ACETILAÇÃO DAS HISTONAS E SUA RELAÇÃO COM A AQUISIÇÃO DA COMPETÊNCIA EM OVÓCITOS BOVINOS

Considerando que em bovinos muitos dos ovócitos aspirados e utilizados para a produção in vitro de embriões (PIVE) ainda não adquiriram a competência para o desenvolvimento deve-se buscar alternativas que possam aumentar essa competência e, consequentemente, a eficiência da PIVE. A acetilação de histonas regula a transcrição gênica e parece estar relacionada com a aquisição de competência ovocitária. Entretanto, pouco se sabe se alterando o status de acetilação das histonas é possível alterar o nível de competência de ovócitos. Portanto, objetivou-se determinar o padrão de acetilação de histonas em ovócitos de diferentes competências antes, durante e após a maturação in vitro (MIV), e, avaliar se o uso do scriptaid (inibidor de HDAC) antes e após a retomada da meiose afeta a competência de desenvolvimento. No artigo 1, complexo cumulus-ovócito (COCs) foram obtidos a partir de folículos de 1-3mm, considerados menos competentes (IC) e de 6-8mm, mais competentes (CP). Ovócitos de ambos os grupos foram retirados da MIV as 0, 8 e 24h para avaliações de expressão gênica (HAT1, KAT2A, HDAC1, HDAC2, HDAC3) e imunofluorescência. Apesar do nível de acetilação não ter sido diferente em ovócitos de diferentes competências (P>0.05), o grupo CP apresentou transcrição do gene HAT1 de 0 para 8 horas (P<0.05), e maior quantidade de transcritos da HDAC1 às 8 horas em relação ao grupo IC (P<0.05). No artigo 2 COCs foram submetidos a pré-maturação (PMIV) por 6 horas na presença ou ausência de scriptaid (inibidor de HDAC). COCs foram distribuídos em 5 grupos: T1- MIV por 22h, T2- PMIV por 6h e MIV por 22h, T3-PMIV com scriptaid por 6h e MIV por 22h, T4-PMIV por 6h e MIV com scriptaid por 22h, e T5-PMIV com scriptaid por 6h e MIV com scriptaid por 22h. Maturação nuclear, expressão gênica, expansão das células do cumulus e desenvolvimento e qualidade embrionária foram analisados. Somente o gene HAT1 apresentou diferença de expressão em ovócitos de diferentes tratamentos. Em relação ao desenvolvimento embrionário em D7, T4 e T5 apresentaram taxas mais baixas de blastocistos (P<0.05) em relação aos outros tratamentos. Não foi observado nenhum efeito quando o scriptaid foi utilizado em ovócitos menos competentes (P>0.05). Conclui-se que o padrão de expressão gênica de genes relacionados a acetilação de histonas está relacionado a competência ovocitária. Porém, o uso de scriptaid durante a PMIV e /ou MIV não melhora a competência de desenvolvimento.

Considering that in cattle many of the oocytes aspirated and used for the in vitro production of embryos (PIVE) have not yet acquired the competence for the development one must look for alternatives that can increase this competence and, consequently, the efficiency of the PIVE. Histone acetylation regulates gene transcription and appears to be related to the acquisition of oocyte competence. However, little is known if altering the status of histone acetylation, it is possible to alter the competence level of oocytes. The aim of this study was to determine the histone acetylation pattern in oocytes of different abilities before, during and after in vitro maturation (IVM), and to evaluate whether the use of scriptaid (HDAC inhibitor) before and after meiosis resumption development competence. In article 1, cumulus-oocyte complex (COCs) were obtained from follicles 1-3mm, considered less competent (IC) and 6-8mm, more competent (CP). Oocytes from both groups were removed from the IVM at 0, 8 and 24h for gene expression evaluations (HAT1, KAT2A, HDAC1, HDAC2, HDAC3) and immunofluorescence. Although the acetylation level was not different in oocytes of different abilities (P> 0.05), the CP group presented transcription of the HAT1 gene from 0 to 8 hours (P <0.05), and higher amount of HDAC1 transcripts at 8 hours in relation to the IC group (P <0.05). In article 2 COCs were submitted to pre-maturation (PIVM) for 6 hours in the presence or absence of scriptaid (HDAC inhibitor). COCs were distributed in 5 groups: T1-MIV for 22h, T2-PIVM for 6h and IVM for 22h, T3-PIVM with scriptaid for 6h and MIV for 22h, T4-PIVM for 6h and MIV with scriptaid for 22h, and T5- PIVM with scriptaid for 6h and MIV with scriptaid for 22h. Nuclear maturation, gene expression, cumulus cell expansion, and embryonic development and quality were analyzed. Only the HAT1 gene showed expression difference in oocytes from different treatments. In relation to the embryonic development in D7, T4 and T5 presented lower rates of blastocysts (P <0.05) in relation to the other treatments. No effect was observed when the scriptaid was used in less competent oocytes (P> 0.05). We conclude that the gene expression pattern of histone acetylation related genes is related to oocyte competence. However, using scriptaid during PIVM and/or IVM does not improve development competence.

EFEITOS DAS PROSTAGLANDINAS E2 E F2 NA MATURAÇÃO IN VITRO DE OVÓCITOS BOVINOS

O presente estudo teve como objetivo elucidar o envolvimento das Prostaglandinas (PGs) E2 e F2 na maturação in vitro (MIV) de ovócitos bovinos. Nos primeiros experimentos, avaliou-se a cinética de maturação nuclear e o perfil de expressão de genes envolvidos na atividade dessas PGs (PTGS2, PTGES1, PTGER2 e AKR1B1) nas células do cumulus (CCs) de ovócitos bovinos de diferentes competências, antes a após a maturação. Os complexos cumulus-ovócitos (CCOs) foram obtidos de folículos dissecados de 1,0-2,9 mm (ovócitos incompetentes; INC) e 6,0-8,0 mm (ovócitos competentes; COM), e o grupo controle, da aspiração folicular de folículos de 3-8 mm (CTL). Para a cinética os CCOs foram desnudados, fixados, corados com lacmoide e avaliados quanto ao estágio de maturação nuclear. Já para a determinação do nível de transcritos os CCOs foram desnudados e as CCs coletadas para a análise por RT-qPCR. No terceiro experimento, o efeito da suplementação do meio de maturação com PGE2 e PGF2 foi avaliado. Os CCOs, aspirados de folículos de 3-8mm foram selecionados e distribuídos em cinco tratamentos: T1 (meio de maturação; CTL); T2 (meio de maturação suplementado com 10M de NS398 -inibidor específico da PTGS2); T3 (meio de maturação suplementado com 1M de PGE2 e 10M NS398); T4 (meio de maturação suplementado com 1M de PGF2 e 10M NS398); T5 (meio de maturação suplementado com 1M de PGE2, 1M PGF2 e 10M NS398). Após 24 horas de MIV, os CCOs foram avaliados quanto ao grau de expansão das CCs e, posteriormente, foram fecundados e cultivados in vitro até o D7 de desenvolvimento. Avaliou-se as taxas de clivagem em D2 e de blastocistos em D6 e D7. Os blastocistos de D7 foram avaliados quanto ao número total de células e a porcentagem de células com fragmentação do DNA. Os dados de taxa de maturação e desenvolvimento embrionário foram analisados pelo teste do Qui-quadrado, os de padrão de expressão gênica por análise de variância e teste de Tukey, e para a fragmentação do DNA (TUNEL), foi utilizado o teste de Tukey. Os resultados mostraram que ovócitos de diferentes competências apresentaram cinética de maturação nuclear semelhante (P>0,05). Durante a MIV a abundância relativa do RNAm para o gene PTGS2 nas CCs aumentou (P<0,05) no grupo INC, enquanto a de PTGES1 aumentou (P<0,05) nos grupos INC e COM. O nível de transcritos de AKR1B1 diminuiu (P<0,05) no grupo INC e o de PTGER2 não variou (P>0,05). Quando comparados no mesmo momento de maturação, o nível de transcritos de todos os genes avaliados foi semelhante (P>0,05) entre os grupos, tanto às 0 quanto as 24 horas de MIV. Com exceção do gene PTGS2 que apresentou menor expressão às 24 horas no grupo COM do que os grupos INC e CTL. Os tratamentos não afetaram (P>0,05) a expansão das CCs, a taxa de clivagem nem a qualidade embrionária, mas promoveram uma diminuição (P<0,05) nas taxa de blastocistos dos grupos tratados com PGs. Com base nos resultados conclui-se que apesar da suplementação do meio de maturação com PGE2 e PGF2 ter efeito prejudicial no desenvolvimento embrionário, os genes relacionados à atividade dessas PGs são diferencialmente expressos durante a maturação, e o gene PTGS2 se mostrou um bom marcador da competência dos CCOs maturos.

The present study aimed to elucidate the involvement of Prostaglandins E2 and F2 on the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes. In the first experiments, we evaluated the kinetics of nuclear maturation and the expression profile of genes involved in the activity of these PGs (PTGS2, PTGES1, PTGER2 and AKR1B1) in cumulus cells (CCs) of bovine oocytes of different competences, before and after maturation. The cumulus-oocyte complexes (CCOs) were obtained from dissected follicles of 1.0-2.9 mm (incompetent oocytes; INC) and 6.0-8.0 mm (competent oocytes; COM), and from aspirated 3-8 mm diameter follicles as the control (CTL). For the kinetics, CCOs were denuded, fixed, stained with lacmoid and evaluated for meiotic stage. For the determination of the level of transcripts CCOs were denuded and CCs collected for the analysis by RT-qPCR. In the third experiment, the effect of the supplementation of maturation medium with PGE2 and PGF2 was evaluated. The CCOs aspirated from 3-8mm follicles were selected and distributed into five treatments: T1 (maturation medium; CTL); T2 (maturation medium supplemented with 10M of NS398 - PTGS2 specific inhibitor); T3 (maturation medium supplemented with 1M PGE2 and 10M NS398); T4 (maturation medium supplemented with 1M of PGF2 and 10M NS398); T5 (maturation medium supplemented with 1M PGE2, 1M PGF2 and 10M NS398). After 24 hours of IVM, CCOs were evaluated for CCs expansion and were subsequently fertilized and cultured in vitro up D7 of development. Cleavage and blastocyst rate at D6 and D7, total cells number and percentage of cells with DNA fragmentation were evaluated. Maturation and embryonic development data were analyzed by Chi-square test, gene expression by analysis of variance and Tukey's test and DNA fragmentation by Tukey's test. The results showed that oocytes of different competences presented similar nuclear maturation kinetics (P> 0.05). The relative abundance of PTGS2 gene in the CCs increased (P <0,05) during IVM in INC group, while that of PTGES1 increased (P <0.05) in INC and COM groups. Level of AKR1B1 transcripts was lower (P <0.05) in the INC group than in the other groups and that of PTGER2 did not change among them (P> 0.05). When gene expression was compared among groups at the same time of maturation, transcript levels of all genes evaluated were similar (P> 0.05) between the groups, at both 0 and 24 hours of IVM, exception for PTGS2 gene that presented lower expression at 24 hours in the COM group than in the INC and CTL groups. Treatments did not affect the expansion of CCs, cleavage rate nor the embryonic quality (P> 0.05), but promoted a decrease (P <0.05) in the blastocyst rates on the PGs treated groups. Based on the results it can be concluded that although the supplementation of the maturation medium with PGE2 and PGF2 has detrimental effect on the embryonic development, genes related to the activity of these PGs are differentially expressed during maturation. In addition, PTGS2 gene showed to be a good marker for competence of mature CCOs

IDENTIFICAÇÃO DE MARCADORES NÃO INVASIVOS PARA A COMPETÊNCIA OVOCITÁRIA EM BOVINOS

Nome completo do autor da tese de dissertação: Ana Luiza Silva Guimarães Título da dissertação: Identificação de marcadores não invasivos para a competência ovocitária em bovinos Nome do curso: Doutorado em Ciências Animais Data de defesa: 29/09/2017 Orientador: Margot Alves Nunes Dode Palavras-chaves: antioxidantes, biópsia, competência ovocitária, cultivo individual, metilação de DNA, RNAm Keywords: antioxidants, biopsy, oocyte competence, individual culture, DNA methylation, mRNA. Resumo em Português O presente estudo objetivou determinar o melhor sistema de cultivo individual a ser utilizado e a quantidade relativa de RNAm de genes candidatos à marcadores de competência em biópsias de células do cumulus (CC) imaturas e maturadas de ovócitos com alta e baixa capacidade de produzir embriões in vitro. Foram realizados dois experimentos, sendo que no primeiro foram testados o efeito de dois tipos de cultivo individual (microgotas 20 L e Cell Tak) na produção de embriões, o uso de ácido fólico como antioxidante em diferentes concentrações (0, 10, 20, 50 e 500 µM) na produção embrionária e no padrão de metilação de regiões do - satélite e IGF2 e, o uso de ácido fólico isolado ou conjugado com ITS durante o cultivo em sistema individual na produção e qualidade dos embriões. Já no segundo foi determinada a quantidade relativa de RNAm para os genes GPC4, PTGS2, LUM, ALCAM, FSHR, PGR, GPX3, SERPINE2, HAS2, PRDX3, por PCR em tempo-real (qPCR) em biópsias de CC imaturas e maturadas. As biópsias utilizadas para o qPCR foram agrupadas conforme o resultado da produção de embriões em: CCOs que formaram blastocisto em D7(embrião); CCOs que não clivaram (não clivado) e, CCOs que clivaram, mas que não chegaram a blastocisto (clivado). No primeiro experimento, foi observado que o grupo Cell Tak apresentou menor taxa de clivagem (P0,05) e menor produção de embriões (P0,05) em D7 e D8 em relação ao grupo controle e microgotas de 20 L. Em relação às diferentes concentrações de ácido fólico, o grupo 500µM apresentou uma redução nas taxas de clivagem em D6 (P0,05) em relação aos demais. Em D7, não houve diferença entre os grupos quando comparados ao grupo controle. Em relação a metilação da região - Satélite, os grupos Controle, 20 µM e 500 µM apresentaram padrão semelhantes (P>0,05), que era hipometilado. Já para a região do éxon 10 do gene IGF2, o padrão de metilação foi diferente nos grupos 20 µM e 500 µM em relação ao controle (P 0,05). Quanto ao uso de ácido fólico e ITS, isolados ou associadosdurante o cultivo individual, foi observado que somente no grupo individual na presença de ITS, produção de embriões foi semelhante ao cultivado em grupo (P>0,05). No segundo experimento, dos 10 genes avaliados nas biópsias de CCs imaturas e maturadas, 2 genes apresentaram diferenças no nível de RNAm entre os grupos. O gene LUM mostrou-se mais expresso (P=0,02), enquanto que FSHR mostrou-se menos expresso (P= 0,09), ambos em CC maturadas de CCOs que desenvolveram em embrião, comparado as do grupo que não desenvolveu embrião. Conclui-se que o cultivo em gotas na presença de ITS proporcionou as melhores taxas de embriões e, que apesar do ácido fólico não afetar a produção altera o padrão de metilação do DNA. A expressão dos genes LUM e FSHR, em CCs maturadas está associada a capacidade do ovócito de formar embrião, podendo ser utilizados como marcadores não invasivos da competência ovocitária.

Resumo em Inglês The present study aimed to determine the best individal culture system to be used in vitro embryo production and to determine the quantity of genes transcrits in immature and matures cumulus (CC) cells biopsies obtained from cumulus-oocytes-complexes (COCs) with high and low capacity to produce embryos. Two experiments were carried out, in the first one the effect of two types of individual culture (microdroplets 20 L and Cell Tak) on embryo production, the use of folic acid at different concentrations (0, 10, 20, 50 and 500 M) on embryo production and methylation pattern, and the use of folic acid alone or in combination with ITS during individual culture on embryo production and quality were evaluated. In the second experiment, the relative amount of mRNA for GPC4, PTGS2, LUM, ALCAM, FSHR, PGR, GPX3, SERPINE2, HAS2 and PRDX3 genes was determined by real-time PCR (qPCR) in immature and mature CC biopsies. The biopsies were pooled according to the embryo production results as CCOs that formed blastocyst in D7 (embryo); CCOs that did not cleave (not cleaved) and CCOs that cleaved but did not reach the blastocyst (cleaved). On the first experiment, it was observed that the Cell Tak group presented lower cleavage at D2 and blastocyst rates at D7 and D8 compared to the control and the 20 L microdroplets groups. Regarding the different concentrations of folic acid, the 500M group showed lower rates of cleavage and blastocyst at D6 (P0.05), compared to the others groups. On D7, no differences were observed between the groups and the control. As for methylation, -Satellite region, all treatments were similar, (P> 0.05) and presented a hypomethylated pattern. For the exon 10 region of the IGF2 gene, it observed that, the groups exposed to acid folic, either 20 M or 500 M, had a difference methylation pattern compared to the control group (P 0.05). The results for the use of folic acid and ITS isolated or in combination during individual culture, showed that only the individual group exposed to ITS had similar embryo production to the control group (P> 0.05). In the second experiment, from 10 genes evaluated in CCs biopsies, two genes had differences in mRNA levels. The LUM gene was more expressed (P = 0.02), whereas FSHR was less expressed (P = 0.09) in maturated CC obtained from CCOs that developed into embryo, compared to the ones that did not. It can be concluded that individual culture in microdrops in the presence of ITS gave the highest embryo production and that although folic acid does not increase embryo development it changes their methylation pattern. In addition, the expression of the LUM and FSHR genes in CC is associated with the ability of the oocyte to form an embryo and can used as noninvasive markers of oocyte competence.

KISSPEPTINA: EFEITO NA MATURAÇÃO in vitro DE OVÓCITOS BOVINOS

Objetivou-se avaliar diferentes concentrações de kisspeptina, assim como a interação da kisspeptina e FSH/LH na MIV e competência ovocitária de bovinos. No experimento 1 foi determinada a concentração mínima de Kisspeptina (Kp) a ser utilizada, e no Experimento 2 foi avaliada sua interação com FSH e LH. Foram coletados ovários bovinos em abatedouro comercial e apenas ovócitos Grau I foram utilizados. Os ovócitos foram cultivados em meio TCM-199 com Bicarbonato, acrescido de 10% de SFB, piruvato de sódio (22µg/mL), amicacina (83mg/mL), FSH (0,5 µg/mL) com diferentes concentrações de Kp, sendo: FSH + 0M Kp-10; FSH + 10-7M Kp-10, FSH + 10-6M Kp-10; FSH + 10-5M Kp-10. No Experimento 2, foi utilizada a melhor concentração de Kp encontrada no Experimento 1, nos seguintes tratamentos: sem hormônios; FSH; FSH + Kp-10; FSH + LH; FSH, LH + Kp-10; Kp-10. A competência ovocitária foi determinada pela maturação nuclear, distribuição mitocondrial, intensidade de fluorescência de MitoTracker® Orange CMTMRos e DCF. A avaliação da maturação nuclear foi realizada após as 24hs de incubação e os ovócitos foram corados com DAPI para determinar o estágio nuclear (Vesícula Germinativa-VG, MetáfaseI-MI e MetáfaseII-MII). A distribuição mitocondrial foi classificada em periférica/semiperiférica e difusa em aglomerados/grânulos, foi avaliada após a coloração com o MitoTracker® Orange CMTMRos e também foi identificado a intensidade da mesma. Para determinar a intensidade de ROS os ovócitos foram corados com DCF. As análises foram realizadas pelo PROC GLIMMIX do SAS. No Experimento 1 ovócitos em meio com apenas FSH atingiram uma menor maturação nuclear quando comparados àqueles maturados com a Kp em diferentes concentrações (FSH:13/33; FSH + 10-7M Kp-10: 28/35; FSH + 10-6M Kp-10:30/34; FSH + 10-5M Kp-10:28/32; P=0,0001). Não houve diferença estatística na distribuição mitocondrial entre os tratamentos (P>0,05). A intensidade de fluorescência do MitoTracker não variou entre os tratamentos (P>0,05). A intensidade de fluorescência do DCF foi menor, quanto maior a concentração de Kp no meio (FSH:12177726,1; FSH + 10-7M Kp-10:10945982,83; FSH + 10-6M Kp-10:9820536,53; FSH + 10-5M Kp-10:9147016,38; P<0,0001). Baseado nos resultados do Experimento 1, a concentração de Kp foi determinada em 10-7M. No Experimento 2 a distribuição mitocondrial foi diferente entre os tratamentos, pois ovócitos maturados apenas com Kp ou FSH+LH, atingiram uma maior competência ovocitária do que aqueles que foram maturados apenas com FSH ou sem a adição dos hormônios (sem hormônio:66,66%; FSH:66,66%; FSH + Kp-10:75,86%; FSH + LH:91,17%; FSH, LH + Kp-10:82,85%; Kp-10:91,17%; P<0,05). O sem hormônio resultou em uma menor maturação nuclear do que os demais tratamentos (sem hormônio: 5/18; FSH:18/32; FSH + Kp-10:22/29; FSH + LH:26/33; FSH, LH + Kp-10:26/34; Kp-10:25/34; P=0,0094). A intensidade de fluorescência das probes MitoTracker e DCF foi menor quando a Kp foi adicionada ao meio de maturação (sem hormônio:1228363/540069; FSH:2307984/1395751; FSH + Kp-10:1941890/1114948; FSH + LH:2502145/1722376; FSH, LH + Kp-10:2286173/1467782; Kp-10:1859411/979325 P<0,0001). Assim, esse é o primeiro trabalho que evidencia que a Kisspeptina estimula a maturação ovocitária sem a presença de gonadotrofinas no meio de maturação.

This study aimed to evaluate different concentrations of kisspeptin, as well as the interaction of kisspeptin and FSH/LH in vitro maturation and oocyte competence in cattle. In Experiment 1 was determined the minimum concentration of Kisspeptin (Kp) to be used, and in Experiment 2 was evaluated its interection with FSH and LH. The oocytes were collected in a commercial slaughterhouse and only Grade I oocytes were utilized. The oocytes were cultured in TCM-199 medium with bicarbonate plus 10% FBS, sodium pyruvate (22µg/mL), amikacin (83mg/mL), FSH (0.5µg/mL), with different concentrations of Kp, the treatments were: FSH + 0M Kp-10; FSH + 10-7M Kp-10, FSH + 10-6M Kp-10; FSH + 10-5M Kp-10. In Experiment 2, was used better concentration of Kp found in Experiment 1, the following treatments: no hormones; FSH; FSH + Kp-10; FSH + LH; FSH, LH + Kp-10; Kp-10. The oocyte competence was determined by nuclear maturation, mitochondrial distribution, MitoTracker® Orange CMTMRos fluorescence intensity and DCF. The evaluation of nuclear maturation was made after 24 hours incubation and the oocytes were stained with DAPI to determine the nuclear stage (Germinal Vesicle-GV, Metaphase I-MI and Metaphase II-MII).The mitochondrial distribution was classified as peripheral/semiperipheral and diffuse in clusters/granules, evaluated after stained with the MitoTracker® Orange CMTMRos, and was also identified the intensity of it. To determine the intensity of ROS oocytes were stained with DCF. The statistical analysis was performed by SAS GLIMMIX PROC. In Experiment 1 oocytes matured only with the FSH reached a smaller nuclear maturation when compared to those who were matured with Kisspeptin at different concentrations (FSH:13/33; FSH + 10-7M Kp-10: 28/35; FSH + 10-6M Kp-10:30/34; FSH + 10-5M Kp-10:28/32; P=0,0001). There was no statistical difference in mitochondrial distribution between treatments (P>0.05). The fluorescence intensity of MitoTracker did not differ among treatments (P>0.05). The DCF fluorescence intensity was lower when the concentration of Kp was increased in the medium (FSH:12177726,1; FSH + 10-7M Kp-10:10945982,83; FSH + 10-6M Kp-10:9820536,53; FSH + 10-5M Kp-10:9147016,38; P<0,0001). Based in the Experiment 1 results, the concentration of Kp was determined in 10-7M. In Experiment 2 the mitochondrial distribution was different between treatments, because oocytes matured only with Kp or FSH+LH, reached a oocyte competence greater than those maturated with FSH only or without hormone addition (no hormones:66,66%; FSH:66,66%; FSH + Kp-10:75,86%; FSH + LH:91,17%; FSH, LH + Kp-10:82,85%; Kp-10:91,17%; P<0,05). The no hormones resulted in a lower nuclear maturation than the other treatments (no hormones: 5/18; FSH:18/32; FSH + Kp-10:22/29; FSH + LH:26/33; FSH, LH + Kp-10:26/34; Kp-10:25/34; P=0,0094). The fluorescence intensity of probes MitoTracker and DCF was lower when Kp was added to the maturation medium (no hormones:1228363/540069; FSH:2307984/1395751; FSH + Kp-10:1941890/1114948; FSH + LH:2502145/1722376; FSH, LH + Kp-10:2286173/1467782; Kp-10:1859411/979325 P<0,0001). So this is the first study that shows that Kisspeptin stimulates oocyte maturation without the presence of gonadotropins in the maturation medium

MARCADORES MOLECULARES PARA COMPETÊNCIA OVOCITÁRIA EM CÉLULAS DO cumulus BOVINAS

O presente estudo objetivou quantificar a expressão de genes candidatos em células do cumulus (CC) de ovócitos com alta e baixa capacidade de produzir embriões in vitro. Inicialmente, foi avaliado o efeito do sistema de cultivo individual e da biópsia na produção de embriões. Os complexos cumulus ovócitos (CCOs) foram distribuídos em três grupos: controle (CCOs cultivados em grupos); WOW (CCOs cultivados individualmente no sistema WOW); e microgota (CCOs cultivados individualmente em microgotas de 20 µL). E, então foi comparada a produção de embriões do cultivo em grupo e do cultivo individual em microgota, com e sem biópsias. Foi quantificado o nível de transcritos dos genes GPC4, IGFBP4, FSHR, GHR, EGFR, FGF11, SLC2A1, SLC2A3, SPRY1, VCAN e KRT8, por PCR em tempo-real (qPCR) em biopsias de CC. As biópsias foram agrupadas de acordo com o resultado da produção de embriões individual em microgota, em: CCOs que formaram blastocisto em D7; CCOs que não clivaram e, CCOs que clivaram, mas que não chegaram a blastocisto. A produção de embriões em D7 foi inferior (P<0,05) nos grupos cultivados individualmente (WOW=17,9 % n=95; microgota= 26,3% n=95) do que no controle (45,0 %, n=209), entretanto a biópsia não afetou (P>0,05) a produção de blastocistos em nenhum dos grupos. Dos 11 genes avaliados nas CCs, três mostraram diferença no nível de RNAm. O GHR (p<0,10) e VCAN (P<0,10) tiveram maior expressão em CCs de ovócitos que chegaram a blastocistos comparado aos que não clivaram; já o GPC4 foi mais expresso (P=0,007) nas CCs dos que chegaram a embrião do que os que apenas clivaram. Conclui-se que a biópsia de CC não afeta a produção de embriões. A expressão dos genes GHR, VCAN e GPC4 em CC está associada a capacidade do ovócito de formar embrião e, pode ser utilizada como marcador não invasivo da competência ovocitária.

The present study aimed to quantify the expression of candidate genes in cumulus cells (CC) from oocytes with high and low potential to develop in vitro up to the blastocyst stage. Initially, the effect of the individual culture system and the biopsy on embryo development was evaluated. Cumulus-oocyte-complexes (COCs) were distributed into 3 groups: control (COCs were cultured in groups); WOW (COCs were cultured individually in the WOW system); and micro droplet (COCs were individually cultured in micro droplet of 20 µL). Then, embryo production was compared between the control and the individual system (micro droplet) in which the COCs were submitted or not to biopsy. Expression levels of GPC4, IGFBP4, FSHR, GHR, EGFR, FGF11, SLC2A1, SLC2A3, SPRY1, VCAN and KRT8 genes were quantified by real time PCR (qPCR) in CC biopsies. Each biopsied COC was individually tracked, by culturing them in a micro droplet, and categorized based on his fate: embryo at blastocyst stage at D7, cleaved and arrested and not cleaved. Average blastocyst rates were lower in individual culture (WOW=17,9 % n=95; microdrop= 26,3% n=95) than in the control group (45,0 %, n=209) (P<0.05), and no effect of the biopsy was observed for both groups (P>0.05). From the 11 genes evaluated 3 showed differential expressions. Higher expression of GHR (p<0.10) and VCAN (P<0.10) was observed in CCs that formed embryos than those not cleaved. The GPC4 gene was overexpressed (P=0,007) in CC from the formed embryos compared to cleaved and arrested ones. It can be concluded that biopsy do not affect embryo development. The expression of GHR, VCAN and GPC4 genes can be used as markers to distinguish COCs associated with good quality embryos from COCs with limited developmental potential.