Utilização do cultivo in vitro de folículos pré-antrais suínos inclusos em tecido ovariano (in situ) como modelo de avaliação da eficiência de medicamentos homeopáticos na foliculogênese inicial / In situ cultured preantral follicles is a useful model to evaluate the effect of homeopathy medicine on early folliculogenesis

Este trabalho teve por objetivo avaliar o efeito dos medicamentos homeopáticos (Pulsatilla nigricans e hormônio folículo estimulante homeopático - FSH) e um complexo homeopático (Bos Stress Fertilis) na foliculogênese inicial, utilizando o cultivo in vitro de folículos pré-antrais suínos como modelo in vitro. Para tanto, fragmentos ovarianos foram cultivados por um ou sete dias em α-MEM+ na ausência (controle cultivado) ou presença de FSH homeopático (6 cH), Pulsatilla (6 CH), Bos Stress Fertilis (6 CH), álcool cereal (50% - v/v) ou FSH recombinante (50 ng/ml) adicionados diariamente. Os fragmentos ovarianos não cultivados (controle fresco) ou cultivados por um e sete dias foram processados para histologia clássica. Somente o composto homeopático Bos Stress Fertilis foi eficiente em manter o percentual de sobrevivência folicular após sete dias de cultivo semelhante ao controle não cultivado e α-MEM+. Em relação ao crescimento folicular, somente a adição de FSH homeopático aumentou o diâmetro folicular quando comparado ao controle não cultivado e α-MEM+ após um dia de cultivo. Dessa forma, pode-se concluir que a adição dos medicamentos homeopáticos Bos Stress fertilis e FSH homeopático (6 CH) melhoraram, respectivamente, a sobrevivência e o crescimento in vitro de folículos pré-antrais suínos inclusos em fragmentos de tecido ovariano.

This study investigated the effect of homeopathic medicine (Pulsatilla nigricans and homeopathic follicle stimulating hormone - FSH) and the complex (Bos Stress Fertilis) on the initial folliculogenesis, using the in vitro culture of preantral follicles as in vitro model. For this, swine ovarian fragments were cultured for one or seven days in α-MEM+ in the absence (cultured control) or presence of homeopathic FSH (6 cH), Pulsatilla (6 CH), Bos Stress Fertilis (6 CH), grain alcohol (50% v / v) or recombinant FSH (50 ng / ml) added daily. Uncultured ovarian fragments (fresh control) or cultured for one and seven days were processed for classical histology. Only the homeopathic complex Bos Stress Fertilis maintained the percentage of follicular survival after seven days of culture in relation to the uncultured control and α-MEM+. Regarding follicular growth, only the addition of homeopathic FSH increased the follicular diameter when compared to the uncultured control and a-MEM+. Thus, it can be concluded that the addition of the homeopathic remedies Bos Stress fertilis and homeopathic FSH (6 CH) improved, respectively, survival and in vitro growth of swine preantral follicles included in ovarian tissue.

Utilização do cultivo in vitro de folículos pré-antrais suínos inclusos em tecido ovariano (in situ) como modelo de avaliação da eficiência de medicamentos homeopáticos na foliculogênese inicial / In situ cultured preantral follicles is a useful model to evaluate the effect of homeopathy medicine on early folliculogenesis

Este trabalho teve por objetivo avaliar o efeito dos medicamentos homeopáticos (Pulsatilla nigricans e hormônio folículo estimulante homeopático - FSH) e um complexo homeopático (Bos Stress Fertilis) na foliculogênese inicial, utilizando o cultivo in vitro de folículos pré-antrais suínos como modelo in vitro. Para tanto, fragmentos ovarianos foram cultivados por um ou sete dias em α-MEM+ na ausência (controle cultivado) ou presença de FSH homeopático (6 cH), Pulsatilla (6 CH), Bos Stress Fertilis (6 CH), álcool cereal (50% - v/v) ou FSH recombinante (50 ng/ml) adicionados diariamente. Os fragmentos ovarianos não cultivados (controle fresco) ou cultivados por um e sete dias foram processados para histologia clássica. Somente o composto homeopático Bos Stress Fertilis foi eficiente em manter o percentual de sobrevivência folicular após sete dias de cultivo semelhante ao controle não cultivado e α-MEM+. Em relação ao crescimento folicular, somente a adição de FSH homeopático aumentou o diâmetro folicular quando comparado ao controle não cultivado e α-MEM+ após um dia de cultivo. Dessa forma, pode-se concluir que a adição dos medicamentos homeopáticos Bos Stress fertilis e FSH homeopático (6 CH) melhoraram, respectivamente, a sobrevivência e o crescimento in vitro de folículos pré-antrais suínos inclusos em fragmentos de tecido ovariano.(AU)

This study investigated the effect of homeopathic medicine (Pulsatilla nigricans and homeopathic follicle stimulating hormone - FSH) and the complex (Bos Stress Fertilis) on the initial folliculogenesis, using the in vitro culture of preantral follicles as in vitro model. For this, swine ovarian fragments were cultured for one or seven days in α-MEM+ in the absence (cultured control) or presence of homeopathic FSH (6 cH), Pulsatilla (6 CH), Bos Stress Fertilis (6 CH), grain alcohol (50% v / v) or recombinant FSH (50 ng / ml) added daily. Uncultured ovarian fragments (fresh control) or cultured for one and seven days were processed for classical histology. Only the homeopathic complex Bos Stress Fertilis maintained the percentage of follicular survival after seven days of culture in relation to the uncultured control and α-MEM+. Regarding follicular growth, only the addition of homeopathic FSH increased the follicular diameter when compared to the uncultured control and a-MEM+. Thus, it can be concluded that the addition of the homeopathic remedies Bos Stress fertilis and homeopathic FSH (6 CH) improved, respectively, survival and in vitro growth of swine preantral follicles included in ovarian tissue.(AU)

XENOTRANSPLANTE DE FRAGMENTOS DE CÓRTEX OVARIANO BOVINO TRATADOS COM RESVERATROL

O processo de restabelecimento da circulação sanguínea após o transplante, tem influência na sobrevivência do tecido e no desenvolvimento folicular. O resveratrol tem sido utilizado em inúmeros estudos, por apresentar efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios. No entanto, não existe informação sobre possíveis ações benéficas do resveratrol nos tecidos ovarianos que serão destinados ao transplante. Objetivou-se, no primeiro experimento, realizar a vitrificação de tecido ovariano com e sem resveratrol, e após o cultivo in vitro e xenotransplante de tecido ovariano de fêmeas bovinas, avaliar a morfologia e a capacidade de desenvolvimento dos folículos pré- antrais, e ainda, o estresse oxidativo, os níveis de degeneração celular e a apoptose no tecido, e no segundo experimento, realizar a incubação do tecido ovariano por 24 horas em meio de cultivo acrescido ou não com resveratrol, seguido do cultivo in vivo (xenotransplante) e avaliar a morfologia e a capacidade de desenvolvimento dos folículos préantrais. Observou-se que no primeiro experimento, os tecidos que foram vitrificados com resveratrol, apresentaram menores taxas de degeneração celular (p<0,05) quando comparado aos tecidos vitrificados sem resveratrol. O xenotransplante fresco por 7 dias, apresentou viabilidade folicular semelhante ao controle cultivado in vitro por 7 dias. A vitrificação com resveratrol seguida do xenotransplante apresentou maior taxa de degeneração celular e apoptose, do que os tecidos vitrificados sem resveratrol e xenotransplantados. No segundo experimento, o grupo de tecidos ovarianos incubados com resveratrol e xenotransplantados por 14 e 28 dias apresentou menor (P < 0,05) viabilidade e ativação folicular que os tecidos incubados sem adição do antioxidante resveratrol. O grupo xenotransplante fresco e o grupo xenotransplantes incubado sem resveratrol por 14 e 28 dias, apresentaram viabilidade folicular semelhante (P > 0,05) ao grupo controle fresco. Frente aos resultados obtidos, podemos concluir que o uso de resveratrol em soluções de vitrificação reduz a viabilidade folicular de tecidos ovarianos de fêmeas bovinas após xenotransplante por 7 dias. A utilização do cultivo in vivo (xenotransplante) sem resveratrol, demonstrou bons resultados na manutenção da viabilidade de folículos pré-antrais inclusos em tecido ovariano bovino, levando a manutenção folicular pelo período de 28 dias de transplante.

The process of reestablishing blood circulation after transplantation has an influence on tissue survival and follicular development. Resveratrol has been used in numerous studies, presenting antioxidant and anti-inflammatory effects. However, the possible beneficial actions of resveratrol in the ovarian tissues that will be aimed for transplantation is still not established. The aim of the first study was to vitrify ovarian tissue with resveratrol, and to evaluate the morphology and the developmental capacity of the preantral follicles after in vitro and in vivo cultivation (xenotransplantation) of ovarian tissue of bovine females. We also evaluate oxidative stress, levels of cell degeneration, and apoptosis in the tissue. In the second study we evaluate the morphology and the developmental capacity of the preantral follicles in the ovarian tissue that was incubate for 24 hours in cultivation medium with addition of resveratrol and after in vivo cultivation (xenotransplantation). The tissues that were vitrified with resveratrol, presented lower rates of cell degeneration (p <0.05) when compared to the vitrified tissues without resveratrol. Fresh xenotransplantation for 7 days presented follicular viability similar to the cultured control in vitro for 7 days. Resveratrol vitrification followed by xenotransplantation presented a higher rate of cell degeneration and apoptosis than vitrified tissues without resveratrol and xenotransplantation. The group of ovarian tissues incubated with resveratrol and xenotransplantation for 14 and 28 days presented less viability (P <0.05) and follicular activation than the tissues incubated without the addition of the antioxidant resveratrol. The fresh xenotransplantation and xenotransplantation groups incubated without resveratrol for 14 and 28 days presented similar follicular viability (P> 0.05) to the fresh control group. The use of resveratrol in vitrification solutions reduces the follicular viability of ovarian tissues of bovine females after xenotransplantation for 7 days. The use of in vivo cultivation (xenotransplantation) without resveratrol, demonstrated good results in maintaining the viability of pre-antral follicles included in bovine ovarian tissue, leading to follicular maintenance for the period of 28 days of transplantation.

Participação da esfingosina 1-fosfato e do fator inibidor da leucemia no cultivo in vitro de folículos ovarianos pré-antrais de cabras / The role of Sphingosine 1-phosphate and Leukemia Inhibitory Factor in the culture of goats preantral follicles in vitro

A manipulação de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais (MOIFOPA) possibilita oaumento do potencial reprodutivo das fêmeas a partir do isolamento e cultivo de folículos pré-antrais (FOPA).Fisiologicamente, vários fatores de crescimento estão envolvidos durante o processo da foliculogênese, muitosdos quais até o momento não foram testados em cabras. Esta revisão tem como objetivo correlacionar aparticipação da S1P e do LIF no cultivo dos FOPA e, assim, possibilitar uma melhor compreensão dosmecanismos relacionados com a foliculogênese.(AU)

The manipulation of oocytes included in preantral Follicles increasing the reproductive potential of thefemales from the isolation and culture of preantral follicles was studied. Physiologically various growth factorsare involved in the folliculogenesis process, many of which have not been tested in goats so far. This review aimsto correlate the involvement of S1P and LIF in the culture of preantral follicle enabling a better understandingof the mechanisms related to folliculogenesis.(AU)

Transforming growth factor-β (TGF-β) maintains follicular ultrastructure and stimulates preantral follicle growth in caprine ovarian tissue cultured in vitro / Fator de crescimento transformante-β (TGF-β) mantém a ultraestrutura folicular e estimula o crescimento de folículos pré-antrais caprinos inclusos em tecido ovariano cultivado in vitro

The objectives of this study were to investigate whether TGF-β affect the survival, activation and further growth of goat primordial follicles enclosed in ovarian cortex after in vitro culture. Goat ovaries were collected from an abattoir and pieces of ovarian tissues were cultured for one or seven days in a supplemented alpha Minimum Essential Medium, alone or containing TGF-β (1, 5, 10 or 50ng/mL). Ovarian tissues from the fresh control as well as those cultured were processed for histological and ultrastructural studies. The results showed that when compared with fresh control, there was decrease in the percentages of histologically normal follicles in all treatments only after seven days culture. TGF-β did not affect the activation of preantral follicles regardless of its concentration, however, larger follicles diameter (P<0.05) was observed using 10ng/mL TGF-β than in the fresh control and other treatments. Moreover, this concentration maintained the normal ultrastructure after seven days of culture. In conclusion, TGF-β showed additional effect on the follicle growth and the maintenance of ultrastructural integrity of goat preantral follicles enclosed in ovarian tissue when used at 10ng/mL during seven days of culture.(AU)

O objetivo desse estudo foi investigar se o TGF-β afeta a sobrevivência, ativação e crescimento de folículos primordiais caprinos inclusos no córtex ovariano após o cultivo in vitro. Ovários de cabras foram coletados em abatedouro e fragmentos de tecido ovariano foram cultivados por um e sete dias em meio essencial mínimo alfa (α-MEM+) sozinho ou suplementado com TGF-β (1, 5, 10 ou 50ng/mL). Fragmentos ovarianos não cultivados e cultivados foram processados para análise histológica e ultraestrutural. Os resultados mostraram que, comparado ao controle fresco, houve diminuição no percentual de folículos morfologicamente normais em todos os tratamentos somente após sete dias de cultivo. O TGF-β não afetou a ativação folicular independente da concentração testada, contudo, o diâmetro folicular foi superior (P<0.05) no tratamento com 10ng/mL de TGF-β quando comparado ao controle fresco e aos demais tratamentos. Além disso, essa mesma concentração manteve a ultraestrutura normal dos folículos após sete dias de cultivo. Em conclusão, o TGF-β apresentou efeito adicional no crescimento folicular e na manutenção da integridade ultraestrutural de folículos pré-antrais caprinos inclusos no tecido ovariano quando utilizado na concentração de 10ng/mL durante sete dias de cultivo.(AU)

Avanços na criopreservação de tecido ovariano de cabras e ovelhas / Advances in ovarian tissue cryopreservation in goats and sheep

A criopreservação de tecido ovariano, sem dúvidas, tem se tornado, uma prática não apenas suplementar as técnicas de reprodução assistida, mas também fundamental para a preservação da fertilidade da fêmea. Isso tem sido observado, especialmente na espécie humana, cuja espécie em uma década de trabalho, já se soma aproximadamente trinta nascimentos de bebês saudáveis oriundos de ovário criopreservado. No entanto, todo o avanço que hoje é estabelecido, muito se deve aos trabalhos pioneiros realizados em animais de animais de produção como os ovinos. Relatos de sucesso após criopreservação e transplante de tecido ovariano no início dos anos 90 impulsionaram importantes equipes a investir esforços e dedicação nessa área, voltados para a reprodução humana, e embora, o sucesso seja evidente, os avanços da criopreservação de tecido ovariano tanto na espécie ovina, como na espécie caprina são ainda bastante limitados. Portanto, o objetivo desse trabalho, é apresentar uma retrospectiva dos principais resultados obtidos com a criopreservação de tecido ovariano nessas duas espécies.(AU)

Cryopreservation of ovarian tissue, no doubt, has been considerated not only as an additional practice to assisted reproductive techniques, but it is fundamental for female fertility preservation. This have been related particularly in humans, whose specie in a decade, it was reported approximately thirty healthy babies born after procedures of cryopreservation and tranplant of ovarian tissue. However, the currently successful is due to hard efforts done in animals farm such as sheep. Reports of success after cryopreservation and transplantation of ovarian tissue in the early 90 stimulated several researchers to invest efforts and dedication in that research field, regarding human reproduction, and although success is evident, advances in cryopreservation of ovarian tissue in sheep and goats are still quite limited. Therefore, the aim of this work is to present a retrospective of the main results obtained with the cryopreservation of ovarian tissue in these two species.(AU)

Conservação de folículos pré-antrais de felinos domésticos (Felis catus) refrigerados por 24 h em TCM 199 e PBS / Preservation of preantral follicles of domestic cats (Felis catus) cooled for 24 h in TCM 199 and PBS

Objetivou-se investigar a eficiência dos meios TCM 199 e PBS na conservação de folículos pré-antrais(FOPA) felinos in situ a 4ºC por 24 h. Foram utilizados 10 pares de ovários de gatas Felis catus, sendo a camadacortical fracionada e submetida a três diferentes tratamentos: controle, T1 (fragmentos conservados em TCM199) e T2 (fragmentos conservados em PBS). Realizou-se a preparação histológica do grupo controle, sendo T1e T2 mantidos a 4ºC, por 24 h, em caixa isotérmica. Ao final dos tratamentos, os FOPA foram classificados emprimordiais, primários e secundários, e os oócitos classificados em normais ou degenerados morfologicamente. Aavaliação histológica constatou que os FOPA do controle (63%) tiveram maior integridade morfológica (P > 0,05)quando comparados ao T2 (55%), sendo semelhantes ao T1 (59%). Não houve diferença (P < 0,05) entreT1(59%) e T2 (55%). Os folículos primordiais mantiveram maior integridade morfológica quando comparadosaos folículos em desenvolvimento, independentemente do tratamento. Com base nesses resultados, pode-seconcluir que é possível a manutenção da integridade morfológica de FOPA em ovários de gatas mantidos a 4ºCpor 24 h, utilizando o TCM 199 e que os folículos primordiais têm maior viabilidade, quando comparados aosfolículos em desenvolvimento.(AU)

The aim of this study was to investigate the efficiency of TCM 199 and PBS mediums in the conservationof feline preantral follicles (PAF) in situ at 4°C for 24 h. Ten pairs of ovaries of Felis catus cats were used, inwhich the cortical layer was fractioned and submitted to three different treatments: Control, T1 (fragmentspreserved in TCM 199) and T2 (fragments preserved in PBS). Histological preparation was carried out in thecontrol group, while T1 and T2 were kept at 4°C for 24 h in an isothermal box. After histological preparation ofControl, T1 and T2 the PAF were classified as primordial, primary and secondary and the morphology of theoocyte as normal and degenerated. Histological evaluation found that the PAF control group (63%) had a highermorphological integrity (P > 0.05) compared to T2 (55%), which was similar to T1 (59%). However, there wasno difference (P < 0.05) between T1 (59%) and T2 (55%) treatments. Primordial follicles maintained greatermorphological integrity when compared to developing follicles, regardless of the treatment. Based on theseresults, it can be concluded that it is possible to maintain the morphological integrity of PAF in ovaries of catstransported at 4°C for 24 h using TCM 199 and that primordial follicles have a higher viability compared todeveloping follicles.(AU)

Avanços na criopreservação de tecido ovariano de cabras e ovelhas / Advances in ovarian tissue cryopreservation in goats and sheep

A criopreservação de tecido ovariano, sem dúvidas, tem se tornado, uma prática não apenas suplementar as técnicas de reprodução assistida, mas também fundamental para a preservação da fertilidade da fêmea. Isso tem sido observado, especialmente na espécie humana, cuja espécie em uma década de trabalho, já se soma aproximadamente trinta nascimentos de bebês saudáveis oriundos de ovário criopreservado. No entanto, todo o avanço que hoje é estabelecido, muito se deve aos trabalhos pioneiros realizados em animais de animais de produção como os ovinos. Relatos de sucesso após criopreservação e transplante de tecido ovariano no início dos anos 90 impulsionaram importantes equipes a investir esforços e dedicação nessa área, voltados para a reprodução humana, e embora, o sucesso seja evidente, os avanços da criopreservação de tecido ovariano tanto na espécie ovina, como na espécie caprina são ainda bastante limitados. Portanto, o objetivo desse trabalho, é apresentar uma retrospectiva dos principais resultados obtidos com a criopreservação de tecido ovariano nessas duas espécies.

Cryopreservation of ovarian tissue, no doubt, has been considerated not only as an additional practice to assisted reproductive techniques, but it is fundamental for female fertility preservation. This have been related particularly in humans, whose specie in a decade, it was reported approximately thirty healthy babies born after procedures of cryopreservation and tranplant of ovarian tissue. However, the currently successful is due to hardefforts done in animals farm such as sheep. Reports of success after cryopreservation and transplantation of ovarian tissue in the early 90 stimulated several researchers to invest efforts and dedication in that research field, regarding human reproduction, and although success is evident, advances in cryopreservation of ovarian tissue in sheep and goats are still quite limited. Therefore, the aim of this work is to present a retrospective of the main results obtained with the cryopreservation of ovarian tissue in these two species.

Participação da esfingosina 1-fosfato e do fator inibidor da leucemia no cultivo in vitro de folículos ovarianos pré-antrais de cabras / The role of Sphingosine 1-phosphate and Leukemia Inhibitory Factor in the culture of goats preantral follicles in vitro

A manipulação de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais (MOIFOPA) possibilita oaumento do potencial reprodutivo das fêmeas a partir do isolamento e cultivo de folículos pré-antrais (FOPA).Fisiologicamente, vários fatores de crescimento estão envolvidos durante o processo da foliculogênese, muitosdos quais até o momento não foram testados em cabras. Esta revisão tem como objetivo correlacionar aparticipação da S1P e do LIF no cultivo dos FOPA e, assim, possibilitar uma melhor compreensão dosmecanismos relacionados com a foliculogênese.

The manipulation of oocytes included in preantral Follicles increasing the reproductive potential of thefemales from the isolation and culture of preantral follicles was studied. Physiologically various growth factorsare involved in the folliculogenesis process, many of which have not been tested in goats so far. This review aimsto correlate the involvement of S1P and LIF in the culture of preantral follicle enabling a better understandingof the mechanisms related to folliculogenesis.

Conservação de folículos pré-antrais de felinos domésticos (Felis catus) refrigerados por 24 h em TCM 199 e PBS / Preservation of preantral follicles of domestic cats (Felis catus) cooled for 24 h in TCM 199 and PBS

Objetivou-se investigar a eficiência dos meios TCM 199 e PBS na conservação de folículos pré-antrais(FOPA) felinos in situ a 4ºC por 24 h. Foram utilizados 10 pares de ovários de gatas Felis catus, sendo a camadacortical fracionada e submetida a três diferentes tratamentos: controle, T1 (fragmentos conservados em TCM199) e T2 (fragmentos conservados em PBS). Realizou-se a preparação histológica do grupo controle, sendo T1e T2 mantidos a 4ºC, por 24 h, em caixa isotérmica. Ao final dos tratamentos, os FOPA foram classificados emprimordiais, primários e secundários, e os oócitos classificados em normais ou degenerados morfologicamente. Aavaliação histológica constatou que os FOPA do controle (63%) tiveram maior integridade morfológica (P > 0,05)quando comparados ao T2 (55%), sendo semelhantes ao T1 (59%). Não houve diferença (P < 0,05) entreT1(59%) e T2 (55%). Os folículos primordiais mantiveram maior integridade morfológica quando comparadosaos folículos em desenvolvimento, independentemente do tratamento. Com base nesses resultados, pode-seconcluir que é possível a manutenção da integridade morfológica de FOPA em ovários de gatas mantidos a 4ºCpor 24 h, utilizando o TCM 199 e que os folículos primordiais têm maior viabilidade, quando comparados aosfolículos em desenvolvimento.

The aim of this study was to investigate the efficiency of TCM 199 and PBS mediums in the conservationof feline preantral follicles (PAF) in situ at 4°C for 24 h. Ten pairs of ovaries of Felis catus cats were used, inwhich the cortical layer was fractioned and submitted to three different treatments: Control, T1 (fragmentspreserved in TCM 199) and T2 (fragments preserved in PBS). Histological preparation was carried out in thecontrol group, while T1 and T2 were kept at 4°C for 24 h in an isothermal box. After histological preparation ofControl, T1 and T2 the PAF were classified as primordial, primary and secondary and the morphology of theoocyte as normal and degenerated. Histological evaluation found that the PAF control group (63%) had a highermorphological integrity (P > 0.05) compared to T2 (55%), which was similar to T1 (59%). However, there wasno difference (P < 0.05) between T1 (59%) and T2 (55%) treatments. Primordial follicles maintained greatermorphological integrity when compared to developing follicles, regardless of the treatment. Based on theseresults, it can be concluded that it is possible to maintain the morphological integrity of PAF in ovaries of catstransported at 4°C for 24 h using TCM 199 and that primordial follicles have a higher viability compared todeveloping follicles.

EXPRESSÃO DIFERENCIAL DO RECEPTOR DE LH, DA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE MRNA DO LHR, BTA-MIR-222 E ENZIMAS ESTEROIDOGÊNICAS NO OVÁRIO BOVINO EM DESENVOLVIMENTO

EXPRESSÃO DIFERENCIAL DO RECEPTOR DE LH, DA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE MRNA DO LHR, BTA-MIR-222 E ENZIMAS ESTEROIDOGÊNICAS NO OVÁRIO BOVINO EM DESENVOLVIMENTO Esteroides e gonadotrofinas são essenciais para a regulação do desenvolvimento folicular antral e os estágios finais do desenvolvimento pré-antral. Embora o receptor do hormônio luteinizante (LHR) tenha sido detectado nos folículos pré-antrais de ratos, coelhos e porcos, a expressão deste receptor no ovário fetal bovino não foi demonstrada. O presente estudo teve como objetivo quantificar a expressão do LHR e a abundância de mRNA da proteína de ligação LHR (LRBP), STAR, HSD3B1, CYP17A1 e CYP19A1 durante o desenvolvimento do ovário fetal bovino. Além disso, objetivamos identificar e quantificar a expressão de bta-miR-222 (microRNA regulador do gene LHCGR). Em resumo, a expressão de LHR foi observada no folículo pré-antral no ovário fetal de bovino e a abundância de mRNA foi menor no dia 150 do que no dia 60. No entanto, a abundância de mRNA da LRBP seguiu o padrão oposto. Semelhante a LRBP, a abundância de bta-miR-222 foi maior no dia 150 do que no dia 60 ou 90. Com relação à expressão gênica de enzimas esteroidogênicas; apenas a abundância de mRNA de STAR foi maior no dia 150 do que no dia 60. A proteína LHR foi detectada em oogônia, folículos primordiais, primários e secundários. Além disso, ambos os oócitos e células da granulosa apresentaram imunolocalização positiva para LHR. Em conclusão, estes resultados sugeriram o envolvimento da regulação do LHCGR / LBPB com mecanismos relacionados ao desenvolvimento de folículos pré-antrais, especialmente durante o estabelecimento de folículos secundários. Além disso, os presentes dados reforçaram que a expressão reduzida de mRNA de LHR em ovários fetais bovinos no dia 150 estava relacionada à maior expressão de LRBP e bta-miR-222.

Steroids and gonadotrophins are essential for the regulation of antral follicular development and the late stages of preantral development. Although the luteinizing hormone receptor (LHR) has been detected in the preantral follicles of rats, rabbits, and pigs, the expression of this receptor in bovine fetal ovary has not been demonstrated. The present study aimed to quantify the expression of the LHR and the mRNA abundance of the genes LHR binding protein (LRBP), STAR, HSD3B1, CYP17A1, and CYP19A1 during the development of bovine fetal ovary. In addition, we aimed to identify and quantify the expression of bta-miR-222 (a regulatory microRNA of the LHCGR gene). In summary, LHR expression was observed in the preantral follicle in bovine fetal ovary, from oogonias to primordial, primary and secondary stages, and the mRNA abundance was lower on day 150 than day 60. However, the mRNA abundance of LRBP followed the opposite pattern. The LHR protein was detected in oogonia, primordial, primary, and secondary follicles. Moreover, both oocytes and granulosa cells showed positive immunostaining for LHR. Similar to LRBP, the abundance of bta-miR-222 was higher on day 150 than day 60 or 90 of gestation. With regard to the gene expression of steroidogenic enzymes; only the mRNA abundance of STAR was higher on day 150 than on day 60. In conclusion, these results suggested the involvement of LHCGR/LRBP regulation with mechanisms related to the development of preantral follicles, especially during the establishment of secondary follicles. Furthermore, the present data reinforced that the reduced expression of LHR mRNA in bovine fetal ovaries on day 150 was related to the higher expression of LRBP and bta-miR-222.

Progesterone and Follicle Stimulating Hormone interact and promote goat preantral follicles survival and development in vitro / Progesterona e Hormônio Folículo-Estimulante interagem e promovem a sobrevivência e o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais caprinos

We investigated the effects of progesterone and follicle stimulating hormone (FSH) on survival and growth of caprine preantral follicles. Pieces of ovarian tissue were cultured for 1 or 7 days in minimum essential medium (MEM) alone or containing progesterone (1, 2.5, 5, 10 or 20ng/mL), FSH (50ng/mL) or the interaction between progesterone and FSH. Fresh (non-cultured control) and cultured ovarian tissues were processed for histological and ultrastructural studies. After 7 days the addition of FSH to all progesterone concentrations maintained the percentage of normal follicles similar to fresh control. At day 7 of culture, a higher percentage of developing follicles was observed only in 2.5ng/ml of progesterone associated with FSH or 10ng/ml of progesterone alone when compared with control. From day 1 to day 7 of culture, a significant increase in the percentage of developing follicles was observed in MEM and 2.5ng/ml of progesterone + FSH. In addition, after 7 days, in all treatments, there was a significant increase in follicular diameter when compared with control, except for MEM alone and in 5ng/ml of progesterone + FSH or 10ng/ml of progesterone alone. Ultrastructural studies confirmed follicular integrity after 7 days of culture in 2.5ng/ml of progesterone with FSH. In conclusion, this study demonstrated that the interaction between progesterone and FSH maintains ultrastructural integrity, stimulates primordial follicles activation and further growth of cultured caprine preantral follicles.(AU)

Este trabalho verificou os efeitos da progesterona e do hormônio folículo-estimulante (FSH) na sobrevivência e no crescimento de folículos pré-antrais caprinos. Fragmentos de tecido ovariano foram cultivados por 1 ou 7 dias em Meio Essencial Mínimo (MEM) sozinho ou contendo progesterona (1, 2.5, 5, 10 ou 20ng/mL), FSH (50ng/mL) ou a combinação entre esses dois hormônios. O tecido fresco (controle não-cultivado) e o cultivado foram processados para análise histológica e ultra-estrutural. Após 7 dias a adição de FSH a todas as concentrações de progesterone manteve o percentual de folículos normais similar ao controle fresco. No dia 7 de cultivo, um alto percentual de folículos em desenvolvimento foi observado somente no tratamento com 2,5ng/ml de progesterona associada ao FSH ou com 10ng/ml de progesterona sozinha, em relação ao controle fresco. Do dia 1 para o dia 7 de cultivo, um aumento significativo no percentual de folículos em desenvolvimento foi observado no MEM sozinho e adicionado de 2,5ng/ml de progesterona + FSH. Além disso, após 7 dias, em todos os tratamentos, houve um aumento significativo no diâmetro folicular em relação ao controle, exceto nos tratamentos com MEM sozinho, 5ng/ml de progesterona + FSH ou 10ng/ml de progesterona sozinha. A análise ultra-estrutural confirmou a integridade follicular após 7 dias de cultivo no tratamento com 2,5ng/ml de progesterona + FSH. Em conclusão, este estudo demonstrou que a interação entre progesterona e FSH mantém a integridade ultra-estrutural, estimula a ativação de folículos primordiais e o posterior crescimento de folículos pré-antrais caprinos cultivados in vitro.(AU)

VITRIFICAÇÃO DE TECIDO OVARIANO DE FETOS BOVINOS ASSOCIADA AO RESVERATROL

Objetivou-se com este estudo analisar a morfologia e a viabilidade tecidual de folículos ovarianos pré-antrais de fetos bovinos por meio de análise histológica, sondas fluorescentes em microscopia confocal, antes e após os procedimentos de vitrificação/ aquecimento com ou sem o antioxidante resveratrol. Foram fragmentados 18 ovários e os fragmentos distribuídos aos grupos controle (C), vitrificado sem resveratrol (SR) e vitrificado com resveratrol (CR) na concentração de 20 µM. No experimento 1 foi realizada análise morfológica dos folículos pré-antrais inclusos em fragmentos de tecidos ovarianos por histologia clássica. Os folículos pré-antrais foram quantificados e classificados de acordo com a fase de desenvolvimento. O percentual médio de folículos normais foi maior (P < 0,05) no grupo de folículos vitrificados com resveratrol em relação aos vitrificados sem a adição do antioxidante. No grupo de folículos vitrificados com resveratrol a classe de folículos primordiais apresentou maior percentual (P < 0,05) de folículos normais. Em contrapartida a classe de folículos secundários apresentou o menor percentual (P < 0,05) de folículos normais em todos os tratamentos. Adicionalmente, foi observada uma associação negativa entre a proporção de folículos viáveis e o estágio de desenvolvimento folicular. A probabilidade de se encontrar folículos viáveis foi superior (P < 0,05) no grupo de folículos vitrificados na presença do resveratrol e os folículos primordiais do grupo com resveratrol apresentaram 2,5 vezes mais chance de viabilidade após a vitrificação. A chance de se observar folículos normais foi maior (P < 0,05) nas fases iniciais de desenvolvimento folicular. O diâmetro dos folículos de transição e de seus respectivos ovócitos foi menor quando submetidos ao processo de vitrificação com resveratrol (P < 0,05). Na classe de folículos primários, os diâmetros foliculares e ovocitários foram semelhantes (P > 0,05) entre os grupos estudados. No experimento 2 foi realizada a análise de viabilidade tecidual por meio da técnica de microscopia confocal que avaliou os níveis de emissão de espécies reativas de oxigênio (EROs- DCF) e de viabilidade tecidual (iodeto de propídeo- IP). Os níveis de degeneração tecidual no grupo de fragmentos vitrificados com resveratrol foram semelhantes (P > 0,05) aos do grupo controle. Os níveis de EROs foram semelhantes entre os grupos vitrificados e vitrificados com resveratrol e inferior em relação ao grupo controle. A intensidade de fluorescência emitida com a utilização de ambas probes diminuiu (P < 0,05) com o aumento da profundidade tecidual analisada. Além disso, a análise de regressão linear apresentou correlação negativa entre intensidade de fluorescência e a profundidade tecidual. Observou-se uma associação positiva (P < 0,01) entre os níveis de células degeneradas e as taxas de EROs produzidas nos tratamentos em diferentes profundidades do tecido ovariano, independentemente do tratamento e da profundidade tecidual os grupos apresentaram similaridade para os baixos EROs. A proporção de fragmentos com alto nível de EROs foi superior no grupo controle comparado aos grupos vitrificados. Em conclusão, o resveratrol favoreceu a preservação de folículos ovarianos pré-antrais em fases iniciais de desenvolvimento quando submetidas ao processo de vitrificação/ aquecimento, além de proporcionar redução na produção de EROs e maior viabilidade celular.

The aim of this study was to analyze the morphology and tissue viability of preantral follicles of bovine fetuses by means of histological analysis, fluorescence probes diacetate diclodihydrofluocein and propidium iodide in confocal microscopy, before and after vitrification / warning procedures without or with antioxidant resveratrol. The ovaries (n=18) were fragmented and the fragments distributed to the control (C) groups, vitrified without resveratrol (SR) and vitrified with resveratrol (CR) at the concentration of 20 M. The experiment 1, morphological analysis of the preantral follicles included in fragments of ovarian tissues by classical histology was performed. The preantral follicles were quantified and classified according to the developmental stage. The mean percentage of normal follicles was higher (P <0.05) in the group of follicles vitrified with resveratrol than in the vitrified without the addition of the antioxidant. In the group of follicles vitrified with resveratrol the class of primordial follicles had a higher percentage (P <0.05) of normal follicles. In contrast, the secondary follicle class had the lowest percentage (P <0.05) of normal follicles in all treatments. In addition, a negative association was observed between the proportion of viable follicles and the stage of follicular development. The probability of finding viable follicles was higher (P <0.05) in the group of vitrified follicles in the presence of resveratrol and follicles of the group with resveratrol presented 2.5 times more chance of viability after vitrification. The chance of observing normal follicles was higher (P <0.05) in the early stages of follicular development. The diameter of the transitional follicles and their respective oocytes was lower when submitted to the vitrification process with resveratrol (P <0.05). In the primary follicle class, the follicular and oocyte diameters were similar (P> 0.05) between the studied groups. The experiment 2, the tissue viability analysis was performed using a confocal microscopy technique that evaluated the fluorescence levels emitted by DCF and IP. The fluorescence levels emitted by PI in the group of fragments vitrified with resveratrol were similar (P> 0.05) to the control group. The levels of EROs were similar between the vitrified and vitrified groups with resveratrol and lower in relation to the control group. The intensity of fluorescence emitted with the use of both probes decreased (P <0.05) with the increased tissue depth analyzed. In addition, linear regression analysis showed a negative correlation between fluorescence intensity and tissue depth. A positive association (P <0.01) was observed between the degenerate cell levels and the ROS rates produced in the treatments with different depths of ovarian tissue, regardless of treatment and tissue depth, groups showed similarity to low ROS.. The proportion of fragments with high level of EROs was higher in the control group compared to the vitrified groups. In conclusion, resveratrol favored the preservation of preantral follicles in the early stages of development when submitted to the vitrification / warning process, as well as to reduce the production of ROS and greater cell viability

Associação das técnicas de criopreservação e cultivo in vitro de folículos pré-antrais para a obtenção de embriões caprinos / Cryopreservation and in vitro culture of ovarian preantral follicles to obtaining goat embryos

A criopreservação tem sido de extrema importância para a preservação de material genético de machos e fêmeas para a utilização posterior em programas de reprodução assistida. Por essa razão, o emprego da criopreservação de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais tem se mostrado como uma ferramenta complementar para as biotecnologias da reprodução que visam maximizar o potencial reprodutivo de animais de grande valor genético mesmo após a morte ou descarte programado. A aplicação da criopreservação de folículos pré-antrais, isolados ou inclusos no tecido ovariano, permitirá a implantação de bancos de germoplasma animal/humano, com o intuito de preservar o patrimônio genético e, consequentemente, a preservação e manutenção da fertilidade de fêmeas. Vários estudos em diferentes espécies, notadamente em humanos, têm demonstrado a retomada da função reprodutiva relatando inclusive o nascimento de crias saudáveis após transplante de tecido ovariano previamente criopreservado. No entanto, em pequenos ruminantes, especialmente em caprinos, os avanços ainda são pouco significativos. Portanto, conclui-se que mais estudos são requeridos com o objetivo de definir um protocolo (congelação lenta ou vitrificação) que garanta a viabilidade e função ovariana e folicular, normais após a descongelação/aquecimento.(AU)

Cryopreservation has been extremely important for the preservation of male and female genetic material for later use in assisted reproduction procedures. Thus, the use of cryopreservation of oocytes enclosed in preantral follicles has been shown as a complementary tool for the reproduction biotechnologies aimed at maximizing the reproductive potential of animals of great genetic value even after death, unexpected or not, as well as after planed elimination. The application of isolated or in situ preantral follicles cryopreservation, will allow salvage animal genetic resources in gene/banks animal / or even genetic human, and consequently to preserve and maintaining the female fertility. Several studies in different species, especially humans, have demonstrated the resumption of reproductive function including reporting the birth of healthy offspring after transplantation of cryopreserved ovarian tissue previously. However, in small ruminants, especially in goats, improvements are still not very significant. Therefore, it is concluded that further studies are required in order to define a protocol (slow freezing or vitrification) that ensures the viability and normal function of ovary and preantral follicles after thawing/warming.(AU)

Associação das técnicas de criopreservação e cultivo in vitro de folículos pré-antrais para a obtenção de embriões caprinos / Cryopreservation and in vitro culture of ovarian preantral follicles to obtaining goat embryos

A criopreservação tem sido de extrema importância para a preservação de material genético de machos e fêmeas para a utilização posterior em programas de reprodução assistida. Por essa razão, o emprego da criopreservação de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais tem se mostrado como uma ferramenta complementar para as biotecnologias da reprodução que visam maximizar o potencial reprodutivo de animais de grande valor genético mesmo após a morte ou descarte programado. A aplicação da criopreservação de folículos pré-antrais, isolados ou inclusos no tecido ovariano, permitirá a implantação de bancos de germoplasma animal/humano, com o intuito de preservar o patrimônio genético e, consequentemente, a preservação e manutenção da fertilidade de fêmeas. Vários estudos em diferentes espécies, notadamente em humanos, têm demonstrado a retomada da função reprodutiva relatando inclusive o nascimento de crias saudáveis após transplante de tecido ovariano previamente criopreservado. No entanto, em pequenos ruminantes, especialmente em caprinos, os avanços ainda são pouco significativos. Portanto, conclui-se que mais estudos são requeridos com o objetivo de definir um protocolo (congelação lenta ou vitrificação) que garanta a viabilidade e função ovariana e folicular, normais após a descongelação/aquecimento.

Cryopreservation has been extremely important for the preservation of male and female genetic material for later use in assisted reproduction procedures. Thus, the use of cryopreservation of oocytes enclosed in preantral follicles has been shown as a complementary tool for the reproduction biotechnologies aimed at maximizing the reproductive potential of animals of great genetic value even after death, unexpected or not, as well as after planed elimination. The application of isolated or in situ preantral follicles cryopreservation, will allow salvage animal genetic resources in gene/banks animal / or even genetic human, and consequently to preserve and maintaining the female fertility. Several studies in different species, especially humans, have demonstrated the resumption of reproductive function including reporting the birth of healthy offspring after transplantation of cryopreserved ovarian tissue previously. However, in small ruminants, especially in goats, improvements are still not very significant. Therefore, it is concluded that further studies are required in order to define a protocol (slow freezing or vitrification) that ensures the viability and normal function of ovary and preantral follicles after thawing/warming.

Ativina intraovariana: uma atualização sobre estrutura, regulação e função / Intraovarian activin: an update on structure, regulation and function

Background: Important advances have been made recently that clarify our understanding of the structural basis, signaling and regulation, as well as the biological role of activin in ovaries. During folliculogenesis various growth factors are produced locally in the mammalian ovary. Among these factors, activin has been a focal point in research as it has emerged as a crucial substance capable of inducing follicular development. The important actions indicate that activin has many relevant homeostatic functions in the reproduction of several species. Therefore, this review discusses the ligand protein structure, activin receptors, mechanisms of action and regulation, as well as the importance of activin on in vitro culture of preantral follicles. Review: Activin belongs to the transforming growth factor β (TGF - β) super family. It is a homodimer or heterodimer of two similar but distinct subunits (βA and βB). The dimerisation of activin subunits gives rise to three forms of activin, which are classified as, activin A (βA - βA), activin B (βB - βB) and activin AB (βA - βB). The biological activity of activin occurs through its connection with two types of cell surface receptors designated type I and type II. These receptors are represented by two isoforms, activin receptor types IA (ActR - IA), IB (ActR - IB), IIA (ActR - IIA) and IIB (ActR - IIB). Activin receptors are transmembrane proteins, composed of a ligand-binding extracellular domain, a transmembrane domain and a cytoplasmic domain with serine/threonine kinase activity. The transient activation of the receptor induces phosphorylation of protein mediators called Smads. Activation of Smad 2/3 by phosphorylation causes trimerization and hetero-oligomerization with the common Smad, Smad 4. This complex translocates to the nucleus to activating and regulating transcription of target genes. Members of another class of Smads act as negative regulators of the signal transduction pathway. Inhibitory Smad 7 can bind to type I receptors, preventing receptor–Smad 2/3 association, or by competitively binding of Smad 4, which blocks Smad intracellular translocation. In addition, within the extracellular environment, binding proteins such as follistatin and inhibin can modulate the biological activity of activin. In the ovaries of mammals specifically, activin participates in several cellular events, including cellular proliferation, differentiation, and survival, as well as assisting steroidal hormones during follicular development. Activin has been localized in the oocytes and granulosa cells of rodent, porcine, caprine and bovine follicles. Activin is also within the granulosa cells of human follicles and in the thecal layers of porcine and human. In addition, activin stimulates follicle growth in-vitro, is used in pre-antral ovine and caprine follicles and enhances growth and survival of human pre-antral follicles in vitro. Conclusion: Activin is controlled by competitive substances and a dynamic interaction between the various regulatory proteins responsible for coordinating several signaling pathways. The balance between the actions of these proteins is critical for regulation of gene expression in different structures, including pre-antral follicles. However, the nature of physiological effects of activin in the ovary is still equivocal and awaits clarification.(AU)

Ativina intraovariana: uma atualização sobre estrutura, regulação e função / Intraovarian activin: an update on structure, regulation and function

Background: Important advances have been made recently that clarify our understanding of the structural basis, signaling and regulation, as well as the biological role of activin in ovaries. During folliculogenesis various growth factors are produced locally in the mammalian ovary. Among these factors, activin has been a focal point in research as it has emerged as a crucial substance capable of inducing follicular development. The important actions indicate that activin has many relevant homeostatic functions in the reproduction of several species. Therefore, this review discusses the ligand protein structure, activin receptors, mechanisms of action and regulation, as well as the importance of activin on in vitro culture of preantral follicles. Review: Activin belongs to the transforming growth factor β (TGF - β) super family. It is a homodimer or heterodimer of two similar but distinct subunits (βA and βB). The dimerisation of activin subunits gives rise to three forms of activin, which are classified as, activin A (βA - βA), activin B (βB - βB) and activin AB (βA - βB). The biological activity of activin occurs through its connection with two types of cell surface receptors designated type I and type II. These receptors are represented by two isoforms, activin receptor types IA (ActR - IA), IB (ActR - IB), IIA (ActR - IIA) and IIB (ActR - IIB). Activin receptors are transmembrane proteins, composed of a ligand-binding extracellular domain, a transmembrane domain and a cytoplasmic domain with serine/threonine kinase activity. The transient activation of the receptor induces phosphorylation of protein mediators called Smads. Activation of Smad 2/3 by phosphorylation causes trimerization and hetero-oligomerization with the common Smad, Smad 4. This complex translocates to the nucleus to activating and regulating transcription of target genes. Members of another class of Smads act as negative regulators of the signal transduction pathway. Inhibitory Smad 7 can bind to type I receptors, preventing receptor–Smad 2/3 association, or by competitively binding of Smad 4, which blocks Smad intracellular translocation. In addition, within the extracellular environment, binding proteins such as follistatin and inhibin can modulate the biological activity of activin. In the ovaries of mammals specifically, activin participates in several cellular events, including cellular proliferation, differentiation, and survival, as well as assisting steroidal hormones during follicular development. Activin has been localized in the oocytes and granulosa cells of rodent, porcine, caprine and bovine follicles. Activin is also within the granulosa cells of human follicles and in the thecal layers of porcine and human. In addition, activin stimulates follicle growth in-vitro, is used in pre-antral ovine and caprine follicles and enhances growth and survival of human pre-antral follicles in vitro. Conclusion: Activin is controlled by competitive substances and a dynamic interaction between the various regulatory proteins responsible for coordinating several signaling pathways. The balance between the actions of these proteins is critical for regulation of gene expression in different structures, including pre-antral follicles. However, the nature of physiological effects of activin in the ovary is still equivocal and awaits clarification.

EFEITO DA OVARIECTOMIA E IDADE SOBRE AS CONCENTRAÇÕES SÉRICAS DE HORMÔNIO ANTI-MÜLLERIANO EM ÉGUAS

O hormônio Anti-Mülleriano (AMH) tem sido proposto como marcador fidedigno da reserva ovariana, estimando a expectativa de vida reprodutiva remanescente da fêmea. Atualmente,em reprodução assistida humana, tem sido utilizado para determinar o tratamento a ser seguido e conduzir a expectativa da paciente. Em equinos, pouco se sabe sobre a produção de AMH e sua importância clínica. Sendo assim, o objetivo principal deste estudo foi descrever a concentração de AMH ao longo da vida das éguas e avaliar sua concentração após ovariectomia, em busca de relacionar AMH com reserva folicular ovariana. Foram realizados 2 experimentos. Experimento 1: Foi realizada a colheita de sangue de 1058 éguas Quarto de Milha, de 1 dia a 33 anos de idade, com o objetivo de relacionar AMH com a idade da égua. Experimento 2: 13 éguas (6 jovens e 7 idosas) foram submetidas a duas cirurgias de ovariectomia com intervalo médio de 111 dias. Amostras de sangue para dosagem de AMH foram retiradas imediatamente antes da primeira cirurgia e diariamente durante 15 dias. Na segunda cirurgia, amostras de sangue foram coletadas imediatamente antes da cirurgia e 15 dias após a mesma. AMH foi dosado por técnica de ELISA (Equine AMH ELISA; Ansh Labs, Webster, TX, USA). Testes não paramétricos foram utilizados para confrontar as medianas dos níveis de AMH entre diferentes categorias de idade e médias dos períodos pré e pós operatórios. A idade foi responsável por somente 5% da variabilidade dos níveis de AMH. A concentração média foi mantida desde o nascimento até aproximadamente 18 anos de vida, quando começa a cair lentamente. A queda se acentua com aproximadamente 23 anos de idade e chega a zero aos 30 anos. A concentração de AMH após ovariectomia unilateral apresenta uma queda abrupta no pós operatório imediato. Após intervalo entre primeira e segunda cirurgia, as éguas apresentaram uma recuperação na concentração sérica de AMH. Em conclusão, AMH não apresenta relação com idade em éguas. Mais trabalhos precisam ser realizados com intuito de relacionar AMH com atividade folicular ovariana em éguas.

Anti-Müllerian hormone (AMH) has been proposed as a reliable marker of ovarian reserve, estimating the expected remaining female reproductive life. Currently, in human assisted reproduction, AMH has been used to determine the treatment to be followed and lead to the expectation of the patient. In horses, little is known about the production of AMH and its clinical significance. Thus, the aim of this study was to describe the production of AMH lifelong of mares and evaluate its production after ovariectomy, aiming to relate AMH with ovarian follicular reserve. 2 experiments were performed. Experiment 1: 1058 Quarter Horse mares, from 1 day to 33 years old were sampled in order to relate AMH with the age of the mare. Experiment 2: 13 mares (6 young and 7 old) underwent two ovariectomy surgeries with a mean interval of 111 days. Blood samples for AMH levels were drawn immediately before surgery and daily for 15 days. In the second surgery, blood samples were collected immediately before surgery and 15 days after. AMH was measured by ELISA (Equine AMH ELISA; Ansh Labs, Webster, TX, USA). Non-parametric tests were used to compare the median AMH levels between different age categories and the mean in the pre and postoperative periods. Age was responsible for only 5% of the variability in AMH levels. The average production was maintained from birth to about 18 years, when started to fall slowly. The decrease is higher with approximately 23 years of age and reaches zero after 30 years. The production of AMH after unilateral ovariectomy shows an abrupt drop in the postsurgery period. After the interval between the first and second surgery, the mares showed a recovery in the production of serum AMH. In conclusion, AMH doesnt have a correlation with age in mares. More works need to be carried out with the aim of linking AMH with ovarian follicular activity in mares.¨¨

ANÁLISE DE VIABILIDADE DE FOLÍCULOS OVARIANOS PRÉ-ANTRAIS DE GATAS DOMÉSTICAS (Felis silvestris catus) APÓS CRIOPRESERVAÇÃO

Folículo pré-antral (FOPA) é um material valioso e deve ser preservado quando se institui um programa de banco genético para espécies ameaçadas de extinção. O Vermelho Neutro (VN) é um biomarcador barato e foi usado durante décadas em células para estudos toxicológicos na indústria e pesquisa. No entanto o VN ainda não é validado para acessar a viabilidade de FOPAs de gata. O corante TB em contraste foi já estabelecido para a avaliação da viabilidade dos FOPAs isolados de gata. O objetivo do presente estudo foi avaliar a viabilidade de FOPAS de gatas isolados e/ou inseridos no córtex ovariano em diferentes momentos após refrigeração por intermédio da coloração com VN e TB. A coleta de FOPAs isolados foi realizada através de filtragem em peneiras e as amostras de FOPAs inclusos no córtex ovariano foram coletadas pela dissecção ovariana. Ambas as metodologias foram realizadas conforme protocolos previamente estabelecidos para a espécie por Jewgenow e Goritz (1995) e Jewgenow et al. (2011). Os FOPAs isolados foram corados em DPBS e VN (40:1 v/v) e DPBS com TB(10:1 v/v); os FOPAs incluso por meio de lavagem e VN (40:1 v/v). Para FOPAs isolados resultados indicam resultados semelhantes para ambos os corantes VN e TB. Foi observada diferença significativa entre controle e 72h e entre 24h. Observou-se uma correlação moderada (r2=0,53, P=0,0073) entre os resultados das colorações TB e V N nos grupos isolados. Não houve diferença significativa sobre a viabilidade de FOPAs inserido no córtex em nenhum dos tempos de refrigeração. Os resultados de viabilidade de FOPAs incluídos mostram uma variabilidade grande entre os grupos examinados, o que pode ser decorrente de uma grande variação individual. Os resultados demonstram que o VN pode ser utilizado como um biomarcador de viabilidade de FOPAs de gatas domésticas.

The ovarian cortical tissue banks have a huge potential to be applied in the conservation of threatened wild cats. The ovaries are home to a huge gene pool - the pre-antral follicles (PAF), corresponding to approximately 90% of the oocyte pool. The purpose of this research is to evaluate the impact of ovary transport refrigerated at 4 ° C followed by vitrification, on the PAF viability. Ovaries from twelve cats were kept at 4 ° C for 0-6 (control), 24 and 72 hours at a pre programmed refrigerator. After each time cooling the ovarian cortex was isolated and 2mm samples were collected with a punch to standardize the size of the samples. The samples were subjected viability analysis with neutral red (NR), histological, ultrastructural and then vitrified. The vitrification procedure was performed according to the recommendations by Keros et al. (2009, Hum Reprod, 24, 1670-83). After warm samples were analyzed again with and VN, histology, and ultrastructure. The results showed no significant difference in the viability of FOPAs after devitrification between the control groups and 24 hours, on the contrary, the group 72 hours was affected by vitrification procedure. These results allow us to combine refrigerated transport strategies to a 24-hour for femalegonads with vitrification of ovarian cortex, enabling the collection and storage of this material through a genetic bank of ovarian cortical tissue.

Efeito de diferentes concentrações de hormônio folículo-estimulante recombinante sobre o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais caprinos e ovinos isolados / Effect of different concentrations of recombinant follicle stimulating hormone on the in vitro development of preantral follicles isolated from goats and sheeps

Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do hormônio folículo estimulante recombinante (FSHr) sobre o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais (FOPA) caprinos e ovinos isolados. Folículos pré-antrais (≥ 150 µ m) foram isolados de fragmentos do córtex ovariano de cabras e ovelhas e cultivados individualmente por 24 dias em α-MEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), 1% de insulina-transferrina-selênio (ITS), 1% de antibióticos e 50µg/mL de ácido ascórbico, na ausência (controle) ou presença de FSHr (100 ou 1000 ng/mL), a 39 °C com 5% de CO2 em ar. Durante o cultivo avaliou-se a morfologia, o crescimento folicular e a formação de antro. Foi observado que, na espécie caprina, o cultivo com FSHr apresentou percentuais de folículos morfologicamente normais semelhantes ao controle até o 12º dia de cultivo (P>0,05), ocorrendo uma redução deste parâmetro no 18º dia (P<0,05) somente no tratamento com 1000 ng/mL de FSRr. Na espécie ovina, o percentual de folículos morfologicamente normais foi semelhante em todos os tratamentos, observando-se um decréscimo a partir do 12º dia (P<0,05). Com relação ao desenvolvimento folicular, em caprinos, a adição de FSHr aumentou a taxa de crescimento em relação ao controle (P<0,05). Entretanto, em ovinos, isso só foi observado no tratamento com 1000 ng/mL de FSHr. No que se refere à formação de antro, em ambas as espécies, não houve diferença significativa entre os tratamentos com FSHr e o controle. Quanto à análise da configuração da cromatina, todos os oócitos permaneceram em estádio de vesícula germinativa. Assim, pôde-se concluir que FOPA caprinos e ovinos são capazes de manter a sobrevivência e o crescimento in vitro até o estádio antral na ausência de FSH. Contudo, este hormônio teve um papel importante na taxa de crescimento folicular em ambas as espécies.

The aim of this work was to evaluate the effects of recombinant follicle stimulating hormone (rFSH) on the in vitro development of isolated caprine and ovine preantral follicles. Preantral follicles (≥ 150 micron) were isolated from fragments of goats and sheeps ovarian cortex and individually cultured for 24 days in α-MEM supplemented with 10% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin -selenium (ITS), 1% antibiotics and 50 mg / mL ascorbic acid, in the absence (control) or presence of FSHR (100 or 1000 ng / mL) at 39 ° C with 5% CO2 in air. Follicular morphology, growth and antral cavity formation were assessed throughout the culture. The results showed that addition of rFSH to the medium had no effect on the percentages of caprine morphologically normal follicles until day 12 as compared with the control, but a decrease was observed on day 18 with the use of the hormone (p<0.05) only rFSH (1000 ng/mL). Regarding ovine follicles, percentages of normal follicles were significantly reduced from day 12 onwards in all treatments, which led to similar results. Growth rates were increased in caprine follicles by use of rFSH (100 and 1000 ng/ml) in comparison to the control (p<0,05). In ovine follicles, such effect was observed only when rFSH was used at 1000 ng/ml. With respect to antral cavity formation, no diference among treatments was observed for both species. The analysis of chromatin configuration revealed that all oocytes remained at the germinal vesicle stage. In conclusion, caprine and ovine preantral follicles are capable to survive and develop to the antral stage in vitro without FSH. However, this hormone is important for increasing follicular growth rates in both species.