Avaliação do desenvolvimento in vitro de embriões bovinos após exposição à crotamina linear / Evaluation of bovine embryo in vitro development after exposure to linear crotamine

The present study investigated the effects of different concentrations of linear crotamine (CrL), used asagent for cell transfection, on in vitro development of bovine embryos. Embryos were exposed to 0; 5 and 12.5µM of CrL in Synthetic Oviductal Fluid (SOF) for 6 h. Vehicle solution was NaCl 150 mM and not exposedembryos (in vitro fertilized-IVF group) was included. In vitro developmental competence was evaluated bycleavage (day 2), blastocyst (day 7 and 8), and hatching (day 8) rates. No difference (P > 0.05) was observedamong CrL groups and control group (IVF) for all observed parameters. In conclusion, the use of the tested CrLconcentrations for 6 h during in vitro culture of bovine embryos have no deleterious effects on embryodevelopment.(AU)

Avaliação do desenvolvimento in vitro de embriões bovinos após exposição à crotamina linear / Evaluation of bovine embryo in vitro development after exposure to linear crotamine

The present study investigated the effects of different concentrations of linear crotamine (CrL), used asagent for cell transfection, on in vitro development of bovine embryos. Embryos were exposed to 0; 5 and 12.5µM of CrL in Synthetic Oviductal Fluid (SOF) for 6 h. Vehicle solution was NaCl 150 mM and not exposedembryos (in vitro fertilized-IVF group) was included. In vitro developmental competence was evaluated bycleavage (day 2), blastocyst (day 7 and 8), and hatching (day 8) rates. No difference (P > 0.05) was observedamong CrL groups and control group (IVF) for all observed parameters. In conclusion, the use of the tested CrLconcentrations for 6 h during in vitro culture of bovine embryos have no deleterious effects on embryodevelopment.

NANOPARTÍCULAS DE SÍLICA (SO2) COMO DRUG DELIVERY DE DOMPERIDONA EM Danio rerio

A domperidona é um inibidor do receptor de dopamina D2 que estimula a liberação das gonadotrofinas hipofisárias. Geralmente ela é associada a GnRHa sintético para promoção da desova em peixes. Porém a via de administração utilizada, injeção intramuscular, pode ser bastante estressante para o reprodutor. Pouco se conhece sobre os efeitos isolados da domperidona, nem se, com outras vias de administração, este medicamento seria capaz de promover a desova. Inicialmente foi realizado o Zebrafish embryo toxicity (ZET) de acordo com os manuais da OECD. Para tanto foi avaliado a toxicidade de nanopartícula de sílica (SiNPs), domperidona (DOMP) e sua associação (DOMP+SINPs), em diferentes concentrações, durante 168 horas de exposição. Foi observada uma maior taxa de sobrevivência quando testado a associação DOMP+SiNPs quando comparados aos demais tratamentos e controle. Os tratamentos DOMP e SiNPs apresentaram o maior número de efeito teratogênico, nas maiores concentrações. Na avaliação da frequência cardíaca o tratamento DOMP 0,004 mg/mL, aumento da frequência, em comparação ao controle. Já o tratamento SiNPs 4,4 mg/mL diminuiu a frequência cardíaca dos embriões, em relação ao controle. O tratamento DOMP + SiNPs não apresentou diferença quanto aos efeitos teratogênicos e frequência cardíaca, em relação ao controle. Os resultados demonstram que a utilização das SiNPs diminuiu a toxidade da domperidona, além de possibilitar a administração por diluição. Posteriormente foi avaliado o efeito destes tratamentos no crescimento folicular em zebrafish pré-púbere, utilizando duas vias de administração, diluição em água e ração, durante 14 dias. Observou-se o aumento do índice gonadossomático em peixes alimentados com ração contendo SiNPs. Independente da via de administração, o tratamento com DOMP apresentou maior maturação folicular. Avaliando as vias de administração, o tratamento DOMP ração aumentou a maturação folicular. Nas fases iniciais da maturação folicular os tratamentos DOMP e DOMP+SINPs (água) aumentaram a área folicular. Os resultados demonstram que o houve um aumento na quantidade folículos vitelogênicos nos tratamentos DOMP e DOMP+SiNPs administrados via alimentação e por diluição, o que possibilitaria a incorporação destas junto a dieta ou adição aos tanques dos reprodutores para promoção da desova.

Domperidone is a dopamine D2 receptor inhibitor that stimulates the release of pituitary gonadotropins. It is usually associated with synthetic GnRHa to promote spawning in fish. However, the route of administration used, intramuscular injection, can be quite stressful for the breeder. Little is known about the isolated effects of domperidone, nor whether, with other routes of administration, this drug would be able to promote spawning. Initially, Zebrafish embryo toxicity (ZET) was carried out according to OECD manuals. For that, the toxicity of silica nanoparticles (SiNPs), domperidone (DOMP) and their association (DOMP + SINPs) was evaluated, in different concentrations, during 168 hours of exposure. A higher survival rate was observed when testing the DOMP + SiNPs association when compared to the other treatments and controls. The DOMP and SiNPs treatments showed the highest number of teratogenic effects, in the highest concentrations. In the evaluation of heart rate, DOMP treatment 0.004 mg / mL, increased frequency, compared to control. The SiNPs 4.4 mg / mL treatment decreased the heart rate of the embryos, compared to the control. The DOMP + SiNPs treatment showed no difference in terms of teratogenic effects and heart rate compared to control. The results demonstrate that the use of SiNPs decreased the toxicity of domperidone, in addition to allowing administration by dilution. Subsequently, the effect of these treatments on follicular growth in prepubertal zebrafish was evaluated, using two routes of administration, dilution in water and feed, for 14 days. An increase in the gonadosomatic index was observed in fish fed with diets containing SiNPs. Regardless of the route of administration, treatment with DOMP showed greater follicular maturation. Evaluating the routes of administration, DOMP ration treatment increased follicular maturation. In the early stages of follicular maturation, the DOMP and DOMP + SINPs (water) treatments increased the follicular area. The results show that there was an increase in the quantity of vitellogenic follicles in the DOMP and DOMP + SiNPs treatments administered via feeding and dilution, which would allow their incorporation into the diet or addition to the breeding tanks to promote spawning.

UTILIZAÇÃO DE VESÍCULAS LIPÍDICAS UNILAMELARES COMO CARREADORAS DE ANTIOXIDANTES EM SISTEMAS DE CULTIVO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

As vesículas lipídicas unilamelares gigantes (GUVs) são consideradas ótimas ferramentas em sistemas de estudos que mimetizam membranas biológicas, devido à sua composição fosfolipídica e sensibilidade ao estresse oxidativo, além de possuírem capacidade de encapsular macromoléculas. Este foi o primeiro estudo a utilizar vesículas unilamelares gigantes como carreadoras de antioxidante (cisteina) em sistema de produção in vitro de embriões (PIVE). Sua utilização aliada ao sistema de cultivo é interessante, pois acredita-se poder ocorrer liberação do antioxidante de acordo com a demanda do sistema de PIVE. O objetivo desse estudo foi avaliar o comportamento das GUVsco-cultivadasin vitro com embriões bovinos, definir o método de indução ao estresse oxidativo e sua efetividade ao encapsular e carrear antioxidantes sob condições de estresse oxidativo. Foram testados indutores de estresse oxidativo [menadiona (MD) e peróxido de hidrogênio (H2O2)] nas GUVs, sendo o H2O2 em altas concentrações eficaz em induzir o estresse oxidativo através da alteração do diâmetro [Controle (18,96 µm) vs. H2O2 0,1 mM (17,71 µm), H2O2 0,5 mM (17,32 µm) e H2O2 1,0 mM (16,63 µm)]. Houve redução na taxa de desenvolvimento embrionário (P<0,05) dos grupos co-cultivados com GUVs e submetidos ao estresse oxidativo pela MD [Controle (26,70%) GUV (25,18%) vs. GUV+MD 5,0 M (6,95%) e GUV+MD 7,5 M (0,95%)]. As maiores concentrações intracelulares de ROS em embriões bovinos (P<0,05), foi no grupo GUV+MD 5,0 M (16,28) vs. Controle (3,76) e GUV (3,99 ± 0,33). Ao co-cultivarGUVs, com cisteína encapsulada em seu interior, com embriões bovinos e submetê-los ao estresse oxidativo, pôde ser observado que a taxa de desenvolvimento embrionário foi menor (P<0,05) nos grupos (MD: 9,46%; MD + Cist: 1,19%; e GUV(Cist 3mM) + MD: 1,15%) e nos grupos cultivados com maior concentração de cisteina [GUV(Cist 129mM): 0,0% e GUV(Cist 129mM) + MD: 0,0%] em comparação aos demais grupos (controle: 25,58%; Cist: 31,77%; e GUV(Cist 3mM): 30,16. A taxa de desenvolvimento embrionário até o estágio de blastocisto foi menor (P<0,05) nos grupos submetidos ao estresse oxidativo pela menadiona (MD: 9,46%; MD + Cist: 1,19%; e GUV(Cist 3mM) + MD: 1,15%) e nos grupos cultivados com maior concentração de cisteina [GUV(Cist 129mM): 0,0% e GUV(Cist 129mM) + MD: 0,0%] em comparação aos demais grupos (controle: 25,58%; Cist: 31,77%; e GUV(Cist 3mM): 30,16. O grupo GUV(Cist 3mM) exibiu menores (P<0,05) concentrações de ROS (0,09 UAF) comparado ao grupo Cist (0,16 UAF), mas ambos não diferiram do grupo controle (0,10 UAF), sendo as maiores concentrações de ROS observadas no grupo MD (0,34 UAF). Em conclusão as GUVs não promoveram efeito tóxico e nem aumentaram as concentrações intracelulares de ROS nos embriões. As GUVs produzidas com cisteína em seu interior apresentaram-se mais eficientes para prevenir o aumento de ROS.

Giant unilamellar lipid vesicles (GUVs) are considered to be great tools in study systems that mimic biological membranes due to their phospholipid composition and sensitivity to oxidative stress, as well as their ability to encapsulate macromolecules. This was the first study to use giant unilamellar vesicles as antioxidant (cysteine) carriers in an in vitro embryo production system (PIVE). Its use combined with the cultivation system would be interesting because it is believed that antioxidant release could occur according to the demand of the PIVE system. The aim of this study was to evaluate the behavior of GUVs co-cultured in vitro with bovine embryos, to standardize the oxidative stress induction method and its effectiveness to encapsulate and carry antioxidants under oxidative stress conditions. Oxidative stress inducers [meanadione (MD) and hydrogen peroxide (H2O2)] were tested in GUVs, and H2O2 at high concentrations was effective in inducing oxidative stress by changing the diameter [Control (18.96 µm) vs. 0.1 mM H2O2 (17.71 µm), 0.5 mM H2O2 (17.32 µm) and 1.0 mM H2O2 (16.63 µm)]. Embryonic development rate (P <0.05) was reduced in groups co-cultivated with GUVs and submitted to oxidative stress by DM [Control (26.70%) GUV (25.18%) vs. GUV + MD 5.0 M (6.95%) and GUV + MD 7.5 M (0.95%)]. The highest intracellular ROS concentrations in bovine embryos (P <0.05) were in the GUV + MD 5.0 M group (16.28) vs. Control (3.76) and GUV (3.99 ± 0.33). By co-cultivating GUVs with encapsulated cysteine inside, with bovine embryos and subjecting them to oxidative stress, it could be observed that the embryonic development rate was lower (P <0.05) in the groups (MD: 9.46 % MD + Cist: 1.19%, and GUV (3mM Cist) + MD: 1.15%) and in the cultivated groups with the highest cysteine concentration [GUV (Cist 129mM): 0.0% and GUV (Cist 129mM ) + MD: 0.0%] compared to the other groups (control: 25.58%; Cyst: 31.77%; and GUV (Cist 3mM): 30.16. The embryonic development rate to the blastocyst stage was lower (P <0.05) in the groups subjected to oxidative stress by menadione (MD: 9.46%; MD + Cist: 1.19%; and GUV (Cist 3mM) + MD: 1.15%) and in cultivated groups with higher cysteine concentration [GUV (Cist 129mM): 0.0% and GUV (Cist 129mM) + MD: 0.0%] compared to the other groups (control: 25.58%; Cist: 31.77 % and GUV (Cist 3mM): 30.16.The GUV group (Cist 3mM) exhibited lower (P <0.05) ROS concentrations (0.09 UAF) compared to the Cist group (0, 16 UAF), but both did not differ from the control group (0.10 UAF), with the highest ROS concentrations observed in the MD group (0.34 UAF). In conclusion, GUVs did not promote toxic effects, nor did they increase intracellular ROS concentrations in embryos. GUVs produced with cysteine inside were more efficient to prevent the increase of ROS.

Efeitos do fenantreno e alquilbenzenos lineares no desenvolvimento larval e genes em ostra do Pacífico Crassostrea gigas (Thunberg, 1789)

O objetivo deste estudo foi avaliar a toxicidade de fenantreno (FEN) e dos alquilbenzenos lineares (ABLs) durante o desenvolvimento larval da ostra Crassostrea gigas e verificar a influência do FEN e ABLs sobre respostas moleculares. Os gametas foram recolhidos a partir de ostras adultas, separados por telas, fertilizados e mantidos nas unidades experimentais durante 24 h. Com base em ensaios preliminares (Capitulo 1), foram definidas concentrações para o teste de toxicidade FEN (0,37; 0,75; 1,5; 3,0 e 6,0 g.L-1) e ABLs (3,5; 5,3; 8,0; 12,0 e 18,0 g.L-1). E no (Capitulo 2) A escolha das concentrações baseou-se na EC50 encontrada nos testes de toxicidade (Capitulo 1). A avaliação do desenvolvimento larval foi expresso como porcentagens líquidas do desenvolvimento normal (NPNe) de larvas em forma de D, as alturas da concha foi utilizado como um indicador de crescimento e a concentração efetiva (CE50) foi calculada utilizando o método Spearman Karber. Avaliação química da concha das larvas foi feita através da análise de espectrometria de energia dispersiva (EDS) acoplado ao microscópio eletrônico de varredura (MEV). Através da técnica PCR quantitativo em tempo real (qPCR) foi analisada a transcrição de genes-alvo. A CE50 para FEN foi de 1,91 µg.L-1 e de 8,94 µg.L-1 para ABLs. Após 24 horas de exposição, os contaminantes afetaram o desenvolvimento morfológico. O NPNe mostrou uma diferença significativa para FEN e ABLs com relação ao controle, o crescimento larval foi levemente afetado, a análise química das conchas revelaram alteração e houve desregulação na transcrição gênica. Este é o primeiro estudo que demonstra a suscetibilidade de larvas de moluscos marinhos quando expostos aos contaminantes ambientais FEN e ABLs, causando um aumento nas deformidades nas larvas, reduzindo seu crescimento e alterando a transcrições de genes importantes no desenvolvimento, mesmo em concentrações muito baixas

The aim of this study was to evaluate the toxicity of phenanthrene (PHE) and linear alkyl benzenes (LAB) during the embryo-larval development of C. gigas oyster and the influence of the FEN and LAB on molecular responses. The gametes were collected from adult oysters, separated by screens, fertilized and kept in the experimental units for 24 h. Based on preliminary tests (Chapter 1), concentrations were defined for the FEN toxicity test (0,37; 0,75; 1,5; 3,0 and 6,0 g.L-1) and LAB (3,5; 5,3; 8,0; 12,0 and 18,0 g.L-1). In (Chapter 2) the choice of concentrations based on EC50 found in toxicity tests (Chapter 1). The embryo-larval development of evaluation were expressed as net percentages of normal development (NPNe) larvae D-shaped shell heights of was used as an indicator of growth and effective concentration (EC50) was calculated using the Spearman Karber-method. Chemical evaluation of the shell of the larvae was performed through the analysis of energy dispersive spectrometry (EDS) coupled to a scanning electron microscope (SEM). Through technical real-time polymerase chain reaction (qPCR) was analyzed transcription of target genes. The EC50 was 1.91 g.L-1 FEN and 8.94 to 1 g.L-1 LAB. After 24 hours of exposure, the contaminants affect the morphological development. The NPNe showed a significant difference to FEN and LAB with the control, the larval growth was slightly affected, the chemical analysis of the shells revealed change and there was deregulation in gene transcription. This is the first study to show the susceptibility of marine mollusc embryos when exposed to environmental contaminants FEN and LAB, causing an increase in deformities larvae, reducing its growth, and changing the major gene transcripts in development, even in very low concentrations