e 52º dia após o tratamento. No teste in vitro a formulação oleosa de M. anisopliae reduziu significativamente o peso da massa de ovos das teleóginas, bem como, do índice de produção de ovos, conferindo um percentual de controle de 78,6%, o que pode ser justificado pela proteção e melhor adesão a cutícula do carrapato conferida pelo óleo mineral aos conídios. O tratamento formulação oleosa também reduziu o número de larvas infestantes no experimento nas condições seminaturais, promovendo percentual de controle entre 58,4 e 61,3% sobre larvas de R. microplus. As análises macro e micromorfológica das colônias fúngicas isoladas das fêmeas e do solo tratados com as formulações aquosa e oleosa foram compatíveis com as descritas na literatura para M. anisopliae. Para ambos os grupos se verificou persistência do fungo no solo por até 52 dias após tratamento. Os resultados apontam a capacidade de M. anisopliae de reduzir os parâmetros reprodutivos de fêmeas ingurgitadas de R. microplus no teste in vitro, reduzir o número de larvas e sua viabilidade no solo em condições seminaturais no Recôncavo da Bahia.

The objectives of this study were to evaluate the pathogenicity in vitro and in semi-natural conditions of the fungus Metarhizium anisopliae in aqueous and oily formulations on the free life stages of the tick Rhipicephalus microplus, and to verify the period of permanence of this microorganism in the soil. The biological assay in semi-natural conditions used engorged females, which were deposited in pots previously grown with Brachiaria brizantha and sprayed with 80 mL of the proposed treatments. The experiment consisted of four treatments: aqueous control (distilled water and 0.1% Tween 80); oily control (distilled water + 0.1% Tween 80 + 10% mineral oil); aqueous formulation (M. anisopliae + distilled water + 0.1% Tween 80); oily formulation (M. anisopliae + distilled water + 0.1% Tween 80 + 10% mineral oil), with 10 pots per group. The in vitro action of the fungus on R. microplus was evaluated using the female immersion test. In the test under semi-natural conditions, the pathogenicity of the fungus on the tick was assessed by daily surveys in order to identify the mortality of the females and by the recovery of the grass larvae on the 42nd day after treatment. Fungal isolation was also performed from dead R. microplus females and pot soil. To assess the survival of the fungus in the soil, samples were collected before spraying and on the 3rd, 7th, 21st and 52nd days after treatment. In the in vitro test the oily formulation of M. anisopliae significantly reduced the weight of the egg mass of the teleogens, as well as the egg production index, giving a control percentage of 78.6%, which can be justified by the protection and better adhesion to the tick cuticle conferred by mineral oil to the conidia. The oily formulation treatment also reduced the number of weed larvae in the experiment under semi-natural conditions, promoting a control percentage between 58.4 and 61.3% over R. microplus larvae. Macro and micromorphological analyzes of fungal colonies isolated from females and soil treated with aqueous and oily formulations were compatible with those described in the literature for M. anisopliae. For both groups, the fungus persisted in the soil for up to 52 days after treatment. The results indicate the capacity of M. anisopliae to reduce the reproductive parameters of engorged females of R. microplus in the in vitro test, to reduce the number of larvae, and their viability in the soil under semi-natural conditions in the Recôncavo da Bahia.

AVALIAÇÃO DA BIOLOGIA REPRODUTIVA E HISTOPATOLOGIA DOS OVÁRIOS DE FÊMEAS INGURGITADAS DE Rhipicephalus microplus SUBMETIDAS A UMA FORMULAÇÃO CONTENDO FIPRONIL E FLUAZURON

Rhipicephalus microplus (Canestrini, 1888) é um importante ectoparasito na criação de bovinos em regiões tropicais, subtropicais e temperadas no mundo. Esse carrapato atua na transmissão de patógenos, como Babesia bovis, Babesia bigemina e Anaplasma marginale, levando a um quadro clínico de moderado a grave. Outro prejuízo causado por R. microplus é a espoliação sanguínea, que leva a debilidade, anemia, perda de peso, podendo levar a óbito, em grandes infestações. Como o carrapato R. microplus representa importância médico veterinária, elevando os custos de produção de bovinos, torna-se importante a realização de controle, que é atualmente realizado quase que exclusivamente com a utilização de carrapaticidas organossintéticos. Atualmente, existem formulações comerciais disponíveis para controle de R. microplus com base na associação dos princípios ativos, fipronil e fluazuron, que tem sido amplamente utilizada. Contudo, não existem informações a respeito dos efeitos citotóxicos dessas moléculas sobre esse carrapato. Estudos sobre as alterações morfológicas causadas por esses produtos permitirão melhor compreensão do mecanismo de ação e toxicidade desses ingredientes ativos em diferentes órgãos. Assim, o objetivo desse estudo foi avaliar o potencial efeito histológico de uma formulação comercial, contendo fipronil e fluazuron sobre a biologia reprodutiva e ovários de fêmeas ingurgitadas de R. microplus. Para a realização do estudo, três bezerros foram infestados com aproximadamente 5.000 larvas nos dias -24, -21, -19, -17, -14, -12, -10, -7, -5 e -3, considerando o dia 0, o dia do tratamento. O tratamento consistiu na aplicação da formulação carrapaticida comercial contendo fipronil (1,25 %) e fluazuron (2,5%) (Tick Gard®- MSD Saúde Animal). Antes da aplicação da formulação carrapaticida, foram recuperadas 20 fêmeas ingurgitadas, naturalmente desprendidas dos bovinos, para formação do grupo controle. Após a aplicação da formulação comercial, foram coletadas fêmeas ingurgitadas naturalmente desprendidas dos animais nos dias +4, +12 e +20. Após a aplicação da formulação comercial, foram coletadas fêmeas ingurgitadas naturalmente desprendidas dos animais nos dias +5, +10 e +20 para acompanhamento da biologia reprodutiva e +4, +12 e +20 para avaliação da histologia dos ovários. As fêmeas coletadas para acompanhamento da biologia reprodutiva foram mantidas em câmara climatizada para oviposição, posteriormente, incubação desses ovos, enquanto as fêmeas utilizadas para as análises histológicas foram mantidas em câmara climatizada por 4 dias e após esse período, foram dissecadas. Os ovários foram retirados e armazenados em eppendorf com formalina tamponada 10%, onde permaneceram por 2 semanas. Posteriormente, os ovários foram desidratadas de forma seriada em etanol e incluídos em historesina de inclusão (Leica®) sendo armazenado durante duas semanas à 4º C. Após esse período os órgãos foram transferidos para moldes de silicone com resina de polimerização para formação dos blocos. Os blocos foram seccionados na espessura de 4.0 µm utilizando um micrótomo (Leica RM 2145) e distribuídos em lâminas para microscopia 26x76 mm com extremidade fosca. Os cortes foram corados com azul de toluidina (1%) e as lâminas foram avaliadas em microscópio para fotodocumentação. Na avaliação da biologia reprodutiva, foi observado que as fêmeas provenientes dos grupos tratados produziram uma menor quantidade de ovos (p<0,05) e esses ovos apresentaram uma menor viabilidade (p<0,5), quando comparados com o grupo controle. Todos os grupos tratados (G2 - dia+4; Grupo 3 - dia +12 e grupo 4 - +20) tiveram alterações morfológicas consideráveis. As alterações foram: desorganização citoplasmática, degradação citoplasmática, formato irregular do oócito, vesícula germinativa com formato irregular, redução dos grânulos de vitelo, vacuolização dos grânulos de vitelo e rompimento do oócito. Também foi observado um menor número de oócitos em todos estágios de desenvolvimento (I, II, III, IV e V) e um maior número de oócitos indeterminados, nos ovários de fêmeas provenientes dos grupos tratados (p<0,05), quando comparados com o grupo controle. A partir desses resultados, é possível concluir que a formulação comercial contendo fipronil e fluazuron apresentou efeito citotóxico nos ovários de fêmeas ingurgitadas de R. microplus.

Rhipicephalus microplus is an important ectoparasite inside cattle breeding in tropical, subtropical and temperate region in the world. This tick is responsible for pathogens transmission, like Babesia bovis, Babesia bigemina and Anaplasma marginale, inducing a pathological condition that can lead to a moderate to severe clinical condition. Another harm caused by R. microplus is the large amount of blood sucking, which causes weakness, anemia, weight loss and death in case of large infestation. The R. microplus represents a great importance regarding to livestock cost, thus it is important control this ectoparasite which is done almost exclusively with chemical acaricide. Currently, there are commercial formulations for R. microplus control that contain, associated or not, fipronil and fluazuron. These substances are known to be widely used for decades, however there isn`t any information regarding cytotoxic effects of these molecules on ticks. Research on morphological changes caused by these two products allows a better understanding of how these active ingredients act in different tick organs. Thus, the objective of this study was to evaluate the reproductive biology and histological effects of a commercial formulation, containing fipronil and fluazuron on the ovary of R. microplus engorged females. Three calves were infested with approximately 5.000 larvae on days -24, -21, -19, -17, -14, -12, -10, -7, -5 and -3, considering day 0, the treatment day. The treatment consisted on the application of a commercial acaricidal formulation with fipronil (1,25 %) and fluazuron (2,5%) (Tick Gard®- MSD Saúde Animal). Before application of acaricidal formulation, 20 engorged females, naturally detached form the cattle, were recovered, to form the control group. After application of the commercial formulation, engorged females naturally detached from the animals were collected on days +5, +10 and +20 for reproductive biology monitoring and on days +4, +12 and +20 for ovaries histology evaluation. The females collected for reproductive biology monitoring were kept in a climatecontrolled chamber for oviposition, subsequently incubating these eggs, while the females used for histological analysis were kept in a climate-controlled chamber for 4 days and then dissected. The ovaries were dissected and stored in Eppendorf with buffered formalin 10%, which were remained for 2 weeks at 4°C. Subsequently, the ovaries were dehydrated serially in ethanol (70%, 80%, 90%, 95% and 100%) during 15 minutes interval, and included in inclusion historesin (Leica®) for another 2 weeks at 4º C. After this period, the organs were transferred to silicone molds with polymerization resin to form blocks. The blocks were sectioned at thickness of 4,0 µm, using a microtome (Leica RM 2145) and distributed on microscope slides 26x76 mm with a matte tip. The sections were stained with toluidine blue (1%). In reproductive biology evaluation, it was observed that females from the treated groups produced a smaller amount of eggs (p<0.05) and these eggs had a lower viability (p<0.5) when compared to the control group. In the histological analysis, many alterations were observed in the oocytes of females from all treated groups, including irregularly shaped oocyte, irregularly shaped germinal vesicle, yolk granules reduction, yok granules vacuolization and oocyte disruption. It was also observed a smaller number of oocytes in all stages of development (I, II, III, IV and V) and a greater number of indeterminate oocytes on ovaries of females from the treated groups (p<0.05), when compared with the control group. From these results, it is possible to conclude that the commercial formulation containing fipronil and fluazuron affected the reproductive biology of engorged females of R. microplus, and one of the mechanisms that possibly explains this effect is the cytotoxic action that the formulation with fipronil + fluazuron presented in the ovaries.

Metarhizium spp.: Seleção de isolados, ação antimicrobiana e eficácia de formulações granulares no controle de Rhipicephalus microplus

Metarhizium sp. é encontrado no solo e em raízes de plantas e a pastagem é um ambiente propício para o desenvolvimento desse entomopatogeno, tornando a rizosfera de forrageiras e a presença de hospedeiros como o carrapato Rhipicephalus microplus um nicho ecológico ideal. Porém, fatores bióticos e abióticos interferem na persistência fúngica, sendo fundamental selecionar bons isolados, considerar as interações ecológicas com outros microrganismos e formulá-los. Baseado nisso, o presente trabalho apresenta estudos aplicados ao gênero Metarhizium no controle de pragas. Foram avaliados: a tolerância térmica e a capacidade de diferentes isolados do fungo em colonizar tecidos da planta Vigna radiata; a expressão do gene de adesão na planta em diferentes substratos; o efeito antimicrobiano e acaricida do exsudato fúngico; e a eficácia de formulações granulares de microescleródios (MS) e blastosporos (BLS) para o controle R. microplus. No ensaio de tolerância térmica, suspensões conidiais foram expostas a 25ºC, 40°C e 45°C, por 2h, 4h, 8h e 12h, e posteriormente a germinação foi avaliada após incubação por 48h a 25 ± 1°C, para a atividade dos isolados no frio esses foram submetidos à temperatura de 5ºC durante 14 dias, selecionando assim os termotolerantes. Para o estudo de colonização endofítica, sementes, raiz, caule e folha de V. radiata foram tratadas com suspensões de diferentes isolados, e a colonização dos tecidos do vegetal foi avaliada. No ensaio de expressão gênica, após o cultivo do fungo sobre meio mínimo (MM), meio batata dextrose ágar (BDA) e sobre a planta, a expressão do Gene mad2 foi observada. Para avaliar o efeito do exsudato de Metarhizium sp. no carrapato e em bactérias, o líquido resultante da exsudação de colônias foi coletado e a partir do teste de difusão em disco sobre cepas de duas bactérias isoladas do solo e sobre cepas resistentes e sensíveis de Staphylococcus sp. e Escherichia coli foi avaliado. Para o efeito acaricida, o exsudato fúngico foi inoculado nas fêmeas do carrapato e parâmetros biológicos, mortalidade e resposta celular do artrópode foram avaliadas. Por último, no teste de eficácia de formulações granulares de MS e BLS, vasos contendo Urochloa decumbens foram tratados com os grânulos, e posteriormente fêmeas de R. microplus foram introduzidas. Foram avaliados, a mortalidade, o número de larvas infestantes, assim como a persistência do fungo no solo. Quanto aos resultados, no teste de tolerância térmica, todos os isolados de Metarhizium spp testados germinaram mais que 90% após 12h a 40 °C e após a incubação no frio. Foram considerados bons isolados, aqueles que não sofreram variação drástica na germinação ao longo do tempo de exposição. Ao avaliar a capacidade de colonizar V. radiata, todos os isolados testados foram capazes de colonizar raízes, caules e folhas, havendo variação na colonização dos diferentes tecidos. Quando o fungo se desenvolveu sobre a planta o gene mad2 foi mais expresso que em BDA, porem foi no MM que o gene foi mais expresso. O exsudato fúngico foi capaz de inibir o crescimento das cepas resistente e sensível de Staphylococcus spp., e afetou mais as cepas de bactérias isoladas do solo do que as demais quando comparadas entre si. O exsudato também afetou diretamente o carrapato, reduzindo a resposta celular, causando morte e diminuição da postura de ovos. As formulações granulares de M. robertsii mostraram-se eficazes em controlar o carrapato nas condições testadas e o isolado fúngico colonizou a rizosfera da de U. decumbens. Este estudo fornece dados sobre a aplicação de isolados de Metarhizium spp. no solo e contribui para futuras pesquisas e bioprospecção desse microrganismo.

Metarhizium sp. species could be found in soil and plant roots, and the pasture is ideal environment for this fungus development, where the plant's rhizosphere and the presence of hosts such as the tick Rhipicephalus microplus make the best ecological niche. However, biotic and abiotic factors interfere on its persistence been essential to select good isolates, consider ecological interactions with other microorganisms, and formulate them. Based on this, the present study considers the applicability of the genus Metarhizium spp. in pest control. Were evaluated: thermal tolerance and the ability of different isolates of the fungus to colonize tissues of the Vigna radiata plant; the antimicrobial and acaricidal effect of fungal exudate; and the effectiveness of granular formulations of microsclerotia (MS) and blastospores(BLS) to control cattle ticks. In the thermal tolerance test, conidial suspensions of the fungus were exposed to 25 ° C, 40 ° C and 45 ° C, for 2h, 4h, 8h and 12h, the germination was evaluated after incubation for 48h at 28 ± 1 ° C, and also the cold activity of the isolates (at 5 ºC for 14 days) were evaluated, based on that, thermal tolerant isolates were selected. For the study of endophytic colonization, seeds, root, stem, and leaf of V. radiata were treated with fungus suspensions, and the colonization of the plant tissues by different isolates was evaluated. In the gene expression assay, after cultivating the fungus on minimal medium (MM), potato dextrose agar (BDA) and on the plant, the expression of the mad2 gene was observed. To assess the effect of Metarhizium sp. exudate on ticks and bacteria, the liquid resulting from colonies exudation was collected. Then, using disk diffusion test, the effect on strains of two bacteria isolated from the soil and on resistant and sensitive strains of Staphylococcus and Escherichia coli was evaluated. For the action on ticks, the fungal exudate was inoculated in tick females and the biological parameters, mortality, and immune response of the arthropod were evaluated. Finally, for the test with MS and BLS granular formulations, pots containing Urochloa decumbens were used and their soil was treated with the granular formulations, where later R. microplus females were introduced and the mortality, the number of larvae obtained in each group, as well as the persistence of the fungus in the soil were evaluated. As regards to the results, in the thermal tolerance test, all Metarhizium spp. isolates tested germinated more than 90% after 12h at 40 °C and after the be cooled, been considered good isolates those that did not suffer drastic variation in germination over the time of exposure. When evaluated the ability to colonize V. radiata, all tested isolates were able to colonize roots, stems, and leaves, with variation in the colonization of different tissues. When the fungus developed on the plant, the mad2 gene was more expressed than in PDA, but it was in the MM that the gene obtained greater expression. The fungal exudate was also able to inhibit the growth of the resistant and sensitive strains of Staphylococcus spp., and it affected more the strains of bacteria isolated from the soil than the others. The exudate also directly affected engorged R. microplus females, reducing the cellular response, causing death, and decreased egg production. The treatment with different concentrations of granular formulations of M. robertsii proved to be effective in controlling the cattle tick under the conditions tested and the fungus isolate colonized U. decumbens rhizosphere. This study provides data about the application of Metarhizium spp. in the soil and contributes to future research, showing the bioprospecting of this microorganism.

Compatibilidade de Heterorhabditis amazonensis (Rhabditida: Heterorhabditidae) isolado RSC-5 com diferentes carrapaticidas utilizados no controle de Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae) / Compatibility of Heterorhabditis amazonensis (Rhabditida: Heterorhabditidae) strain RSC-5 with different acaricides used for the control of Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae)

O estudo teve como objetivo avaliar a viabilidade de Heterorhabditis amazonensis isolado RSC-5 após exposição a diferentes carrapaticidas utilizados no controle de Rhipicephalus microplus. Foram constituídos seis tratamentos, cada um composto por um produto, sendo cada grupo com 75.000 nematoides (NEPs) em suspensão de 20 mL de solução de diferentes carrapaticidas, em concentração comercial. O controle foi formado por 75.000 NEPs e 20 mL de água destilada, e todos os grupos foram mantidos em câmara climatizada a 25°C. A avaliação do percentual de sobrevivência e infectividade em lagartas Galleria mellonella foi realizada 24 e 72 horas após o início do experimento. A mortalidade de lagartas no teste de infectividade foi analisada após 72 e 120 horas. Com 24 horas de exposição, o percentual de sobrevivência de H. amazonensis RSC-5 não foi significativamente reduzido (p > 0,05) somente na exposição ao princípio ativo deltametrina. O mesmo foi observado no período de 72 horas em relação à associação clorpirifós + cipermetrina + butóxido de piperonila + citronelal. Não foi constatada sobrevivência de nenhum juvenil infectivo nos grupos expostos à associação clorfenvinfós + diclorvós. A exposição ao clorfenvinfós resultou em percentual de sobrevivência inferior a 50% após 72 horas. O potencial de infectar lagartas de G. mellonella foi reduzido apenas no grupo tratado com o princípio ativo clorfenvinfós. Dessa forma, é possível concluir que o princípio ativo clorfenvinfós e a associação clorfenvinfós + diclorvós não foram compatíveis com H. Amazonenses RSC-5, causando redução no percentual de sobrevivência e infectividade dos juvenis desse nematoide. Os outros produtos foram compatíveis, não causando redução na infectividade do isolado testado.(AU)

The aim of this study was to assess the viability of Heterorhabditis amazonensis strain RSC-5 after exposure to different acaricides used for Rhipicephalus microplus control. Six treatment groups were formed, one for each product. Each group was composed of 75,000 nematodes in a 20 mL solution of different acaricides, at commercial concentration. The control group was formed by the same number of nematodes in 20 mL of distilled water. All the groups were kept in a climate-controlled chamber at 25°C. The percentage of survival and infectivity in Galleria mellonella caterpillars were determined 24 and 72 hours after the beginning of the experiment. The mortality of the caterpillars in the infectivity test was assessed 72 and 120 hours. After 24 hours of exposure, only the active ingredient deltamethrin did not significantly reduce the survival percentage of H. amazonensis RSC-5 (p > 0.05). The same was observed after 72 hours of exposure to the combination of chlorpyriphos + cypermethrin + piperonyl butoxide + citronellal. There was no survival of infective juveniles in the groups exposed to the combination of chlorphenvinphos + dichlorvos. The exposure to chlorphenvinphos for 72 hours resulted in 50% of mortality. The potential to infect G. mellonella caterpillars was only reduced in the group treated with the active ingredient chlorphenvinphos. Chlorphenvinphos and the combination of chlorphenvinphos + dichlorvos were not compatible with H. amazonensis RSC-5, causing a reduction in the survival and infectivity of juveniles of this nematode, while the other products were compatible, causing no reduction in the infectivity of this isolate.(AU)

Compatibilidade de Heterorhabditis amazonensis (Rhabditida: Heterorhabditidae) isolado RSC-5 com diferentes carrapaticidas utilizados no controle de Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae) / Compatibility of Heterorhabditis amazonensis (Rhabditida: Heterorhabditidae) strain RSC-5 with different acaricides used for the control of Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae)

O estudo teve como objetivo avaliar a viabilidade de Heterorhabditis amazonensis isolado RSC-5 após exposição a diferentes carrapaticidas utilizados no controle de Rhipicephalus microplus. Foram constituídos seis tratamentos, cada um composto por um produto, sendo cada grupo com 75.000 nematoides (NEPs) em suspensão de 20 mL de solução de diferentes carrapaticidas, em concentração comercial. O controle foi formado por 75.000 NEPs e 20 mL de água destilada, e todos os grupos foram mantidos em câmara climatizada a 25°C. A avaliação do percentual de sobrevivência e infectividade em lagartas Galleria mellonella foi realizada 24 e 72 horas após o início do experimento. A mortalidade de lagartas no teste de infectividade foi analisada após 72 e 120 horas. Com 24 horas de exposição, o percentual de sobrevivência de H. amazonensis RSC-5 não foi significativamente reduzido (p > 0,05) somente na exposição ao princípio ativo deltametrina. O mesmo foi observado no período de 72 horas em relação à associação clorpirifós + cipermetrina + butóxido de piperonila + citronelal. Não foi constatada sobrevivência de nenhum juvenil infectivo nos grupos expostos à associação clorfenvinfós + diclorvós. A exposição ao clorfenvinfós resultou em percentual de sobrevivência inferior a 50% após 72 horas. O potencial de infectar lagartas de G. mellonella foi reduzido apenas no grupo tratado com o princípio ativo clorfenvinfós. Dessa forma, é possível concluir que o princípio ativo clorfenvinfós e a associação clorfenvinfós + diclorvós não foram compatíveis com H. Amazonenses RSC-5, causando redução no percentual de sobrevivência e infectividade dos juvenis desse nematoide. Os outros produtos foram compatíveis, não causando redução na infectividade do isolado testado.(AU)

The aim of this study was to assess the viability of Heterorhabditis amazonensis strain RSC-5 after exposure to different acaricides used for Rhipicephalus microplus control. Six treatment groups were formed, one for each product. Each group was composed of 75,000 nematodes in a 20 mL solution of different acaricides, at commercial concentration. The control group was formed by the same number of nematodes in 20 mL of distilled water. All the groups were kept in a climate-controlled chamber at 25°C. The percentage of survival and infectivity in Galleria mellonella caterpillars were determined 24 and 72 hours after the beginning of the experiment. The mortality of the caterpillars in the infectivity test was assessed 72 and 120 hours. After 24 hours of exposure, only the active ingredient deltamethrin did not significantly reduce the survival percentage of H. amazonensis RSC-5 (p > 0.05). The same was observed after 72 hours of exposure to the combination of chlorpyriphos + cypermethrin + piperonyl butoxide + citronellal. There was no survival of infective juveniles in the groups exposed to the combination of chlorphenvinphos + dichlorvos. The exposure to chlorphenvinphos for 72 hours resulted in 50% of mortality. The potential to infect G. mellonella caterpillars was only reduced in the group treated with the active ingredient chlorphenvinphos. Chlorphenvinphos and the combination of chlorphenvinphos + dichlorvos were not compatible with H. amazonensis RSC-5, causing a reduction in the survival and infectivity of juveniles of this nematode, while the other products were compatible, causing no reduction in the infectivity of this isolate.(AU)

Compatibilidade de Heterorhabditis amazonensis (Rhabditida: Heterorhabditidae) isolado RSC-5 com diferentes carrapaticidas utilizados no controle de Rhipicephalus microplus(Acari: Ixodidae)

The aim of this study was to assess the viability of Heterorhabditisamazonensis strain RSC-5 after exposure to different acaricides used for Rhipicephalusmicropluscontrol. Six treatment groups were formed, one for each product. Each group was composed of 75,000 nematodes in a 20 mL solution of different acaricides, at commercial concentration. The control group was formed by the same number of nematodes in 20 mL of distilled water. All the groups were kept in a climate-controlled chamber at 25°C. The percentage of survival and infectivity in Galleria mellonella caterpillars were determined 24 and 72 hours after the beginning of the experiment. The mortality of the caterpillars in the infectivity test was assessed 72 and 120 hours. After 24 hours of exposure, only the active ingredient deltamethrin did not significantly reduce the survival percentage of H. amazonensis RSC-5 (p > 0.05). The same was observed after 72 hours of exposure to the combination of chlorpyriphos + cypermethrin + piperonyl butoxide + citronellal. There was no survival of infective juveniles in the groups exposed to the combination of chlorphenvinphos + dichlorvos. The exposure to chlorphenvinphos for 72 hours resulted in 50% of mortality. The potential to infect G. mellonella caterpillars was only reduced in the group treated with the active ingredient chlorphenvinphos. Chlorphenvinphos and the combination of chlorphenvinphos + dichlorvos were not compatible with H. amazonensisRSC-5, causing a reduction in the survival and infectivity of juveniles of this nematode, while the other products were compatible, causing no reduction in the infectivity of this isolate.

O estudo teve como objetivo avaliar a viabilidade de Heterorhabditisamazonensis isolado RSC-5 após exposição a diferentes carrapaticidas utilizados no controle de Rhipicephalusmicroplus. Foram constituídos seis tratamentos, cada um composto por um produto, sendo cada grupo com 75.000 nematoides (NEPs) em suspensão de 20 mL de solução de diferentes carrapaticidas, em concentração comercial. O controle foi formado por 75.000 NEPs e 20 mL de água destilada, e todos os grupos foram mantidos em câmara climatizada a 25°C. A avaliação do percentual de sobrevivência e infectividade em lagartas Galleria mellonella foi realizada 24 e 72 horas após o início do experimento. A mortalidade de lagartas no teste de infectividade foi analisada após 72 e 120 horas. Com 24 horas de exposição, o percentual de sobrevivência de H. amazonensis RSC-5 não foi significativamente reduzido (p > 0,05) somente na exposição ao princípio ativo deltametrina. O mesmo foi observado no período de 72 horas em relação à associação clorpirifós + cipermetrina + butóxido de piperonila + citronelal. Não foi constatada sobrevivência de nenhum juvenil infectivo nos grupos expostos à associação clorfenvinfós + diclorvós. A exposição ao clorfenvinfós resultou em percentual de sobrevivência inferior a 50% após 72 horas. O potencial de infectar lagartas de G. mellonella foi reduzido apenas no grupo tratado com o princípio ativo clorfenvinfós. Dessa forma, é possível concluir que o princípio ativo clorfenvinfós e a associação clorfenvinfós + diclorvós não foram compatíveis com H. AmazonensesRSC-5, causando redução no percentual de sobrevivência e infectividade dos juvenis desse nematoide. Os outros produtos foram compatíveis, não causando redução na infectividade do isolado testado.

Resistance to cypermethrin and amitraz in Rhipicephalus (Boophilus) microplus on the Santa Catarina Plateau, Brazil / Situação da resistência do Rhipicephalus (Boophilus) microplus à cipermetrina e amitraz no Planalto Catarinense, Brasil

With the objective of evaluating Rhipicephalus (Boophilus) microplus resistance to cipermetrina and amitraz, were collected engorged tick females from cattle on 20 farms on the Santa Catarina Plateau, in southern Brazil, between January of 2004 and May of 2006. Were also received 20 groups of engorged R. (B.) microplus females, collected by cattle farmers requesting acaricidal efficacy (AE) testing. Were performed in vitro tests, which consisted of immersing engorged females in cypermethrin (0.015%) and in amitraz (0.025%). An AE >95% was considered indicative of effectiveness. Of the 20 collected groups, 18 (90%) showed cypermethrin resistance and 1 (5%) showed amitraz resistance. Of the 20 received groups, 19 (95%) showed cypermethrin resistance and 2 (10%) showed amitraz resistance. The AE of cypermethrin was found to be >95%, 85-94%, and 55-64%, respectively, in 4 (57.1%), 2 (28.6%), and 1 (14.3%) of 7 reference groups, collected in the 1997-2001 period. The AE of amitraz was >95% in all of those groups. Among the groups of specimens received for analysis in that period, the AE of amitraz was >95% in 6 (85.71%) and 75-84% in 1 (14.28%). R. (B.) microplus resistance to acaricides is increasing on the Santa Catarina Plateau.(AU)

Com os objetivos de avaliar a resistência do Rhipicephalus (Boophilus) microplus à cipermetrina e ao amitraz no Planalto Catarinense, no período de janeiro de 2004 a maio de 2006, foram coletadas teleóginas em bovinos de 20 propriedades onde os produtores autorizaram a coleta (amostras por conveniência) e recebidas teleóginas de mais 20 propriedades com objetivo de diagnóstico de eficácia. Os testes in vitro foram realizados por imersão de teleóginas em cipermetrina (0,015%) e amitraz (0,025%). Considerando a eficácia igual ou superior a 95%, das 20 propriedades amostradas, 18 (90%) apresentaram resistência à cipermetrina e uma (5%) ao amitraz. Das 20 propriedades com teleóginas para diagnóstico, 19 (95%) apresentaram resistência à cipermetrina e duas (10%) ao amitraz. No período de agosto de 1997 a dezembro de 2001, das sete amostras coletadas, em quatro (57,1%) a eficácia da cipermetrina foi >95%, em duas (28,6%) entre 85% e 94% e em uma, (14,3%) entre 55% e 64%. A eficácia do amitraz foi >95%, em teleóginas de todas as propriedades. Nas amostras para diagnóstico, seis (85,71%) apresentaram eficácia para o amitraz >95% e uma (14,28%) entre 75% e 84%. A resistência desse ixodídeo aos carrapaticidas testados é crescente no Planalto Catarinense.(AU)

Avaliação da morfologia, virulência e atividades proteolítica e lipolítica de isolados de Beauveria bassiana s.l. antes e após reisolamento em Rhipicephalus microplus

Beauveria bassiana sensu lato (s.l.) é um fungo cosmopolita de grande importância agrícola. Seu uso na pecuária como biocontrolador de Rhipicephalus microplus apresenta bons resultados. Dentro deste contexto, estudos que associem a análise do desenvolvimento e do metabolismo fúngico permitem selecionar isolados de melhor potencial artropodopagênico. O presente estudo avaliou a morfologia, virulência e atividades enzimáticas de dez isolados brasileiros de B. bassiana s.l. antes (grupo Micoteca) e após reisolamento (grupo Reisolado) através de um ciclo de crescimento sobre R. microplus. Para a morfologia, foram realizadas análises macromorfológicas, através de ponto único de inóculo; micromorfológicas, a partir do cultivo entre lâmina e lamínula, e avaliação da produção de conídios. A virulência foi avaliada a partir da observação dos parâmetros biológicos de fêmeas ingurgitadas de R. microplus após imersão em suspensões aquosas de B. bassiana s.l. (108 e 107 conídios/mL). As atividades proteolítica (semi-quantitativa, total, Pr1 e Pr2) e lipolítica (-nitrofenil palmitato) foram realizadas após 72 horas de crescimento dos fungos em meio mínimo. A estatística dos experimentos foi realizada comparando os dados antes e após reisolamento para determinar os isolados de maior potencial patogênico, além de observar o efeito de uma passagem sobre um hospedeiro em potencial. Os dados paramétricos foram avaliados pela análise de variância (ANOVA) seguida do teste de Tukey e os não paramétricos pelo teste de Kruskal Wallis seguido de Student-Newman-Keuls (SNK) com nível de significância de 5%. Quando comparados entre si antes do reisolamento, foram observadas diferenças morfológicas, de virulência e atividades enzimáticas entre os isolados. CG 481 e CG 206 apresentaram os maiores percentuais de controle (65,75% e 61,65%, respectivamente), embora não tenham demonstrado alta atividade enzimática. Quanto ao reisolamento fúngico, o processo alterou em pequena escala a morfologia e a virulência. Em relação à atividade enzimática, a maioria dos isolados elevaram a atividade proteolítica específica Pr2 e a atividade lipolítica. Isolados como Bb 02 e CG 500 foram aqueles que mais sofreram influência após um ciclo de crescimento. Bb 02 aumentou em 1,9 vezes o percentual de controle (15,8% para 30,6%), elevando a produção de conídios e tornando as colônias mais pulverulentas. Além do mais, foi evidenciado também o aumento de todas as atividades enzimáticas (6,3 vezes para Pr1; 2,4 vezes para Pr2 e 9 vezes para atividade lipásica). Em contrapartida, CG 500 reduziu em 4,8 vezes o percentual de controle, além de alterar macromorfologicamente as colônias. As atividades enzimáticas também foram reduzidas em 3,6 vezes para Pr1; 1,2 vezes para Pr2 e 1,6 vezes para a atividade lipásica. Portanto, conclui-se que um ciclo de crescimento de B. bassiana s.l. sobre R. microplus foi capaz de alterar alguns dos isolados avaliados, embora mais passagens pelo hospedeiro sejam necessárias para propiciar resultados mais relevantes. Além disto, o estudo de outras enzimas como as quitinases, a produção de toxinas e a hidrofobicidade dos conídios devem ser considerados na determinação da eficácia fúngica.

Beauveria bassiana sensu lato (s.l.) is a cosmopolitan fungus of great importance in agriculture. Good results are obtained when this microrganism is used as a biocontrol of Rhipicephalus microplus. In this context, studies involving the analysis of the development and fungal metabolism enable to select arthropodopatogenic isolates with better potencial. The aim of this study was to evaluate the morphology, virulence and enzymatic activities of ten B. bassiana s.l. isolates before (Micoteca group) and after reisolation (Reisolado group) through one passage (one cycle) on R. microplus. For morphology was analyzed: macromorphology, performed using the single point of inoculum; micromorphology, with cultivation between slide and cover slip and conidia production. The virulence before and after reisolation was evaluated by observing the biological parameters of R. microplus engorged females after immersion in B. bassiana s.l. aqueous suspensions (108 and 107 conidia mL-1). The proteolytic (semi-quantitative, total, Pr1 and Pr2) and lipolytic activities (-nitrophenyl palmitate) were performed after 72 hours of fungal growth on minimal medium. The statistical analysis of the experiments was performed by comparing the data before and after reisolation for determining isolates with greater pathogenic potential and observing the effect of one passage to the potential host. Parametric data were evaluated by analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey test and nonparametric data by Kruskal-Wallis test followed by Student-Newman-Keuls test (SNK) with 5% significance. When compared to each other before reisolation, morphological, virulence and enzymatic activities differences were observed among the isolates. CG 481 and CG 206 showed the highest control percentage (65.75% and 61.65%, respectively), although do not show the highest enzyme activity. After fungal reisolation, the process changed in small-scale the morphology and virulence. In enzymatic activity, most isolates increased the Pr2 and the lipase activities. Isolates as Bb 02 and CG 500 were those who suffered most influence after growth cycle. Bb 02 increased 1.9 times the control percentage (15.8% to 30.6%), incrementing the conidia production and making colonies that are more powdery. For this isolate was also evidenced an increase in all the enzyme activities (6.3 times to Pr1; 2.4 times to Pr2 and 9 times to lipase activity). Differently, CG 500 reduced 4.8 times the control percentage and changed the macromorphology. The enzymatic activities were also reduced by 3.6 times to Pr1; 1.2 times to Pr2 and 1.6 times to lipase activity. Therefore, the study concluded that one B. bassiana s.l. passage on R. microplus was able to change some of the isolates, although more passes by the host are necessary to provide relevant results with other isolates. Moreover, the study of enzymes such as chitinases, production of toxins and hydrophobicity of conidia should be considered to determine the fungal effectiveness.