Rapd/pcr and phage typing of salmonella enteritidis isolated from poultry and food poisoning outbreaks

ABSTRACT Salmonella Enteritidis (SE) is an important pathogen, causing both food poisoning outbreaks in humans and economic losses to the poultry industry, being also widely spread in the environment. This work aimed to identify SE phage types and to standardize the Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) for evaluating SE isolates obtained from different origins. To do so, 238 SE strains were selected, of which 104 were isolated from broiler carcasses, 106 from food samples and human biological materials involved in food poisoning outbreaks and 28 from different poultry materials. Among these 238 SE isolates, 111 were phage typed, and 57.7% (64/ 111) corresponded to phage type (PT) 4, 32.4% (36/111) to PT 4a, 3.6% (4/111) to PT 6a and 0.9% (1/111) to PT 7, whereas 5.4% .6/111) of the strains were not typeable (RDNC, reacts but does not conform). After the standardization of amplification conditions, all 238 SE isolates were submitted to RAPD/PCR. Among these, 91.8% (217/238) were classified as pattern A. Twenty-one isolates were differentiated into four patterns and into seven subtypes with the use of primer 1254, and into four patterns and ten subtypes using primer OPB 17. The combination of phage typing and RAPD/PCR proved to be a useful tool in epidemiological investigations. RAPD/PCR can be easily used as a routine laboratory method, thus helping with the monitoring of SE isolates and contributing to the establishment of effective Salmonella Enteritidis control and preventive programs.

RESUMO Salmonella Enteritidis (SE) é um patógeno de importância destacada como causa de toxinfecções alimentares em humanos, prejuízos ao setor produtivo e ampla disseminação no ambiente. Este trabalho objetivou identificar fagotipos e padronizar a RAPD/PCR (DNA polimórfico amplificado ao acaso) para a avaliação de isolados de SE. Foram selecionadas 238 amostras, sendo 104 oriundas de carcaças de frango, 106 de alimentos e material biológico de humanos isolados em episódios de toxinfecções alimentares e 28 de materiais de origem avícola. Foram fagotipadas 111 amostras sendo 57,7% (64/111) do fagotipo 4, 32,4% (36/111) fagotipo 4a, 3,6% (4/111) fagotipo 6a e 0,9% (1/111) fagotipo 7, enquanto 5,4% (6/111) não foram fagotipáveis (RDNC, reagent do not conform). Para a RAPD/PCR foram utilizados 238 isolados de SE. Destes, 91,8% (217/238) foram enquadrados no padrão A e 21 isolados (8,8%) foram diferenciados em quatro padrões e sete subtipos com o primer 1254 e em quatro padrões e dez subtipos com o primer OPB 17. A facilidade de execução da RAPD/PCR, após padronizada, habilita a sua implantação em uma rotina laboratorial, auxiliando na monitoria dos isolados de SE e, conseqüentemente, contribuindo para a elaboração de programas efetivos de controle e prevenção de S. Enteritidis.

Phage typing and Multidrug resistance profile in S. Typhimurium isolated from different sources in Brazil from 1999 to 2004

Salmonella Typhimurium has become a widespread cause of salmonellosis among humans and animals worldwide. In Brazil, Salmonella Typhimurium (STM) is one of the most prevalent serovars isolated from food for human consumption. The uncontrolled sale and use of antimicrobials in agriculture and for treating human patients contributes to increase multidrug resistance of this serovar. In the present study, a total of 278 STM isolates from different sources and regions of Brazil over the period 1999 to 2004 were phage typed and analyzed for their antimicrobial resistance profile at Laboratory of Enterobacteria, Oswaldo Cruz Institute, FIOCRUZ. The main STM phage types isolated were DT 193 (64.3%), DT 19 (17.4%) and DT 18 (4%). Others phage types as DT 10 (2%), DT 27 (3.24%), DT 13 (0.36%), DT 22 (0.36%), DT 28 (0.36%), DT 29 (0.36%) and DT 149 (0.36%) were obtained in low percentages. A total of 54% STM strains were resistant to three or more antimicrobial classes, while no resistance to third generation cephalosporin or ciprofloxacin was identified in these strains. Those results show the STM phage types circulating among animals, food for human consumption and humans in Brazil as well as the increasing of multidrug resistance. The surveillance of STM strains based on phage typing and antimicrobial resistance profile are useful for detecting outbreaks, identifying sources of infection and implementing prevention and control measures.

Salmonella Typhimurium é considerada uma das principais bactérias causadoras de salmonelose nos animais e no homem em todo o mundo. No Brasil, Salmonella Typhimurium é um dos mais prevalentes sorovares isolados de alimentos para consumo humano. O uso indiscriminado de antibióticos em produtos agrícolas e no tratamento de pacientes humanos tem contribuído para aumentar a multirresistência desse sorovar a diversos antimicrobianos. No presente estudo, 278 cepas de STM foram selecionadas de diferentes fontes e regiões do Brasil, no período de 1999 a 2004 e realizadas a fagotipagem e análise do perfil de resistência antimicrobiana no Laboratório de Enterobactérias, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ. Os principais fagotipos isolados foram DT 193 (64,3%), DT 19 (17,4%) e DT 18 (4%). Os fagotipos DT 10 (2%), DT 27 (3,24%), DT 13 (0,36%), DT 22 (0,36%), DT 28 (0,36%), DT 29 (0,36%) e DT 149 (0,36%) foram isolados em menores percentuais. Um total de 54% das cepas de STM foi resistente a três ou mais classes de antimicrobianos e não foi observada resistência a cefalosporinas de terceira geração ou ciprofloxacina. Esses resultados indicam os principais lisotipos de Salmonella Typhimurium circulantes entre os animais, alimentos de consumo humano e seres humanos no Brasil, bem como o aumento da multirresistência antimicrobiana. O monitoramento de cepas de Salmonella Typhimurium baseado na fagotipagem e no padrão de resistência antimicrobiana são ferramentas úteis para detectar surtos, identificar a fonte de infecção e implementar programas de prevenção e controle de salmonelose.

Salmonella spp. in raw broiler parts: occurrence, antimicrobial resistance profile and phage typing of the Salmonella Enteritidis isolates

The present study was carried out to evaluate the occurrence of Salmonellae in raw broiler parts and to determine the antimicrobial resistance profile of the isolated strains. Twenty-four (39.3%) broiler parts samples were positive for Salmonella and twenty-five Salmonella strains were isolated, since two different serovars were detected in one single positive sample. Salmonella Enteritidis was the most prevalent serovar. Among Salmonella Enteritidis isolates, 95.2% belonged to Phage Type 4 (PT4) (20/21) and 4.8% to PT7 (1/21). Twenty-two (88%) strains of Salmonella were resistant to at least one antimicrobial agent, generating eight different resistance patterns. The S. Typhimurium (n: 1) and S. Hadar (n: 3) isolates presented multiple resistance. Three S. Enteritidis isolates were susceptible to all antimicrobials tested, two were resistant only to tetracycline. The high prevalence of Salmonella in the broiler parts strenghtens the importance of the use of good manufacturing practices (GMP), and HACCP. The results also emphasize the need for the responsible use of antimicrobials in animal production.

Este trabalho foi conduzido para avaliar a ocorrência de Salmonella em cortes de frango e para determinar o perfil de resistência antimicrobiana das cepas isoladas. Vinte e quatro (39,3%) cortes de frango foram positivas para Salmonella, tendo sido isoladas vinte e cinco cepas de Salmonella, uma vez que em uma amostra isolaram-se dois sorovares. Salmonella Enteritidis foi o sorovar prevalente. Entre as Salmonella Enteritidis isoladas, 95,2% pertencem ao Fagotipo 4 (PT4) (20/21) e 4,8% ao PT7 (1/21). Vinte e duas (88%) cepas de Salmonella foram resistentes a pelo menos um agente antimicrobiano e oito diferentes padrões de resistência foram observados. S. Typhimurium (n:1) e S. Hadar (n: 3), apresentaram múltipla resistência. Três cepas de S. Enteritidis foram sensíveis a todos os antimicrobianos e duas resistentes somente a tetraciclina. A elevada ocorrência de Salmonella nos cortes de frango utilizados no presente estudo reforça a importância das normas de boas práticas de fabricação, bem como dos controles de perigos e pontos críticos de controle. No tocante aos níveis de resistência a antimicrobianos, os resultados enfatizam a necessidade do uso responsável dos mesmos na produção animal.

Phenotypic and genotypic characterization of Salmonella Enteritidis isolates

In order to study the epidemiology of Salmonella Enteritidis outbreaks and determine the source of contamination so that a recurrence can be avoided, detailed characterization is necessary. Thus, the purpose of this study was to verify whether rep-PCR was able to discriminate among Salmonella Enteritidis isolates. Phage typing, detection of virulence genes and antimicrobial resistance testing were also associated to rep-PCR results. One hundred and two S. Enteritidis isolates from broiler carcasses, food, human, pigs, poultry-related samples, and nine isolates from other countries were genotypically typed by REP-PCR, ERIC-PCR and BOX-PCR, collectively called rep-PCR. Phage typing, detection of virulence genes and antimicrobial resistance testing were also performed. Only three fingerprinting profiles were obtained with each rep-PCR method, with the majority of isolates belonging to the same profile. No relationship was observed between genotypic profile and year, place of isolation or source of infection. However, the less frequent rep-PCR profiles showed single antimicrobial resistance patterns. Although few strains isolated from swine were analyzed, different antimicrobial resistance patterns were observed. Furthermore, phage type 4 was not found in swine isolates. rep-PCR showed a lower discriminatory power as compared with antimicrobial resistance and phage typing, but the combination of genotypic and phenotypic methods was more discriminatory than any method alone, resulting in 48 different types.

Uma caracterização detalhada de Salmonella Enteritidis é necessária para que possa ser desenvolvido o estudo da epidemiologia dos surtos causados por este organismo, bem como a determinação da fonte de contaminação, evitando que ocorram novos surtos. Assim, o objetivo deste estudo foi verificar se a rep-PCR era capaz de diferenciar isolados de S. Enteritidis. A fagotipagem, a detecção de genes de virulência e a determinação de resistência antimicrobiana foram associadas aos resultados da rep-PCR. Cento e duas S. Enteritidis isoladas de carcaças de frango, alimentos prontos para consumo, humanos suínos, amostras relacionadas a aves, e nove isolados de outros países foram genotipicamente tipados por REP-PCR, ERIC-PCR e BOX-PCR, juntamente chamados de rep-PCR. A fagotipagem, a detecção de genes de virulência e a determinação de resistência antimicrobiana também foram realizadas. Somente três padrões de fingerprinting foram obtidos com cada método de rep-PCR, sendo que a maioria dos isolados pertenceu ao mesmo perfil. Nenhuma relação foi observada entre o perfil genotípico e o ano, o local de isolamento e a fonte de infecção. Entretanto, os perfis menos freqüentes de rep-PCR apresentaram padrões de resistência antimicrobiana únicos. Embora poucas amostras de suínos tenham sido analisadas, diferentes padrões de resistência antimicrobiana foram observados. Além disso, o fagotipo 4 não foi encontrado em isolados de suínos. A rep-PCR apresentou um menor poder discriminatório quando comparada com a resistência antimicrobiana e com a fagotipagem, mas a combinação dos métodos genotípicos e fenotípicos foi mais discriminatória do que qualquer método isolado, resultando em 48 tipos diferentes.

Detecção de Salmonella sp. e caracterização de isolados de Salmonella Enteritidis pela presença de genes de virulência, resistência a antimicrobianos e rep-PCR Fingerprinting

A salmonelose é uma das zoonoses mais importantes em todo o mundo, e desde a década de 80, ocorreu um notável aumento no relato de isolamentos de Salmonella Enteritidis. Desta forma, torna-se cada vez mais relevante e necessária a implementação de técnicas que visem à sua detecção e identificação mais acuradas. Numa primeira etapa, este trabalho teve como objetivo avaliar a combinação da PCR com caldos de enriquecimento seletivo (PCR-RV) e não seletivo (PCR-NS) para a detecção e identificação de Salmonella sp. em amostras de origem avícola. A PCR-RV detectou significativamente mais amostras positivas para Salmonella do que a PCR-NS. A técnica microbiológica convencional também foi comparada às outras duas, mostrando ser mais sensível do que a PCR-NS, porém menos sensível do que a PCRRV. Em relação à identificação dos sorovares Typhimurium, Enteritidis, Gallinarum e Pullorum, a PCR-RV apresentou resultados similares à técnica convencional e ambas foram mais sensíveis do que PCR-NS. Na segunda etapa, foram caracterizadas 111 culturas de S. Enteritidis isoladas de humanos, alimentos, carcaças de frango, aves e suínos através de rep-PCR, presença de genes de virulência, resistência a antimicrobianos e da combinação destes com a fagotipagem. No teste de resistência a antimicrobianos, foi observada uma alta prevalência de resistência aos antimicrobianos testados. Os isolados de produ

Risk of food poisoning involving enterotoxigenic staphylococci carriers / Risco de intoxicação alimentar envolvendo portadores de Estafilococos Enterotoxigênicos

Healthy carriages constitute major reservoir of enterotoxigenic staphylococci. The intoxication occurs after ingestion of manipulated foods, maintained at inadequate preservation. This review discusses about the epidemiology at the interaction level between hospital professionals and food handlers, transferences of microorganisms and the possible development of enteroxigenic strains with high antibiotic resistence.

Portadores sãos constituem a principal fonte de estafilococos enterotoxigênicos, sendo a intoxicação resultante da ingestão de alimentos manipulados e mantidos sob condição inadequada. A revisão discute epidemiologia a nível de interação entre profissionais hospitalares e manipuladores, rastreamento e papel deste contato no surgimento de linhagens enterotoxigênicos resistentes a antibióticos.

Risk of food poisoning involving enterotoxigenic staphylococci carriers / Risco de intoxicação alimentar envolvendo portadores de Estafilococos Enterotoxigênicos

Healthy carriages constitute major reservoir of enterotoxigenic staphylococci. The intoxication occurs after ingestion of manipulated foods, maintained at inadequate preservation. This review discusses about the epidemiology at the interaction level between hospital professionals and food handlers, transferences of microorganisms and the possible development of enteroxigenic strains with high antibiotic resistence.  

Portadores sãos constituem a principal fonte de estafilococos enterotoxigênicos, sendo a intoxicação resultante da ingestão de alimentos manipulados e mantidos sob condição inadequada. A revisão discute epidemiologia a nível de interação entre profissionais hospitalares e manipuladores, rastreamento e papel deste contato no surgimento de linhagens enterotoxigênicos resistentes a antibióticos.    

Risk of food poisoning involving enterotoxigenic staphylococci carriers / Risco de intoxicação alimentar envolvendo portadores de Estafilococos Enterotoxigênicos

Healthy carriages constitute major reservoir of enterotoxigenic staphylococci. The intoxication occurs after ingestion of manipulated foods, maintained at inadequate preservation. This review discusses about the epidemiology at the interaction level between hospital professionals and food handlers, transferences of microorganisms and the possible development of enteroxigenic strains with high antibiotic resistence.  

Portadores sãos constituem a principal fonte de estafilococos enterotoxigênicos, sendo a intoxicação resultante da ingestão de alimentos manipulados e mantidos sob condição inadequada. A revisão discute epidemiologia a nível de interação entre profissionais hospitalares e manipuladores, rastreamento e papel deste contato no surgimento de linhagens enterotoxigênicos resistentes a antibióticos.    

Detecção de Salmonella sp. e caracterização de isolados de Salmonella Enteritidis pela presença de genes de virulência, resistência a antimicrobianos e rep-PCR Fingerprinting

A salmonelose é uma das zoonoses mais importantes em todo o mundo, e desde a década de 80, ocorreu um notável aumento no relato de isolamentos de Salmonella Enteritidis. Desta forma, torna-se cada vez mais relevante e necessária a implementação de técnicas que visem à sua detecção e identificação mais acuradas. Numa primeira etapa, este trabalho teve como objetivo avaliar a combinação da PCR com caldos de enriquecimento seletivo (PCR-RV) e não seletivo (PCR-NS) para a detecção e identificação de Salmonella sp. em amostras de origem avícola. A PCR-RV detectou significativamente mais amostras positivas para Salmonella do que a PCR-NS. A técnica microbiológica convencional também foi comparada às outras duas, mostrando ser mais sensível do que a PCR-NS, porém menos sensível do que a PCRRV. Em relação à identificação dos sorovares Typhimurium, Enteritidis, Gallinarum e Pullorum, a PCR-RV apresentou resultados similares à técnica convencional e ambas foram mais sensíveis do que PCR-NS. Na segunda etapa, foram caracterizadas 111 culturas de S. Enteritidis isoladas de humanos, alimentos, carcaças de frango, aves e suínos através de rep-PCR, presença de genes de virulência, resistência a antimicrobianos e da combinação destes com a fagotipagem. No teste de resistência a antimicrobianos, foi observada uma alta prevalência de resistência aos antimicrobianos testados. Os isolados de produ

Detecção de Salmonella sp. e caracterização de isolados de Salmonella Enteritidis pela presença de genes de virulência, resistência a antimicrobianos e rep-PCR Fingerprinting

A salmonelose é uma das zoonoses mais importantes em todo o mundo, e desde a década de 80, ocorreu um notável aumento no relato de isolamentos de Salmonella Enteritidis. Desta forma, torna-se cada vez mais relevante e necessária a implementação de técnicas que visem à sua detecção e identificação mais acuradas. Numa primeira etapa, este trabalho teve como objetivo avaliar a combinação da PCR com caldos de enriquecimento seletivo (PCR-RV) e não seletivo (PCR-NS) para a detecção e identificação de Salmonella sp. em amostras de origem avícola. A PCR-RV detectou significativamente mais amostras positivas para Salmonella do que a PCR-NS. A técnica microbiológica convencional também foi comparada às outras duas, mostrando ser mais sensível do que a PCR-NS, porém menos sensível do que a PCRRV. Em relação à identificação dos sorovares Typhimurium, Enteritidis, Gallinarum e Pullorum, a PCR-RV apresentou resultados similares à técnica convencional e ambas foram mais sensíveis do que PCR-NS. Na segunda etapa, foram caracterizadas 111 culturas de S. Enteritidis isoladas de humanos, alimentos, carcaças de frango, aves e suínos através de rep-PCR, presença de genes de virulência, resistência a antimicrobianos e da combinação destes com a fagotipagem. No teste de resistência a antimicrobianos, foi observada uma alta prevalência de resistência aos antimicrobianos testados. Os isolados de produ