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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-222179

Resumo

Este trabalho objetivou produzir, imobilizar em alginato de cálcio, extrair em sistemas de duas fases aquosas (PEG/Citrato) e caracterizar proteases colagenolíticas obtidas de Aspergillus heteromorphus URM 0269. Para tanto, no primeiro momento, realizou-se uma fermentação em estado sólido (planejamento fatorial 22); obtendo-se a melhor condição de produção (3g de farelo de trigo e 20% de umidade, submetidos a 30ºC após 96 horas de fermentação, com atividade proteolítica e colagenolítica de 41,36 U/mL e 401,06 U/mL, respectivamente). A protease colagenolítica contida no extrato enzimático foi imobilizada por aprisionamento em esferas de alginato, sendo realizado um planejamento fatorial 22 onde foi obtido as melhores condições (CaCl2 0,6M; Alginato de sódio 4%), apresentando rendimento de 82,82% para atividade proteolítica e 94,58% de atividade colagenolítica. Esta enzima imobilizada reteve mais de 40% da atividade residual no terceiro ciclo e apresentou 36,82% de perda da atividade após 7 dias de armazenamento a 4°C. Também foram analisados pH e temperatura ótima, bem como as estabilidades. No segundo momento, foi realizado um planejamento fatorial (24) para purificação da protease colagenolítica utilizando o Sistema de duas fases aquosas (SDFA), tendo como variáveis independentes: massa molar de PEG (MPEG), concentração de PEG (CPEG), concentração de citrato de sódio (CCIT) e pH. Posteriormente, a protease extraída por SDFA foi utilizada para hidrólise da azocaseína e caracterizada em termos de parâmetros bioquímicos, cinéticos e termodinâmicos. A enzima foi particionada preferencialmente para a fase rica em PEG cujo maior fator de purificação e recuperação (PF = 7.8 e Y= 157.5%) foi obtido usando MPEG 8000 g/mol, CPEG 24%, CCIT 15% e pH 8,0, apresnetando-se estável a temperaturas de 10 a 30°Ce condições de pH de 5,0 a 6,0. A enzima particionada foi inibida parcialmente por PMSF. Os parâmetros cinéticos de ativação para hidrólise da azocaseína revelaram afinidade por azocaseína (KM = 2,8 mg/mL) com taxa máxima de catálise de 45,0 U/mL. A energia de ativação da reação e a variação de entalpia padrão do desenvolvimento da enzima foram de 24,2 e 54,2 kJ/mol, respectivamente. A hidrólise de caseína catalisada por protease a 25°C mostrou energia livre de Gibbs de ativação, entalpia e entropia de 65,8 kJ/mol, 21,8 kJ/mol e -146,7 J/mol.K, respectivamente. Os parâmetros termodinâmicos da termoinativação da protease no SDFA sugerem um mecanismo predominante de desdobramento reversível, uma vez que a inativação da energia livre de Gibbs aumentou de 91,0 para 102,3 kJ/mol. A fermentação em estado sólido foi eficaz com alta produção enzimática e a imobilização da protease colagenolítica em alginato de cálcio, mostrou ser um método eficiente no rendimento, armazenamento e reuso da enzima. Através de um processo rápido e econômico, a enzima foi purificada por SDFA, permitindo a remoção de contaminantes no extrato enzimático obtido de Aspergillus heteromorphus URM0269. Esses resultados indicam o potencial da protease colagenolítica a ser explorada em aplicações biotecnólogicas, como nas indústrias de curtume, de tenderização de carnes e uso biomédico.

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This work aimed to produce, immobilize in calcium alginate, extract in two-phase aqueous systems (PEG/Citrate) and characterize collagenolytic proteases obtained from Aspergillus heteromorphus URM 0269. Therefore, in chapter I, a solid state fermentation was carried out using a factorial design 22; the best production condition was: 3g of wheat bran, 20% moisture, submitted to 30°C after 96 hours of fermentation, with a proteolytic and collagenolytic activity of 41.36 U/mL and 401.06 U/mL, respectively. The collagenolytic protease contained in the enzymatic extract was immobilized by imprisonment in alginate beads, and a factorial design 22 was carried out where the best conditions were obtained (0.6M CaCl2; 4% sodium alginate) for further analysis of yield, reuse, stability of storage and biochemical characterization. In this best test there was a yield of 82.82% for proteolytic activity and 94.58% of collagenolytic activity. This immobilized enzyme retained more than 40% of the residual activity in the third cycle and showed only 36.82% loss of activity after 7 days of storage at 4°C. Optimum pH and temperature, as well as stability, were also analyzed. In chapter II, a factorial design (24) was carried out for purification of the collagenolytic protease using the aqueous two-phase system (ATPS), where it was possible to evaluate the interaction of the independent variables: molar mass of PEG (MPEG), concentration of PEG (CPEG), sodium citrate concentration (CCIT) and pH. Subsequently, the protease extracted by ATPS was used for the hydrolysis of azocasein and characterized in terms of biochemical, kinetic and thermodynamic parameters. The enzyme was preferentially partitioned for the PEG-rich phase whose greatest purification and recovery factor (PF = 7,8 and Y = 157,5%) was obtained using MPEG 8000 g / mol, CPEG 24%, CCIT 15% and pH 8,0. Although the enzyme acted ideally at 50°C and pH 8.0, it was more stable at lower temperatures (10-30 °C) and acidic pH conditions (5.0-6.0). The purified enzyme was inhibited by PMSF, classifying it as a serine protease. The kinetic activation parameters for azocasein hydrolysis revealed greater affinity for azocasein (KM = 2.8 mg / mL) with a maximum catalysis rate of 45.0 U/mL. The reaction activation energy and the standard enthalpy variation of the enzyme development were 24.2 and 54.2 kJ/mol, respectively. Protease catalyzed hydrolysis at 25°C showed Gibbs free energy of activation, enthalpy and entropy of 65.8 kJ/mol, 21.8 kJ/mol and -146.7 J/mol.K, respectively. The thermodynamic parameters of the protease thermoactivation in the ATPS suggest a predominant reversible unfolding mechanism, since the inactivation of Gibbs free energy increased from 91.0 to 102.3 kJ/mol. Solid state fermentation was effective with high enzymatic production. The immobilization of collagenolytic protease in calcium alginate, proved to be an efficient method in the yield, storage and reuse of the enzyme. Through a fast and economical process, the enzyme was purified by ATPS, allowing the removal of contaminants in the enzymatic extract obtained from Aspergillus heteromorphus URM0269. These results indicate the potential of collagenolytic protease to be explored in biotechnological applications, such as in the tannery and detergent industries.

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