Reproductive potential of Spodoptera eridania (Stoll) (Lepidoptera: Noctuidae) in the laboratory: effect of multiple couples and the size

Abstract This study aimed to evaluate the effect of keeping three couples in the same cage, and the size of adults emerged from small, medium-sized and large pupae (278.67 mg; 333.20 mg and 381.58 mg, respectively), on the reproductive potential of S. eridania (Stoll, 1782) adults, under controlled conditions (25 ± 1 °C, 70% RH and 14 hour photophase). We evaluated the survival, number of copulations, fecundity and fertility of the adult females. The survival of females from these different pupal sizes did not differ statistically, but the survival of males from large pupae was statistically shorter than from small pupae. Fecundity differed significantly and correlated positively with size. The number of effective copulations (espematophores) and fertility did not vary significantly with pupal size. Our results emphasize the importance of indicating the number of copulations and the size of the insects when reproductive parameters are compared.(AU)

Resumo Este estudo objetivou avaliar o efeito de confinar três casais em cada gaiola e o tamanho de adultos emergidos de pupas pequenas, medias e grandes (278,67 mg, 333,20 mg e 381,58 mg, respectivamente), sobre o potencial reprodutivo de S. eridania (Stoll, 1782), em condições controladas (25 ± 1 °C, 70% UR e 14 horas de fotofase). Avaliou-se a sobrevivência, o número de cópulas, fecundidade e fertilidade dos adultos. A sobrevivência não diferiu significativamente entre fêmeas provenientes de pupas de diferentes tamanhos, mas os machos oriundos de pupas grandes tiveram sobrevivência significativamente menor que os demais tamanhos. A fecundidade diferiu significativamente e correlacionou-se positivamente com o tamanho. O número de cópulas (espematóforos) e a fertilidade não variaram em função do peso pupal. Os resultados enfatizam a importância de indicar o número de cópulas e o tamanho dos insetos estudados para que comparações entre os parâmetros reprodutivos possam ser efetuadas.(AU)

Reproductive potential of Spodoptera eridania (Stoll) (Lepidoptera: Noctuidae) in the laboratory: effect of multiple couples and the size

Abstract This study aimed to evaluate the effect of keeping three couples in the same cage, and the size of adults emerged from small, medium-sized and large pupae (278.67 mg; 333.20 mg and 381.58 mg, respectively), on the reproductive potential of S. eridania (Stoll, 1782) adults, under controlled conditions (25 ± 1 °C, 70% RH and 14 hour photophase). We evaluated the survival, number of copulations, fecundity and fertility of the adult females. The survival of females from these different pupal sizes did not differ statistically, but the survival of males from large pupae was statistically shorter than from small pupae. Fecundity differed significantly and correlated positively with size. The number of effective copulations (espematophores) and fertility did not vary significantly with pupal size. Our results emphasize the importance of indicating the number of copulations and the size of the insects when reproductive parameters are compared.

Resumo Este estudo objetivou avaliar o efeito de confinar três casais em cada gaiola e o tamanho de adultos emergidos de pupas pequenas, medias e grandes (278,67 mg, 333,20 mg e 381,58 mg, respectivamente), sobre o potencial reprodutivo de S. eridania (Stoll, 1782), em condições controladas (25 ± 1 °C, 70% UR e 14 horas de fotofase). Avaliou-se a sobrevivência, o número de cópulas, fecundidade e fertilidade dos adultos. A sobrevivência não diferiu significativamente entre fêmeas provenientes de pupas de diferentes tamanhos, mas os machos oriundos de pupas grandes tiveram sobrevivência significativamente menor que os demais tamanhos. A fecundidade diferiu significativamente e correlacionou-se positivamente com o tamanho. O número de cópulas (espematóforos) e a fertilidade não variaram em função do peso pupal. Os resultados enfatizam a importância de indicar o número de cópulas e o tamanho dos insetos estudados para que comparações entre os parâmetros reprodutivos possam ser efetuadas.

VIABILIDADE ESPERMÁTICA DE Macrobrachium amazonicum SUBMETIDOS A DOIS MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE ESPERMATÓFORO

Na aquicultura mundial o cultivo de camarão de água doce tem apresentado um elevado crescimento, sendo uma das espécies mais cultivadas o Macrobrachium amazonicum, que apresenta população de machos adultos podendo ser classificada em quatro morfotipos, diferindo entre si em tamanho, morfologia, fisiologia e comportamento. O objetivo deste trabalho foi verificar a qualidade e viabilidade de espermatóforos e espermatozoides de M. amazonicum submetidos a diferentes formas de extração. Foram utilizados 60 animais machos, entre duas baterias, destes, 30 utilizados para a extração manual e os outros 30 para eletroejaculação. Os animais eram observados diariamente e os parâmetros da água, temperatura e pH monitorados diariamente e feitos a cada dois dias testes de amônia e nitrito. Os espermatóforos extraídos foram então armazenados em microtubos de 1,5 mL contendo solução fisiológica (NaCl a 0,9%) e mantidos em temperatura ambiente. Para a avaliar da porcentagem aparente de espermatozoides vivos e mortos, foram utilizados 50 L de solução composta pelos corantes eosina-nigrosina e adicionada em 50 L de solução espermática. Posteriormente amostras de 25 L da solução total foram levadas a câmara de Neubauer para serem analisadas utilizando microscópio óptico com aumento de 40x. A porcentagem de espermatozoides vivos foi calculada a partir da contagem de 100 espermatozoides. Os dois métodos se mostraram eficientes na extração dos espermatóforos, não apresentando diferença significativa entre eles quanto a taxa de sobrevivência dos espermatozoides (P>0,05). Entretanto, verificou-se diferença (P<0,05) no tamanho e integridade dos espermatóforos extraídos, apresentando os seguintes valores médios finais (±DP) 1,69mm (± 0,53) obtidos manualmente e 3,12mm (± 1,06) eletricamente. Desta forma a extração elétrica se mostrou mais eficiente na obtenção de espermatóforo quando comparada a extração manual.

In aquaculture worldwide the cultivation of freshwater shrimp has shown a high growth, being one of the most cultivated species the Macrobrachium amazonicum, which has a population of adult males and can be superior in four morphotypes, differing in size, morphology, physiology and behavior. The objective of this work was to verify the quality and viability of spermatophores and spermatozoa of M. amazonicum in different forms of extraction. 60 male animals were used, between two batteries, of these, 30 used for manual extraction and the other 30 for electroejaculation. The animals were observed daily and the water, temperature and pH parameters were monitored daily and ammonia and nitrite tests were performed every two days. The extracted spermatophores were then stored in 1.5 mL microtubes containing saline (0.9% NaCl) and collect at room temperature. For the evaluation of the apparent percentage of live and dead sperm, 50 L of solution composed by the dyes eosin-nigrosine and Added in 50 L of sperm solution were used. Subsequently, they removed 25 L of the total solution and were taken to the Neubauer chamber to be analyzed using an optical microscope with a 40x magnification. The percentage of live sperm was calculated from the count of 100 sperm. Both methods improve sperm extraction, they do not increase the difference between them in terms of sperm taxa (P> 0.05). However, there was a difference (P <0.05) in the size and integrity of the extracted spermatophores, these following final mean values (± SD) 1.69mm (± 0.53) manually adjusted and 3.12mm (± 1.06) electrically. Thus, electrical extraction has become more efficient in obtaining spermatophore when compared to manual extraction.

Criopreservação do espermatóforo e da massa espermática do camarão branco Litopenaeus schmitti post-mortem / Post-mortem spermatophore and sperm cryopreservation of the white shrimp Litopenaeus schmitti

This study was carried out in two phases; the first to evaluate the viability of two cooling protocols (A and B) using glycerol (10%) as a cryoprotectant and the second, the efficiency of two cryoprotectants (10% glycerol and DMSO) and times (30, 60 and 90 days of storage in liquid nitrogen) for the cryopreservation of post-mortem sperm mass and spermatophores of the shrimp Litopenaeus schmitti. The protocol A presented a cooling rate of 0.5C min-1 until reaching -32ºC and protocol B, 20ºC min-1 until reach -120ºC, after which the samples were transferred to liquid nitrogen (N2L). The sperm viability was assessed by smearing the semen stained with eosin-nigrosin. The curve resulted in higher mean sperm survival was Protocol A (50.9%). Therefore, for the second experiment, the protocol A was used, however there was no difference between the cryoprotectants for sperm mass, although the influence on survival time. Difference was observed between the cryoprotectants and the influence of time on sperm survival of cryopreserved spermatophores. Glycerol 10% was more efficient for cryopreservation of spermatophore, but for the masses sperm, both can be used.(AU)

O presente trabalho foi realizado em duas etapas; a primeira para avaliar a eficiência de dois protocolos de resfriamento (A e B) utilizando glicerol (10%) como crioprotetor e, a segunda, a eficiência de dois crioprotetores (glicerol e dimetilsulfóxido - DMSO a 10%) e o tempo (30, 60 e 90 dias de estocagem em nitrogênio líquido) para a criopreservação da massa espermática e espermatóforo de camarões post mortem da espécie Litopenaeus schmitti. O protocolo A apresentou velocidade de resfriamento de 0,5ºC min-1 até alcançar -32ºC e o protocolo B, 20ºC min-1 até alcançar -120ºC, sendo os materiais posteriormente transferidos para o nitrogênio líquido (N2L). A viabilidade espermática foi avaliada por meio do esfregaço de sêmen corado com eosina-nigrosina. A curva que resultou na maior média de sobrevivência espermática foi a do protocolo A (50,9%). Portanto, para o segundo experimento foi utilizado o protocolo A; entretanto, neste não houve diferença entre os crioprotetores para a massa espermática, contudo, o tempo influenciou na sobrevivência. Foi observada diferença entre os crioprotetores e a influência do tempo na sobrevivência espermática dos espermatóforos criopreservados. O glicerol a 10% foi mais eficiente para a criopreservação dos espermatóforos, porém, para as massas espermáticas, ambos podem ser utilizados.(AU)

Criopreservação do espermatóforo e da massa espermática do camarão branco Litopenaeus schmitti post-mortem / Post-mortem spermatophore and sperm cryopreservation of the white shrimp Litopenaeus schmitti

This study was carried out in two phases; the first to evaluate the viability of two cooling protocols (A and B) using glycerol (10%) as a cryoprotectant and the second, the efficiency of two cryoprotectants (10% glycerol and DMSO) and times (30, 60 and 90 days of storage in liquid nitrogen) for the cryopreservation of post-mortem sperm mass and spermatophores of the shrimp Litopenaeus schmitti. The protocol A presented a cooling rate of 0.5C min-1 until reaching -32ºC and protocol B, 20ºC min-1 until reach -120ºC, after which the samples were transferred to liquid nitrogen (N2L). The sperm viability was assessed by smearing the semen stained with eosin-nigrosin. The curve resulted in higher mean sperm survival was Protocol A (50.9%). Therefore, for the second experiment, the protocol A was used, however there was no difference between the cryoprotectants for sperm mass, although the influence on survival time. Difference was observed between the cryoprotectants and the influence of time on sperm survival of cryopreserved spermatophores. Glycerol 10% was more efficient for cryopreservation of spermatophore, but for the masses sperm, both can be used.

O presente trabalho foi realizado em duas etapas; a primeira para avaliar a eficiência de dois protocolos de resfriamento (A e B) utilizando glicerol (10%) como crioprotetor e, a segunda, a eficiência de dois crioprotetores (glicerol e dimetilsulfóxido - DMSO a 10%) e o tempo (30, 60 e 90 dias de estocagem em nitrogênio líquido) para a criopreservação da massa espermática e espermatóforo de camarões post mortem da espécie Litopenaeus schmitti. O protocolo A apresentou velocidade de resfriamento de 0,5ºC min-1 até alcançar -32ºC e o protocolo B, 20ºC min-1 até alcançar -120ºC, sendo os materiais posteriormente transferidos para o nitrogênio líquido (N2L). A viabilidade espermática foi avaliada por meio do esfregaço de sêmen corado com eosina-nigrosina. A curva que resultou na maior média de sobrevivência espermática foi a do protocolo A (50,9%). Portanto, para o segundo experimento foi utilizado o protocolo A; entretanto, neste não houve diferença entre os crioprotetores para a massa espermática, contudo, o tempo influenciou na sobrevivência. Foi observada diferença entre os crioprotetores e a influência do tempo na sobrevivência espermática dos espermatóforos criopreservados. O glicerol a 10% foi mais eficiente para a criopreservação dos espermatóforos, porém, para as massas espermáticas, ambos podem ser utilizados.

TOXICIDADE DE AGENTES CRIOPROTETORES EM CÉLULAS ESPERMÁTICAS DE Macrobrachium amazonicum (Heller 1862) (Decapoda, Palaemonidae)

As técnicas de criopreservação têm se destacado na aquicultura por viabilizar a estocagem e o transporte de material genético. Para tanto o uso de agentes crioprotetores são comumente empregados, contudo, quando utilizados em altas concentrações podem apresentar efeitos tóxicos. Assim, testes prévios de toxicidade são capazes de estabelecer as concentrações mais eficazes para os protocolos de criopreservação. Este estudo avaliou os efeitos de toxicidade dos agentes crioprotetores dimetilsulfóxido (DMSO), etilenoglicol (EG) e glicerol (GLY) na massa espermática de M. amazonicum. Para o presente experimento, 150 espermatóforos foram coletados de 30 machos de M. amazonicum, usando uma adaptação da técnica de leve compressão abdominal. A massa espermática foi extrusada, formando pools e submetida em DMSO, GLY e EG nas concentrações de 5, 10 e 15% v/v, preparada em solução salina estéril livre de cálcio (Ca-F) durante 30 minutos de tempo de equilíbrio. O percentual de espermatozoides vivos foi determinado por um teste modificado de coloração com eosina-nigrosina e os espermatozoides foram contados em microscópio óptico (40x) com auxílio de um hemicitômetro (câmara de Neubauer). Os resultados foram analisados utilizando análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey HSD e Dunnett a um nível de significância de 5%. De acordo com o teste de toxicidade, o GLY foi o menos tóxico entre os crioprotetores testados em comparação com o controle (P < 0,05) com 47,5 ± 2,2 de espermatozoides vivos. Os testes de toxicidade de DMSO não revelaram diferença estatisticamente significativa (P < 0,05) nas concentrações de 5, 10 e 15% com 18,6 ± 1,8, 19,2 ± 2,0 e 16,5 ± 2,7 de espermatozoides vivos, respectivamente. Para testes com EG, a concentração de 15% resultou em 100% de mortalidade nas células espermáticas testadas. Este estudo sugere que a massa espermática de M. amazonicum pode ser criopreservado utilizando GLY 5% como agente crioprotetor.

The cryopreservation techniques have been highlighted in aquaculture by enabling the storage and transport of genetic material. For this, the use of cryoprotectants is commonly used, however, when used in high concentrations they may present toxic effects. Thus, prior toxicity tests are able to establish the most effective concentrations for cryopreservation protocols. This study evaluated toxicity effects of cryoprotectants agents dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol (EG) and glycerol (GLY) on Macrobrachium amazonicum sperm mass. For the present experiment, 150 spermatophores were taken from 30 M. amazonicum males, collected using an adapting technique of gentle abdominal compression. The sperm mass were extruded in pools and submitted in DMSO, GLY and EG at concentrations of 5, 10 and 15% v/v, prepared in sterile Calcium Free saline (Ca-F saline) for 30 min of equilibration time. The survival of the sperm was determined by staining with eosin-nigrosin modified and sperm cells were counted in the optical microscope (40x) with the aid of a hemacytometer (Neubauer chamber). Results were analysed using analysis of variance (ANOVA), Tukeys and Dunnetts test at a 5% significance level. According cryoprotectant toxicity assay, GLY was less toxic among the tested cryoprotectants compared to control (P < 0.05) with 47.5 ± 2.2 of viability sperm. DMSO toxicity tests revealed no statistically significant difference (P < 0.05) between 5, 10 and 15% sperm viability with 18.6 ± 1.8, 19.2 ± 2.0 and 16.5 ± 2.7 respectively. For tests with EG, the concentration of 15% resulted in 100% mortality to tested sperm. This study suggests that sperm mass from M. amazonicum can be cryopreserved using GLY 5% as a cryoprotective agent.

O enigma da "reação espermatofórica": breve síntese do conhecimento sobre a estrutura e o funcionamento dos espermatóforos dos cefalópodes (Mollusca: Cephalopoda)

Coleoid cephalopods (squids, cuttlefishes, and octopods) produce elaborate spermatophores, which are transferred to the female during mating with the aid of a modified appendage called hectocotylus. During transfer, the spermatophores undergo the so-called spermatophoric reaction, i.e., a complex process of evagination of the ejaculatory apparatus that, ultimately, leads to the extrusion of the cement body and sperm mass. The present review summarizes the bulk of our knowledge on the morphology and functioning of this exclusive coleoid character, identifying gaps and defining strategies to stimulate advancements in this area. Few detailed morphological studies regarding this structure have yet been conducted, and much of the knowledge on the coleoid spermatophore was generated by classical studies of the 19th and early 20th centuries. Furthermore, investigations on the functioning of this structure are even rarer, the basic knowledge of the spermatophoric reaction being restricted to 19 species. There seems to be a consensus in the literature that two types of attachment of spermatophores occur in decapodiforms (i.e., squids and sepioids): superficial attachment, and deep (or intradermal) implantation. In superficial attachment, the base of the spermatangia ends up attached on the surface of the female's body, by means of the adhesive contents and, in some cases, attachment structures of the cement body; this type is found in several groups of decapodiforms (e.g., Loliginidae, Ommastrephidae, Sepiidae). In deep implantation, the spermatangia penetrate autonomously the integument, embedding themselves completely into the female tissue; this strategy is common to some oceanic and deep-sea species (e.g., Architeuthidae, Cranchiidae, Octopoteuthidae, Sepiolidae). The mechanism responsible for deep implantation remains unknown. In octopodiforms (octopods), the spermatophore is inserted inside the lumen of the female gonoduct, reaching the oviducal gland, where the spermathecae are located, or the ovarian cavity. Since the extracorporeal functioning of coleoid spermatophores must rely entirely on the intricate structure and organization of the tunics, membranes, and other structures composing the spermatophore, only detailed investigations of these components would provide the basis for comprehending its mechanics. This paper recommends the development of a specific, efficient protocol for whole-mount staining and permanent preparation of coleoid spermatophores, in order to enable expansion of spermatophore morphological descriptions in taxonomic and anatomical studies, and therefore enhance the knowledge of this unique, still enigmatic structure.

Cefalópodes coleóides (lulas, sépias e polvos) produzem espermatóforos muito complexos que são transferidos à fêmea durante a cópula por meio do hectocótilo, um apêndice modificado nos machos. Durante a transferência à fêmea, ocorre a chamada "reação espermatofórica", complexo processo de evaginação do aparato ejaculatório do espermatóforo, que conduz à exteriorização da massa espermática e corpo cimentante. A presente revisão sintetiza o conhecimento acerca da morfologia e funcionamento desta estrutura exclusiva dos coleóides, identificando lacunas e definindo estratégias que possibilitem avanços na área. Poucos trabalhos abordam com detalhes a morfologia e anatomia funcional dos espermatóforos dos cefalópodes, grande parte do conhecimento acerca da estrutura do espermatóforo tendo sido gerada por trabalhos clássicos do século XIX e início do século XX. Investigações acerca do funcionamento dos espermatóforos são consideravelmente mais raras, estando o conhecimento básico sobre a reação espermatofórica restrito a apenas 19 espécies de coleóides. A revisão da literatura especializada permite sugerir que existem dois tipos básicos de fixação de espermatóforos em Decapodiformes (lulas e sepióides): fixação superficial e implante profundo (ou intra-dérmico). Na fixação superficial, comum em diversas espécies (e.g., Loliginidae, Sepiidae, Ommastrephidae), a base dos espermatângios é aderida ao tecido-alvo aparentemente por meio do corpo cimentante, a partir de substâncias adesivas e, em alguns casos, estruturas de fixação. No implante profundo, comum em alguns grupos de lulas oceânicas e de águas profundas (e.g., Architeuthidae, Cranchiidae, Octopoteuthidae, Sepiolidae), os espermatóforos implantam-se inteiramente no corpo da fêmea, de forma autônoma. Permanece desconhecido o mecanismo responsável pelo implante profundo. Em Octopodiformes (polvos), o espermatóforo é inserido no gonoduto feminino, alcançando a glândula oviducal, onde estão localizadas as espermatecas, ou a cavidade do ovário. Como o funcionamento extracorpóreo dos espermatóforos depende exclusivamente da intrincada estrutura e organização de seus componentes (e.g., membranas e túnicas), somente investigações detalhadas dessas estruturas proverão as bases para a compreensão do funcionamento e da exata função do complexo espermatóforo dos coleóides. Recomenda-se o desenvolvimento de um protocolo simples e eficiente para coloração e preparação total de espermatóforos, de forma que seja possível expandir as descrições morfológicas do espermatóforo em estudos taxonômicos e anatômicos, permitindo, portanto, ampliação do conhecimento acerca desta enigmática estrutura.

INFLUÊNCIA DE VARIÁVEIS AMBIENTAIS NA ESTRUTURA POPULACIONAL E A BIOLOGIA REPRODUTIVA FOCADA NOS ESPERMATÓFOROS DO POLVO, OCTOPUS INSULARIS

Polvos, são organismos marinhos pertencentes ao Filo Mollusca e estão distribuídos ao redor do mundo, sendo importantes para o ecossistema marinho atuando como predadores oportunistas e de grande importância econômica, pois faz parte de diversas pescaria. Embora, ainda não se saiba até que ponto estes animais consigam resistir à pressão da pesca. Com relação a reprodução esses organismos são dióicos com reprodução única (semelparidade), apresentando alta fecundidade com cópulas. As paralarvas de Octopus insularissão planctônicas, dando ao O. insularisuma alta capacidade de dispersão. Porém, estudos de biologia reprodutiva do O. insularisainda são escassos, sendo restrito basicamente a fêmeas e as estruturas do aparelho reprodutivo e ao tamanho que essesanimais atingem a maturaçãoe não existindo nenhuma informação sobre a complexa estrutura responsável pela fertilização dos ovócitos, no caso, os espermatóforosEsse trabalho tem como objetivo analisar a influência de variáveis ambientaisna estrutura populacional e a biologia reprodutiva focada nos espermatóforos do polvo, Octopus insularis. Para isto, será necessário analisar os parâmetrosda biologia populacional, descrever o espermatóforo e descrever a reação espermatofórica.Esta tese está dividida emtrês capítulos que abordam a 1) A estrutura populacional do polvo, Octopus insulariscapturado com espinhel de potes relacionado com variáveis ambientais, que apresentou variações de tamanho corporal significativa no período chuvoso, possivelmente relacionada ao período de reprodução e foi observado um sincronismo entre a variáveis ambientaise o ciclo de vida destes animais. 2) A descrição morfológica e anatomia funcional do espermatóforo do polvo, Octopus insularis,que é dividido em duas estruturas a massa espermática na região aboral sendo coberta pela túnica externa e média e o aparato ejaculatório que é separado pelo liquido granular e o aparato é recoberto pela túnica interna e membrana interna, protegendo o filamento espiral. 3) A reação espermatofórica in vitro do polvo, Octopus insularisque dura cerca de 15 minutos é iniciada com a evaginação do aparato ejaculatório e consequente lançamento da massa espermática no meio.

Octopus, are marine organisms belonging to the Filo Mollusca and are distributed around the world and are important to the marine ecosystem acting as opportunists and predators of great economic importance because itis part of several fishing. Although not yet know the extent to which these animals are able to withstand fishing pressure. In regard reproduction these organisms are dioecious with only playback (semelpareous), with high fertility with copulations.The paralavaesof O. insularisare planktonic, giving the species a high dispersal capacity. However, reproductive biology studies of O. insularis are still scarce, being restricted primarily to females and reproductive tract structures and size that these animals reach maturity. There is anabsence of any information about the complex structure responsible for the fertilization of the oocytes in the case, the spermatophores.This work aims to analyze the influence of environmental variables in the population structure and reproductive biology focused on the spermatophores octopus, Octopus insularis. For this, we need to analyze the parameters of population biology, describe the spermatophore and describe the spermatophoricreaction. This thesis is divided in three chapters that discuss: 1) Population structureofOctopus insulariscaught using longline pots related with environmentalvariables that had a significant body size variations in the rainy season, possibly related to the breeding period and was observedsynchronism between the environmentalvariables and the life cycle of these animals. 2) Morphological description and functional anatomyfromspermatophoreof theOctopus insularis, which is divided into two structures sperm mass on aboral region being covered by the outer and middle layer and the ejaculatory apparatus that is separated by the granular liquid and the apparatus is covered by domestic and inner membrane coat, protecting the spiral filament. 3) Spermatophoric reaction in vitro octopus, Octopus insulariswhich lasts about 15 minutes starts with the outgrowth of ejaculatory apparatus and consequent release of sperm mass in the middle.

O enigma da "reação espermatofórica": breve síntese do conhecimento sobre a estrutura e o funcionamento dos espermatóforos dos cefalópodes (Mollusca: Cephalopoda)

Coleoid cephalopods (squids, cuttlefishes, and octopods) produce elaborate spermatophores, which are transferred to the female during mating with the aid of a modified appendage called hectocotylus. During transfer, the spermatophores undergo the so-called spermatophoric reaction, i.e., a complex process of evagination of the ejaculatory apparatus that, ultimately, leads to the extrusion of the cement body and sperm mass. The present review summarizes the bulk of our knowledge on the morphology and functioning of this exclusive coleoid character, identifying gaps and defining strategies to stimulate advancements in this area. Few detailed morphological studies regarding this structure have yet been conducted, and much of the knowledge on the coleoid spermatophore was generated by classical studies of the 19th and early 20th centuries. Furthermore, investigations on the functioning of this structure are even rarer, the basic knowledge of the spermatophoric reaction being restricted to 19 species. There seems to be a consensus in the literature that two types of attachment of spermatophores occur in decapodiforms (i.e., squids and sepioids): superficial attachment, and deep (or intradermal) implantation. In superficial attachment, the base of the spermatangia ends up attached on the surface of the female's body, by means of the adhesive contents and, in some cases, attachment structures of the cement body; this type is found in several groups of decapodiforms (e.g., Loliginidae, Ommastrephidae, Sepiidae). In deep implantation, the spermatangia penetrate autonomously the integument, embedding themselves completely into the female tissue; this strategy is common to some oceanic and deep-sea species (e.g., Architeuthidae, Cranchiidae, Octopoteuthidae, Sepiolidae). The mechanism responsible for deep implantation remains unknown. In octopodiforms (octopods), the spermatophore is inserted inside the lumen of the female gonoduct, reaching the oviducal gland, where the spermathecae are located, or the ovarian cavity. Since the extracorporeal functioning of coleoid spermatophores must rely entirely on the intricate structure and organization of the tunics, membranes, and other structures composing the spermatophore, only detailed investigations of these components would provide the basis for comprehending its mechanics. This paper recommends the development of a specific, efficient protocol for whole-mount staining and permanent preparation of coleoid spermatophores, in order to enable expansion of spermatophore morphological descriptions in taxonomic and anatomical studies, and therefore enhance the knowledge of this unique, still enigmatic structure.

Cefalópodes coleóides (lulas, sépias e polvos) produzem espermatóforos muito complexos que são transferidos à fêmea durante a cópula por meio do hectocótilo, um apêndice modificado nos machos. Durante a transferência à fêmea, ocorre a chamada "reação espermatofórica", complexo processo de evaginação do aparato ejaculatório do espermatóforo, que conduz à exteriorização da massa espermática e corpo cimentante. A presente revisão sintetiza o conhecimento acerca da morfologia e funcionamento desta estrutura exclusiva dos coleóides, identificando lacunas e definindo estratégias que possibilitem avanços na área. Poucos trabalhos abordam com detalhes a morfologia e anatomia funcional dos espermatóforos dos cefalópodes, grande parte do conhecimento acerca da estrutura do espermatóforo tendo sido gerada por trabalhos clássicos do século XIX e início do século XX. Investigações acerca do funcionamento dos espermatóforos são consideravelmente mais raras, estando o conhecimento básico sobre a reação espermatofórica restrito a apenas 19 espécies de coleóides. A revisão da literatura especializada permite sugerir que existem dois tipos básicos de fixação de espermatóforos em Decapodiformes (lulas e sepióides): fixação superficial e implante profundo (ou intra-dérmico). Na fixação superficial, comum em diversas espécies (e.g., Loliginidae, Sepiidae, Ommastrephidae), a base dos espermatângios é aderida ao tecido-alvo aparentemente por meio do corpo cimentante, a partir de substâncias adesivas e, em alguns casos, estruturas de fixação. No implante profundo, comum em alguns grupos de lulas oceânicas e de águas profundas (e.g., Architeuthidae, Cranchiidae, Octopoteuthidae, Sepiolidae), os espermatóforos implantam-se inteiramente no corpo da fêmea, de forma autônoma. Permanece desconhecido o mecanismo responsável pelo implante profundo. Em Octopodiformes (polvos), o espermatóforo é inserido no gonoduto feminino, alcançando a glândula oviducal, onde estão localizadas as espermatecas, ou a cavidade do ovário. Como o funcionamento extracorpóreo dos espermatóforos depende exclusivamente da intrincada estrutura e organização de seus componentes (e.g., membranas e túnicas), somente investigações detalhadas dessas estruturas proverão as bases para a compreensão do funcionamento e da exata função do complexo espermatóforo dos coleóides. Recomenda-se o desenvolvimento de um protocolo simples e eficiente para coloração e preparação total de espermatóforos, de forma que seja possível expandir as descrições morfológicas do espermatóforo em estudos taxonômicos e anatômicos, permitindo, portanto, ampliação do conhecimento acerca desta enigmática estrutura.

Métodos de extrusão manual e elétrica dos espermatóforos de reprodutores selvagens do camarão-rosa Farfantepenaeus paulensis (Decapoda: Penaeidae)

The present study compared manual and electrical methods to extrude the spermatophore of the pink shrimp Farfantepenaeus paulensis aiming to analyze their influence on the number of spermatic cells and spermatophore regeneration. The males were extruded in the beginning (day zero) and in the end (43rd day) of the experiment to evaluate the efficiency of these methods in the regeneration process. For the extrusion, a gentle pressure was applied manually in the fifth pair of pereiopods or electrically by a 9 volt pulse in the same area. Both methods were efficient in removing the spermatophore and no significant differences were found (P>0.05) in the number of sperm cells. Nevertheless, significant decreases (P 0.05) in the body weight, spermatophore weight and spermatosomatic index (ESI) at the end of the experimental period were observed by using the electrical stimulation. The mean values (±SD) of the number of sperm cells were 1.46 (±0.84) and 3.25 (±2.12) millions for the electrical and manual treatments, respectively. Results indicate that both methods may be applied to collect initial samples of spermatophores as well as for sperm quality testing. However, when previously spermatophore-extruded males are to be used, the manual method is indicated as the number of spermatic cells, spermatophore weight, body weight, and ESI are maintained after regeneration.

O presente estudo comparou os métodos manual e elétrico de extrusão do espermatóforo do camarão-rosa Farfantepenaeus paulensis com o objetivo de verificar se os métodos de extrusão exercem influência na quantidade de células espermáticas e na regeneração de novos espermatóforos. Os machos foram extrusados no início (dia zero) e no final do experimento (dia 43) para verificação da eficiência dos métodos no processo de regeneração. A extrusão manual foi realizada por meio de pressão na região do quinto par de pereiópodos e o método elétrico com uso de eletrodo para transmissão de impulso elétrico de 9 volts na mesma região. Os dois métodos foram considerados eficientes, não sendo encontradas diferenças significativas entre estes (P>0,05) para o número de células espermáticas. Entretanto, foi verificada, no final do experimento, a perda de peso corporal, peso de espermatóforo e menor índice espermatossomático (IES) (P 0,05) nos animais submetidos a extrusão do espermatóforo por estímulo elétrico. Os valores médios finais (±DP) do número de espermatozóides foram 1,46 (±0,84) e 3,25 milhões (±2,12) para os tratamentos com método elétrico e manual, respectivamente. Os resultados indicam que ambos os métodos podem ser utilizados para a coleta inicial de espermatóforos e testes de qualidade de espermatozóide. Entretanto, para a reutilização dos machos após a extrusão inicial do espermatóforo, o método manual é mais indicado pela manutenção do número de células espermáticas, peso do espermatóforo, peso corporal e índice espermatossomático após a regeneração.

Métodos de extrusão manual e elétrica dos espermatóforos de reprodutores selvagens do camarão-rosa Farfantepenaeus paulensis (Decapoda: Penaeidae)

The present study compared manual and electrical methods to extrude the spermatophore of the pink shrimp Farfantepenaeus paulensis aiming to analyze their influence on the number of spermatic cells and spermatophore regeneration. The males were extruded in the beginning (day zero) and in the end (43rd day) of the experiment to evaluate the efficiency of these methods in the regeneration process. For the extrusion, a gentle pressure was applied manually in the fifth pair of pereiopods or electrically by a 9 volt pulse in the same area. Both methods were efficient in removing the spermatophore and no significant differences were found (P>0.05) in the number of sperm cells. Nevertheless, significant decreases (P 0.05) in the body weight, spermatophore weight and spermatosomatic index (ESI) at the end of the experimental period were observed by using the electrical stimulation. The mean values (±SD) of the number of sperm cells were 1.46 (±0.84) and 3.25 (±2.12) millions for the electrical and manual treatments, respectively. Results indicate that both methods may be applied to collect initial samples of spermatophores as well as for sperm quality testing. However, when previously spermatophore-extruded males are to be used, the manual method is indicated as the number of spermatic cells, spermatophore weight, body weight, and ESI are maintained after regeneration.

O presente estudo comparou os métodos manual e elétrico de extrusão do espermatóforo do camarão-rosa Farfantepenaeus paulensis com o objetivo de verificar se os métodos de extrusão exercem influência na quantidade de células espermáticas e na regeneração de novos espermatóforos. Os machos foram extrusados no início (dia zero) e no final do experimento (dia 43) para verificação da eficiência dos métodos no processo de regeneração. A extrusão manual foi realizada por meio de pressão na região do quinto par de pereiópodos e o método elétrico com uso de eletrodo para transmissão de impulso elétrico de 9 volts na mesma região. Os dois métodos foram considerados eficientes, não sendo encontradas diferenças significativas entre estes (P>0,05) para o número de células espermáticas. Entretanto, foi verificada, no final do experimento, a perda de peso corporal, peso de espermatóforo e menor índice espermatossomático (IES) (P 0,05) nos animais submetidos a extrusão do espermatóforo por estímulo elétrico. Os valores médios finais (±DP) do número de espermatozóides foram 1,46 (±0,84) e 3,25 milhões (±2,12) para os tratamentos com método elétrico e manual, respectivamente. Os resultados indicam que ambos os métodos podem ser utilizados para a coleta inicial de espermatóforos e testes de qualidade de espermatozóide. Entretanto, para a reutilização dos machos após a extrusão inicial do espermatóforo, o método manual é mais indicado pela manutenção do número de células espermáticas, peso do espermatóforo, peso corporal e índice espermatossomático após a regeneração.

Histological and histochemical characterization of the secretory cells of Choeradoplana iheringi Graff, 1899 (Platyhelminthes: Tricladida: Terricola)

The present study aims at providing a detailed description of the histology, as well as the first histochemical characterization, of the secretory cells of the epidermis, pharynx, and copulatory organs of Choeradoplana iheringi, in order to give further support to studies on the physiology of these organs. The secretory cells are distinguished on the basis of secretion morphology and its staining properties, using trichrome methods and histochemical reactions. Four cell types open through the epidermis of Ch. iheringi, three of them secreting basic protein and a fourth containing glycosaminoglycan mucins. The epidermal lining cells store glycogen. In the pharynx, four secretory cell types were distinguished. Two types produce glycoprotein, a third type secretes basic protein, and another one produces glycosaminoglycan mucins. In the male copulatory organs, the prostatic vesicle receives four secretory cell types containing basic protein, except for one type which produces glycoprotein. The two secretory cell types opening into the male atrium secrete, respectively, glycoprotein, and glycosaminoglycan mucins. In the female copulatory organs, the female atrium and its proximal diverticulum, the vagina, receive two types of secretory cells producing, respectively, basic protein and glycosaminoglycan mucins. Another secretory cell type constitutes the so-called shell glands which open into the common glandular duct, secreting basic protein. The lining cells of the male and female atria produce a mucous secretion containing glycosaminoglycans. In addition, the lining epithelium of the female atrium presents an apical secretion of a proteic nature. The occurrence of a kind of spermatophore is reported for the first time for a species of Choeradoplana. This structure is located in the male or female atria in different specimens, and characterized by erythrophil, xanthophil, and/or mixed secretions associated with sperm.

O presente estudo tem por objetivo fornecer detalhada descrição da histologia e a primeira caracterização histoquímica das células secretoras da epiderme, da faringe e do aparelho reprodutor de Ch. iheringi, visando a propor estudos da fisiologia desses órgãos. As células secretoras foram diferenciadas com base na morfologia da secreção e em sua coloração, com métodos tricrômicos e reações histoquímicas. Quatro tipos de células secretoras desembocam na epiderme de Ch. iheringi, sendo três com secreção protéica básica e uma do tipo mucoso, contendo glicosaminoglicanas. As células de revestimento que compõem a epiderme armazenam glicogênio. Na faringe, quatro tipos de células secretoras são observadas: duas produzem secreção de natureza glicoprotéica, uma apresenta secreção protéica básica e uma secreta glicosaminoglicanas. No aparelho copulador masculino, em sua vesícula prostática desembocam quatro tipos de células secretoras, as quais contêm secreção protéica básica, excetuando uma cuja secreção é de natureza glicoprotéica. O átrio masculino recebe a desembocadura de dois tipos de células secretoras, um tipo contendo secreção glicoprotéica e outro, glicosaminoglicanas. No aparelho copulador feminino, o átrio feminino e seu divertículo ental, a vagina, recebem a desembocadura de dois tipos de células secretoras, que produzem, respectivamente, proteína básica e glicosaminoglicanas. Um outro tipo de célula secretora constitui as chamadas glândulas da casca, que desembocam no ducto glandular comum e secretam proteína básica. As células de revestimento dos átrios masculino e feminino produzem secreções mucosas constituídas por glicosaminoglicanas. O epitélio de revestimento do átrio feminino apresenta, ainda, um tipo diferenciado de secreção protéica acumulada apicalmente. A ocorrência de um tipo de espermatóforo é registrada pela primeira vez para uma espécie de Choeradoplana. Tal estrutura foi observada em três espécimes, ocorrendo no átrio masculino ou feminino, sendo caracterizada pela associação de espermatozóides com secreções eritrófilas, xantófilas e/ou mistas.

Histological and histochemical characterization of the secretory cells of Choeradoplana iheringi Graff, 1899 (Platyhelminthes: Tricladida: Terricola)

The present study aims at providing a detailed description of the histology, as well as the first histochemical characterization, of the secretory cells of the epidermis, pharynx, and copulatory organs of Choeradoplana iheringi, in order to give further support to studies on the physiology of these organs. The secretory cells are distinguished on the basis of secretion morphology and its staining properties, using trichrome methods and histochemical reactions. Four cell types open through the epidermis of Ch. iheringi, three of them secreting basic protein and a fourth containing glycosaminoglycan mucins. The epidermal lining cells store glycogen. In the pharynx, four secretory cell types were distinguished. Two types produce glycoprotein, a third type secretes basic protein, and another one produces glycosaminoglycan mucins. In the male copulatory organs, the prostatic vesicle receives four secretory cell types containing basic protein, except for one type which produces glycoprotein. The two secretory cell types opening into the male atrium secrete, respectively, glycoprotein, and glycosaminoglycan mucins. In the female copulatory organs, the female atrium and its proximal diverticulum, the vagina, receive two types of secretory cells producing, respectively, basic protein and glycosaminoglycan mucins. Another secretory cell type constitutes the so-called shell glands which open into the common glandular duct, secreting basic protein. The lining cells of the male and female atria produce a mucous secretion containing glycosaminoglycans. In addition, the lining epithelium of the female atrium presents an apical secretion of a proteic nature. The occurrence of a kind of spermatophore is reported for the first time for a species of Choeradoplana. This structure is located in the male or female atria in different specimens, and characterized by erythrophil, xanthophil, and/or mixed secretions associated with sperm.

O presente estudo tem por objetivo fornecer detalhada descrição da histologia e a primeira caracterização histoquímica das células secretoras da epiderme, da faringe e do aparelho reprodutor de Ch. iheringi, visando a propor estudos da fisiologia desses órgãos. As células secretoras foram diferenciadas com base na morfologia da secreção e em sua coloração, com métodos tricrômicos e reações histoquímicas. Quatro tipos de células secretoras desembocam na epiderme de Ch. iheringi, sendo três com secreção protéica básica e uma do tipo mucoso, contendo glicosaminoglicanas. As células de revestimento que compõem a epiderme armazenam glicogênio. Na faringe, quatro tipos de células secretoras são observadas: duas produzem secreção de natureza glicoprotéica, uma apresenta secreção protéica básica e uma secreta glicosaminoglicanas. No aparelho copulador masculino, em sua vesícula prostática desembocam quatro tipos de células secretoras, as quais contêm secreção protéica básica, excetuando uma cuja secreção é de natureza glicoprotéica. O átrio masculino recebe a desembocadura de dois tipos de células secretoras, um tipo contendo secreção glicoprotéica e outro, glicosaminoglicanas. No aparelho copulador feminino, o átrio feminino e seu divertículo ental, a vagina, recebem a desembocadura de dois tipos de células secretoras, que produzem, respectivamente, proteína básica e glicosaminoglicanas. Um outro tipo de célula secretora constitui as chamadas glândulas da casca, que desembocam no ducto glandular comum e secretam proteína básica. As células de revestimento dos átrios masculino e feminino produzem secreções mucosas constituídas por glicosaminoglicanas. O epitélio de revestimento do átrio feminino apresenta, ainda, um tipo diferenciado de secreção protéica acumulada apicalmente. A ocorrência de um tipo de espermatóforo é registrada pela primeira vez para uma espécie de Choeradoplana. Tal estrutura foi observada em três espécimes, ocorrendo no átrio masculino ou feminino, sendo caracterizada pela associação de espermatozóides com secreções eritrófilas, xantófilas e/ou mistas.