Collagenase from smooth weakfish: extraction, partial purification, characterization and collagen specificity test for industrial application / Colagenase de pescada branca: extração, purificação parcial, caracterização e teste de especificidade ao colágeno para aplicação industrial

Fish processing residues are rich sources of biomolecules with industrial potential, such as enzymes with collagenolytic properties applied in the pharmaceutical, textile and leather sectors. Here, collagenolytic serine proteases were partially purified from the waste (viscera) of smooth weakfish Cynoscion leiarchus and characterized for the purpose of obtaining a value-added product from fisheries resources. The higher activity of the enzyme (72.5 U mL-1) was verified in optimal temperature and pH of 55oC and 8.0, respectively. The enzyme was stable in wide ranges of temperature (25-60oC) and pH (6.5 to 11.5). The ions Ca2+ and Mg2+ increased the protease activity, whilst Pb2+, Al3+ and Cu2+ had an inhibitory effect, as observed in the presence of Benzamidine and TLCK (inhibitors of serine proteases). Hydrolysis was detected after 48 hours, when the enzyme and bovine collagen type I were incubated together. Thus, digestive viscera of C. leiarchus is suggested as an alternative source of enzymes capable of cleaving type I collagen, with similar biochemical properties to bacterial collagenases commonly employed in industrial processes, reducing costs, adding value to the fisheries product and minimizing the environmental impact caused by its waste.(AU)

Resíduos do processamento do pescado são fontes ricas em biomoléculas com potencial industrial, como as enzimas com propriedades colagenolíticas empregadas nos segmentos farmacêuticos, têxteis e de couro. No presente trabalho, serino-proteases colagenolíticas dos resíduos (vísceras) do processamento de pescada-branca, Cynoscion leiarchus, foram parcialmente purificadas e caracterizadas, visando à obtenção de um produto de valor agregado, maximizando o aproveitamento de recursos pesqueiros. A atividade da melhor etapa de extração foi 72,5 U mL- 1 , com temperatura e pH ótimos de 55oC e 8.0, respectivamente. A enzima manteve-se estável em faixas amplas de temperatura (25-60oC) e pH (6,5-11,5). Os íons Ca2+ e Mg2+ aumentaram a atividade proteolítica, ao passo que Pb2+, Al3+ e Cu2+ inibiram essa atividade assim como os inibidores de serino-proteases (Benzamidina e TLCK). A hidrólise foi detectada após 48h de incubação com colágeno bovino tipo I. Assim, sugere-se vísceras digestivas de C. leiarchus como fonte alternativa para o fornecimento de enzimas com capacidade de clivar o colágeno do tipo I e com propriedades bioquímicas semelhantes às colagenases bacterianas já empregadas nas etapas de processamento industrial, como forma de redução de custo, agregação de valor ao produto pesqueiro e contribuindo para minimizar o impacto ambiental deste tipo de resíduo.(AU)

Collagenase from smooth weakfish: extraction, partial purification, characterization and collagen specificity test for industrial application / Colagenase de pescada branca: extração, purificação parcial, caracterização e teste de especificidade ao colágeno para aplicação industrial

Fish processing residues are rich sources of biomolecules with industrial potential, such as enzymes with collagenolytic properties applied in the pharmaceutical, textile and leather sectors. Here, collagenolytic serine proteases were partially purified from the waste (viscera) of smooth weakfish Cynoscion leiarchus and characterized for the purpose of obtaining a value-added product from fisheries resources. The higher activity of the enzyme (72.5 U mL-1) was verified in optimal temperature and pH of 55oC and 8.0, respectively. The enzyme was stable in wide ranges of temperature (25-60oC) and pH (6.5 to 11.5). The ions Ca2+ and Mg2+ increased the protease activity, whilst Pb2+, Al3+ and Cu2+ had an inhibitory effect, as observed in the presence of Benzamidine and TLCK (inhibitors of serine proteases). Hydrolysis was detected after 48 hours, when the enzyme and bovine collagen type I were incubated together. Thus, digestive viscera of C. leiarchus is suggested as an alternative source of enzymes capable of cleaving type I collagen, with similar biochemical properties to bacterial collagenases commonly employed in industrial processes, reducing costs, adding value to the fisheries product and minimizing the environmental impact caused by its waste.

Resíduos do processamento do pescado são fontes ricas em biomoléculas com potencial industrial, como as enzimas com propriedades colagenolíticas empregadas nos segmentos farmacêuticos, têxteis e de couro. No presente trabalho, serino-proteases colagenolíticas dos resíduos (vísceras) do processamento de pescada-branca, Cynoscion leiarchus, foram parcialmente purificadas e caracterizadas, visando à obtenção de um produto de valor agregado, maximizando o aproveitamento de recursos pesqueiros. A atividade da melhor etapa de extração foi 72,5 U mL- 1 , com temperatura e pH ótimos de 55oC e 8.0, respectivamente. A enzima manteve-se estável em faixas amplas de temperatura (25-60oC) e pH (6,5-11,5). Os íons Ca2+ e Mg2+ aumentaram a atividade proteolítica, ao passo que Pb2+, Al3+ e Cu2+ inibiram essa atividade assim como os inibidores de serino-proteases (Benzamidina e TLCK). A hidrólise foi detectada após 48h de incubação com colágeno bovino tipo I. Assim, sugere-se vísceras digestivas de C. leiarchus como fonte alternativa para o fornecimento de enzimas com capacidade de clivar o colágeno do tipo I e com propriedades bioquímicas semelhantes às colagenases bacterianas já empregadas nas etapas de processamento industrial, como forma de redução de custo, agregação de valor ao produto pesqueiro e contribuindo para minimizar o impacto ambiental deste tipo de resíduo.

Protease with collagenolytic activity produced by Bacillus sp. DPUA 1728 from Amazonian soil

Qualitative analyses were carried out on solid medium with insoluble collagen 0.25% (w/v) to detect proteases with collagenolytic activity produced by Bacillus sp. In cultures incubated for 24 h, a 23 full factorial design with four repetitions at the center point was developed to analyze the effects and interactions between initial pH, temperature and the concentration of gelatin. Based on the results of the first 23 full factorial design, a successive 23 full factorial design was performed. The most favorable production conditions were found to be 1.5% (w/v) gelatin, pH 9.0 and 37 °C with enzymatic activity of 86.27 U/mL. The enzyme showed optimal activity at 50 °C and pH 9.0, and it was stable over wide pH (7.2-10.0) and temperature (45 °C-60 °C) ranges. These results indicate that Bacillus sp DPUA 1728 is a potential source for producing collagenolytic protease with possible biotechnological applications, such as in the food, cosmetics and leather industries.(AU)

PRODUÇÃO E EXTRAÇÃO DE PROTEASES COLAGENOLÍTICAS OBTIDAS DE Aspergillus heteromorphus URM 0269 E SUA IMOBILIZAÇÃO EM ALGINATO

Este trabalho objetivou produzir, imobilizar em alginato de cálcio, extrair em sistemas de duas fases aquosas (PEG/Citrato) e caracterizar proteases colagenolíticas obtidas de Aspergillus heteromorphus URM 0269. Para tanto, no primeiro momento, realizou-se uma fermentação em estado sólido (planejamento fatorial 22); obtendo-se a melhor condição de produção (3g de farelo de trigo e 20% de umidade, submetidos a 30ºC após 96 horas de fermentação, com atividade proteolítica e colagenolítica de 41,36 U/mL e 401,06 U/mL, respectivamente). A protease colagenolítica contida no extrato enzimático foi imobilizada por aprisionamento em esferas de alginato, sendo realizado um planejamento fatorial 22 onde foi obtido as melhores condições (CaCl2 0,6M; Alginato de sódio 4%), apresentando rendimento de 82,82% para atividade proteolítica e 94,58% de atividade colagenolítica. Esta enzima imobilizada reteve mais de 40% da atividade residual no terceiro ciclo e apresentou 36,82% de perda da atividade após 7 dias de armazenamento a 4°C. Também foram analisados pH e temperatura ótima, bem como as estabilidades. No segundo momento, foi realizado um planejamento fatorial (24) para purificação da protease colagenolítica utilizando o Sistema de duas fases aquosas (SDFA), tendo como variáveis independentes: massa molar de PEG (MPEG), concentração de PEG (CPEG), concentração de citrato de sódio (CCIT) e pH. Posteriormente, a protease extraída por SDFA foi utilizada para hidrólise da azocaseína e caracterizada em termos de parâmetros bioquímicos, cinéticos e termodinâmicos. A enzima foi particionada preferencialmente para a fase rica em PEG cujo maior fator de purificação e recuperação (PF = 7.8 e Y= 157.5%) foi obtido usando MPEG 8000 g/mol, CPEG 24%, CCIT 15% e pH 8,0, apresnetando-se estável a temperaturas de 10 a 30°Ce condições de pH de 5,0 a 6,0. A enzima particionada foi inibida parcialmente por PMSF. Os parâmetros cinéticos de ativação para hidrólise da azocaseína revelaram afinidade por azocaseína (KM = 2,8 mg/mL) com taxa máxima de catálise de 45,0 U/mL. A energia de ativação da reação e a variação de entalpia padrão do desenvolvimento da enzima foram de 24,2 e 54,2 kJ/mol, respectivamente. A hidrólise de caseína catalisada por protease a 25°C mostrou energia livre de Gibbs de ativação, entalpia e entropia de 65,8 kJ/mol, 21,8 kJ/mol e -146,7 J/mol.K, respectivamente. Os parâmetros termodinâmicos da termoinativação da protease no SDFA sugerem um mecanismo predominante de desdobramento reversível, uma vez que a inativação da energia livre de Gibbs aumentou de 91,0 para 102,3 kJ/mol. A fermentação em estado sólido foi eficaz com alta produção enzimática e a imobilização da protease colagenolítica em alginato de cálcio, mostrou ser um método eficiente no rendimento, armazenamento e reuso da enzima. Através de um processo rápido e econômico, a enzima foi purificada por SDFA, permitindo a remoção de contaminantes no extrato enzimático obtido de Aspergillus heteromorphus URM0269. Esses resultados indicam o potencial da protease colagenolítica a ser explorada em aplicações biotecnólogicas, como nas indústrias de curtume, de tenderização de carnes e uso biomédico.

This work aimed to produce, immobilize in calcium alginate, extract in two-phase aqueous systems (PEG/Citrate) and characterize collagenolytic proteases obtained from Aspergillus heteromorphus URM 0269. Therefore, in chapter I, a solid state fermentation was carried out using a factorial design 22; the best production condition was: 3g of wheat bran, 20% moisture, submitted to 30°C after 96 hours of fermentation, with a proteolytic and collagenolytic activity of 41.36 U/mL and 401.06 U/mL, respectively. The collagenolytic protease contained in the enzymatic extract was immobilized by imprisonment in alginate beads, and a factorial design 22 was carried out where the best conditions were obtained (0.6M CaCl2; 4% sodium alginate) for further analysis of yield, reuse, stability of storage and biochemical characterization. In this best test there was a yield of 82.82% for proteolytic activity and 94.58% of collagenolytic activity. This immobilized enzyme retained more than 40% of the residual activity in the third cycle and showed only 36.82% loss of activity after 7 days of storage at 4°C. Optimum pH and temperature, as well as stability, were also analyzed. In chapter II, a factorial design (24) was carried out for purification of the collagenolytic protease using the aqueous two-phase system (ATPS), where it was possible to evaluate the interaction of the independent variables: molar mass of PEG (MPEG), concentration of PEG (CPEG), sodium citrate concentration (CCIT) and pH. Subsequently, the protease extracted by ATPS was used for the hydrolysis of azocasein and characterized in terms of biochemical, kinetic and thermodynamic parameters. The enzyme was preferentially partitioned for the PEG-rich phase whose greatest purification and recovery factor (PF = 7,8 and Y = 157,5%) was obtained using MPEG 8000 g / mol, CPEG 24%, CCIT 15% and pH 8,0. Although the enzyme acted ideally at 50°C and pH 8.0, it was more stable at lower temperatures (10-30 °C) and acidic pH conditions (5.0-6.0). The purified enzyme was inhibited by PMSF, classifying it as a serine protease. The kinetic activation parameters for azocasein hydrolysis revealed greater affinity for azocasein (KM = 2.8 mg / mL) with a maximum catalysis rate of 45.0 U/mL. The reaction activation energy and the standard enthalpy variation of the enzyme development were 24.2 and 54.2 kJ/mol, respectively. Protease catalyzed hydrolysis at 25°C showed Gibbs free energy of activation, enthalpy and entropy of 65.8 kJ/mol, 21.8 kJ/mol and -146.7 J/mol.K, respectively. The thermodynamic parameters of the protease thermoactivation in the ATPS suggest a predominant reversible unfolding mechanism, since the inactivation of Gibbs free energy increased from 91.0 to 102.3 kJ/mol. Solid state fermentation was effective with high enzymatic production. The immobilization of collagenolytic protease in calcium alginate, proved to be an efficient method in the yield, storage and reuse of the enzyme. Through a fast and economical process, the enzyme was purified by ATPS, allowing the removal of contaminants in the enzymatic extract obtained from Aspergillus heteromorphus URM0269. These results indicate the potential of collagenolytic protease to be explored in biotechnological applications, such as in the tannery and detergent industries.

Avaliação do potencial biotecnológico de Aspergillus ochraceus URM604 e Aspergillus sclerotiorum URM5792

Proteases são enzimas pertencentes ao grupo das hidrolases sendo capazes de degradar ligações peptídicas. Algumas destas enzimas possuem especificidade por determinado tipo de substrato, como é o caso de proteases colagenolíticas, atuando na hidrólise de diversos tipos de colágeno. Ou ainda proteases com atividade fibrinolítica, responsáveis pela dissolução dos coágulos de fibrina. Desta forma a procura por novas enzimas e processos mais simples e com menos custos de produção e purificação são incessantes. Nesta perspectiva a utilização de substratos de baixo custo e resíduos agroindustriais em processos fermentativos é uma alternativa para diminuir os gastos na produção enquanto aumenta a eficiência desta etapa. O uso de coprodutos e resíduos agroindustriais como substratos associados a técnica de fermentação em estado sólido (FES), favorece ainda o crescimento de fungos filamentosos, excelentes produtores de enzimas em geral, levando em consideração a diversidade biossistemática e a variedade de enzimas possivelmente produzidas por estes microrganismos. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o potencial biotecnológico dos fungos Aspergillus sclerotiorum URM5792 e Aspergillus ochraceus URM604 através da FES. Além de purificar a enzima alvo por meio de processos cromatográficos e realizar atividades específicas. Na avaliação do potencial biotecnológico de A. scleroriorum foi realizada a identificação da atividade proteolítica (122,71 U/mL) e colagenolítica (16,80 U/mL). As amostras passaram por processo de purificação por meio de precipitação cetônica, onde foi verificada atividade proteásica de 358 U/mL e colagenolítica de 48,63 U/mL, Cromatografia de troca iônica DEAE-Sephadex seguida por SuperdexG75 em sistema FPLC, onde foi alcançada recuperação de 92,8% e atividade proteolítica de 602,38U/mL e colagenolítica de 679,44U/mL. Em relação a caracterização parcial, realizada a partir de atividade colagenolítica, foi observado pH ótimo alcalino (8) e temperatura ótima de 45°C. Já em relação a espécie A. ochraceus foram avaliadas as atividades proteásica, colagenolítica e fibrinolítica, obtendo-se resultados promissores (815,33 U/mL 47,33 U/mL e 21,78 U/mL, respectivamente). A metodologia para purificação da protease seguiu os mesmos parâmetros descritos acima para o A. scleroriorum e atingiu-se recuperação de 131,35% (436,67 U/mL) nas amostras obtidas a partir da cromatografia de troca iônica DEAE-Sephadex e atividade de 186,66 U/mL com recuperação de 40% nas amostras eluidas da coluna Superdex G75 em sistema FPLC. Os microrganismos estudados foram considerados eficientes para a produção de protease com potencial biotecnológico através da FES utilizando substratos de baixo custo, assim como resíduos agroindustriais.

Proteases are enzymes that belong to the group of hydrolases, they are able of degrading peptide bonds. Some of these enzymes have specificity for a particular type of substrate, such as collagenolytic proteases, acting on the hydrolysis of several types of collagen. There are also proteases with fibrinolytic activity, responsible for the dissolution of fibrin clots. Therefore, the search for new proteases and simpler processes with less production costs is ceaseless, ergo, the use of low-cost substrates and agro-industrial residues in fermentation processes is an alternative to reduce production costs while increasing the efficiency of this stage. Using these substrates associated with the solid-state fermentation technique (SSF) also favors the growth of filamentous fungi, excellent producers of enzymes in general, considering their diversity and the variety of possibly produced enzymes. Thus, this study aimed to evaluate the production of proteases by fungi Aspergillus sclerotiorum URM5792 and Aspergillus ochraceus URM604 through SSF. Furthermore, the protease went through chromatographic processes, characterization, and specific activities such as collagenolytic and fibrinolytic activity. The evaluation of the biotechnological potential of A. scleroriorum was carried out by identifying proteolytic (122.71 U/mL) and collagenolytic (16.80 U/mL) activity. The samples went through a purification process by means of ketone precipitation, where a protein activity of 358 U/mL and a collagenolytic activity of 48.63 U/mL were verified. It was also used DEAE-Sephadex ion exchange chromatography followed by SuperdexG75 in FPLC system, where 92.8% recovery was achieved, with proteolytic activity of 602.38 U/mL and collagenolytic activity of 679.44 U/mL. Regarding partial characterization, performed with collagenolytic activity, an optimum alkaline pH (8) and an optimum temperature of 45°C were observed. The species A. ochraceus, was evaluated with the following activities: proteinase, collagenolytic and fibrinolytic activity, obtaining promising results (815,33 U/mL, 47.33 U/mL and 21.78 U/mL, respectively). The methodology for purifying the protease followed the same parameters described above and it was found 131.35% recovery (436.67 U/mL) in the samples obtained from the DEAE-Sephadex ion exchange chromatography. It was also determined proteolytic activity of 186.66 U/mL with 40% recovery in samples eluted from the Superdex G-75 column in FPLC system. The microorganisms studied were considered efficient to produce protease with biotechnological potential through SSF using low cost substrates, as well as agroindustrial residues