Avaliação de meios de cultura cromogênicos para identificação rápida de bactérias Gram-positivas causadoras de mastite subclínica

O objetivo do presente estudo foi avaliar o desempenho diagnóstico (especificidade, Sp; sensibilidade, Se; valor preditivo positivo, VPP; valor preditivo negativo, VPN; e acurácia) de dois meios de cultura cromogênicos para identificação rápida de bactérias Gram-positivas (Streptococcus uberis; Streptococcus agalactiae; Streptococcus dysgalactiae; Staphylococcus aureus; Staphylococcus saprophyticus e Staphylococcus epidermidis) causadoras de mastite subclínica (MSC) em vacas leiteiras. Para isso, foi avaliado o desempenho dos meios de cultura cromogênicos seletivos para bactérias Gram-positivas (GP) e Staphylococcus (S) (CHROMagar, Paris França) em amostras de leite provenientes de: 1) vacas com MSC durante a lactação (n=504), e 2) vacas no período pós-parto (PP) (7 ± 3 dias pós parto; n= 536). A identificação rápida das bactérias Gram-positivas nos meios de cultura foi realizada por leitura visual da coloração das colônias após 24 h de incubação a 37°C. A identificação bacteriana por espectrometria de massas por MALDI-TOF MS foi considerada a metodologia de referência para cálculo de: acurácia, Se, Sp, VPP, VPN e coeficiente de concordância Kappa de Cohen. O meio GP apresentou alta acurácia de identificação de Streptococcus agalactiae/dysgalactiae tanto em amostras de MSC (Se: 89,1%; Sp: 96,3% e acurácia: 95,6%) quanto em amostras de vacas em PP (Se: 100%; Sp: 99,0% e acurácia: 99,1%). Resultados semelhantes foram observados para identificação de Streptococcus uberis/Enterococcus spp. (Se: 90,5%; Sp: 92,5% e acurácia: 92,3%) em amostras de MSC e Se: 100%; Sp: 99,6% e acurácia: 99,6% em amostras de vacas em PP com o uso do meio GP. No entanto, o meio GP apresentou baixa Se (25,0% em amostras de MSC e 50,0% em amostras de vacas em PP) na identificação de Staphylococcus aureus, apesar da alta Sp e acurácia (Sp: 98,3% e acurácia: 95,4% em amostras de MSC e Sp: 99,4% e acurácia: 98,9% em amostras de vacas em PP). O meio de cultura S apresentou alta acurácia de identificação de Staphylococcus aureus (Se: 80,0%; Sp: 98,8% e acurácia: 98,0% em amostras de MSC e Se: 66,7%; Sp: 100% e acurácia: 99,6% em amostras de vacas em PP), apesar de a baixa prevalência dos patógenos Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus saprophyticus limitar inferências sobre a acurácia da identificação destes patógenos no meio S. Em resumo, apesar da limitação do meio GP na identificação de Staphylococcus aureus, os meios cromogênicos GP e S obtiveram resultados de desempenho diagnóstico satisfatórios para a identificação rápida das principais bactérias Gram-positivas causadoras de MSC. Palavras-chave: Cultura na fazenda. Mastite. Meios cromogênicos.

The aim of the present study was to evaluate the performance: specificity (Sp), sensitivity (Se), positive predictive value (PPV), negative predictive value (NPV) and accuracy (Acc) of two chromogenic culture media for rapid identification of Gram-positive bacteria (Streptococcus uberis; Streptococcus agalactiae; Streptococcus dysgalactiae; Staphylococcus aureus; Staphylococcus saprophyticus and Staphylococcus epidermidis) causing subclinical mastitis (SCM) in dairy cows. For this, the performance of Gram-positive (GP) and Staphylococcus (S) (CHROMagar , Paris - France) culture media was evaluated in milk from: 1) cows with MSC during lactation (n = 504), and 2) cows in the postpartum period (PP) (7 ± 3 days postpartum; n = 536). Rapid identification of Gram-positive bacteria in chromogenic media was performed by visual inspection of colony colors after 24 hours of incubation at 37 ° C. The results obtained were compared to bacterial identification by mass spectrometry by MALDI-TOF MS, which was considered the reference methodology for calculating: Acc, Se, Sp, PPV, NPV and Cohen's Kappa coefficient of agreement (k). The chromogenic media GP showed high Acc in Streptococcus agalactiae/dysgalactiae identification of both in samples of SCM (Se: 89.1%; Sp: 96.3% and Acc: 95.6%) and in samples of cows in PP (Se: 100%; Sp: 99.0% and Acc: 99.1%). Similar results were observed for Streptococcus uberis/Enterococcus spp. identification (Se: 90.5%; Sp: 92.5% and Acc: 92.3%) in SCM samples and Se: 100%; Sp: 99.6% and Acc: 99.6% in PP cow samples using the GP medium. However, the GP chromogenic media showed low Se (25.0% in SCM samples and 50.0% in samples of cows in PP) for Staphylococcus aureus identification, although Sp and Acc are high (Sp: 98.3 % and Acc: 95.4% in SCM and Sp samples: 99.4% and Acc: 98.9% in PP cow samples). Culture media S showed high Acc in Staphylococcus aureus identification (Se: 80.0%; Sp: 98.8% and Acc: 98.0% in SCM samples and Se: 66.7%; Sp: 100% and Acc: 99.6% in PP cow samples), although the low prevalence of Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus saprophyticus limit inferences about the Acc of identifying these pathogens in S media. In conclusion, despite the limitation of the GP medium in the identifying Staphylococcus aureus, GP and S chromogenic media obtained satisfactory diagnostic performance results for the rapid identification of the main pathogens associated with SCM. Key words: On-farm culture. Mastitis. Chromogenic media.

Avaliação de meios de cultura cromogênicos para identificação rápida de microrganismos causadores de mastite bovina

Este estudo objetivou avaliar o desempenho diagnóstico (especificidade, Sp; sensibilidade, Se; acurácia, Ac; valor preditivo positivo, VPP; valor preditivo negativo, VPN; e coeficiente de concordância kappa de Cohen, k) de meios de cultura cromogênicos para identificação rápida de microrganismos causadores de mastite clínica (MC) e subclínica (MSC). Para tanto, dois experimentos foram realizados: 1) Avaliação de biplaca de meios de cultura cromogênicos para identificação rápida de microrganismos causadores de mastite; 2) Avaliação de triplaca de meios de cultura cromogênicos para identificação rápida de microrganismos causadores de mastite. Em ambos estudos (1 e 2), a identificação de microrganismos com o uso de meios cromogênicos baseou-se na leitura visual da coloração das colônias microbianas após 18 a 24 h de incubação. Para avaliação da Ac, Se, Sp, VPP, VPN e k dos meios cromogênicos a identificação dos microrganismos por espectrometria de massas (MALDI-TOF) foi considerada a metodologia padrão. No experimento 1, foram avaliadas 514 amostras de leite coletadas de vacas com MC e 667 de MSC, as quais foram inoculadas em dois meios de cultura cromogênicos seletivos para bactérias Gram-positivas e outro para Gram-negativas (CHROMagar, França). No experimento 2 foram avaliadas 500 amostras de leite de vacas com MC e 500 de vacas com MSC, as quais foram inoculadas em três meios de cultura cromogênicos, seletivos para Streptococcus, Staphylococcus e bactérias Gram-negativas (CHROMagar, França). No experimento 1, do total de amostras de MC, houve crescimento de microrganismos em pelo menos um dos meios de cultura, sendo 33,5% (175/514) no meio GP e 27,2% (140/514) no GN. O uso de biplacas com os meios de cultura GP/GN apresentou Ac que variou de 93% (Strep. agalactiae/dysgalactiae; Strep. uberis) a 96% (Prototheca spp./levedura). Com relação às amostras de MSC, houve crescimento de microrganismos em pelo menos um dos meios de cultura, sendo 31,8% (212/667) no meio GP e 4,3% (29/667) no GN. No experimento 2, do total de amostras de MC, houve crescimento de microrganismos em 5% (25/500) no meio seletivo para Streptococcus, 21,4% (107/500) no meio seletivo para Staphylococcus e 23% (115/500) para o meio GN. O uso da triplaca em amostras de MC com os meios cromogênicos apresentou Ac que variou de 94% (Strep. agalactiae/dysgalactiae) a 100% (Pseudomonas spp.; Prototheca spp./levedura). Para as amostras de MSC, houve crescimento de microrganismos em 32,6% (163/500) no meio seletivo para Streptococcus, 45% (225/500) no meio seletivo para Staphylococcus e 34,5% (17/500) para o meio GN. O uso da triplaca com os meios de cultura cromogênicos em amostras de MSC, apresentou Ac que variou de 87% (Staphylococcus não-aureus) a 100% (Escherichia coli; Pseudomonas spp.). O uso da dos métodos de biplaca e da triplaca de meios de cultura cromogênicos apresentaram alta acurácia (Ac >85%) para os diagnósticos dos principais microrganismos causadores de mastite, o que indica que podem ser utilizados em sistemas de cultura na fazenda, com base na visualização de coloração de colônias dos principais patógenos causadores de mastite.

This study aimed to evaluate the diagnostic performance (specificity, Sp; sensitivity; Se; accuracy, Ac; positive predictive value, PPV; negative predictive value, VPN; and Cohen's kappa coefficient of agreement, k) for chromogenic culture media for rapid identification of microorganisms that cause clinical (MC) and subclinical (MSC) mastitis. For this, two experiments were carried out: 1) Evaluation of biplate of chromogenic culture media for rapid identification of mastitis-causing microorganisms; 2) Evaluation of tri-plate of chromogenic culture media for rapid identification of mastitis-causing microorganisms. In both studies (1 and 2), the identification of microorganisms using chromogenic media was based on the visual reading of the color of the microbial colonies after 18 to 24 h of incubation. For evaluation of Ac, Se, Sp, VPP, VPN and k of chromogenic media, the identification of microorganisms by mass spectrometry (MALDI-TOF) was considered the standard methodology. In experiment 1, 514 milk samples collected from cows with MC and 667 from MSC were inoculated in two culture media selective for Gram-positive bacteria and another for Gram-negative (CHROMagar, France). In experiment 2, 500 milk samples from cows with MC and 500 from cows with MSC were inoculated in three chromogenic culture media, selective for Streptococcus, Staphylococcus and Gram-negative bacteria (CHROMagar, France). In experiment 1, of the total of MC samples, there was growth of microorganisms in at least one of the culture medium in 33.5% (175/514) in the GP medium and 27.2% (140/514) in GN. The use of biplates with GP / GN media showed Ac that ranged from 93% (Strep. agalactiae/dysgalactiae; Strep. uberis) to 96% (Prototheca spp./yeast). Regarding the MSC samples, there was growth of microorganisms in at least one of the culture media in 31.8% (212/667) in the GP medium and 4.3% (29/667) in GN. In experiment 2, of the total of MC samples, there was growth of microorganisms in 5% (25/500) in the selective medium for Streptococcus, 21.4% (107/500) in the selective medium for Staphylococcus and 23% (115 / 500) for the GN medium. When used for CM samples tri-plates with chromogenic media showed Ac raging from 94% (Strep. agalactiae/dysgalactiae) to 100% (Pseudomonas spp.; Prototheca spp./ yeast). For the MSC samples, there was growth of microorganisms in 32.6% (163/500) in the selective medium for Streptococcus, 45% (225/500) in the selective medium for Staphylococcus and 34.5% (17/500) for the GN medium. The use of the tri-plate with the chromogenic media in samples of MSC, showed Ab that varied from 87% (Staphylococcus non-aureus) to 100% (Escherichia coli; Pseudomonas spp.). The use of the bi-plate and tri-plate methods of chromogenic culture media showed high accuracy (Ac> 85%) for the diagnosis of the main mastitis causing microorganisms, which indicates that they can be used in farm culture systems, based on the visualization of colony staining of the main pathogens causing mastitis.