New sensitive real-time PCR targeting p28 gene for detection of Ehrlichia canis in blood samples from dogs / Novo PCR em tempo real sensível que visa o gene p28 para a detecção de Ehrlichia canis em amostras de sangue de cães

This study aims to describe a new detection method of a quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) targeting the 28 kDa outer membrane protein gene (p28) as well as to compare this method with a conventional PCR (cPCR), which targets the same gene, in order to evaluate the performance of the technique designed in this study in detecting Ehrlichia canis (E. canis). Optimum oligonucleotides concentrations were reached, and the analytical sensitivity and specificity of the qPCR were performed. A total of 218 dogs’ whole blood samples were conventionally collected for this study. The DNA was extracted from each sample. Subsequently, the samples were tested by an established cPCR and the new qPCR to compare each technique’s performances. This new qPCR method for the molecular detection of E. canis presented a detection limit of ten copies of the fragment and was considered specific for E. canis according to analytical specificity analyses performed in vitro and in silico. The standard curve revealed 100% efficiency and a coefficient of determination (R²) equivalent to 99.8%. Among the samples examined by qPCR, 24.31% were considered positive, significantly greater than those detected by cPCR (15.13%). The qPCR technique reached a higher sensitivity than the cPCR when targeting the p28 gene in detecting E. canis. The qPCR standardized in this study is an efficient method for confirming canine monocytic ehrlichiosis (CME) diagnosis and might provide the parasitemia monitoring during the disease treatment.

Este estudo tem como objetivo descrever um novo método de detecção de uma reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) visando o gene da proteína da membrana externa de 28 kDa (p28), bem como comparar este método com um PCR convencional (cPCR), que visa o mesmo gene, a fim de avaliar o desempenho da técnica desenhada neste estudo na detecção de Ehrlichia canis (E. canis). As concentrações ideais de oligonucleotídeos foram alcançadas e a sensibilidade analítica e a especificidade do qPCR foram determinadas. Um total de 218 amostras de sangue total de cães foram coletadas convencionalmente para este estudo. O DNA foi extraído de cada amostra. Posteriormente, as amostras foram testadas por um cPCR estabelecido e o novo qPCR para comparar os desempenhos entre cada técnica. A curva padrão revelou 100% de eficiência e coeficiente de determinação (R²) equivalente a 99,8%. Dentre as amostras examinadas por qPCR, 24,31% foram consideradas positivas, percentual significativamente maior do que as detectadas por cPCR (15,13%). A técnica qPCR atingiu uma sensibilidade maior do que a cPCR na detecção de E. canis. A qPCR padronizada neste estudo é um método eficiente para a confirmação do diagnóstico de erliquiose monocítica canina (EMC) e pode fornecer o monitoramento de níveis de parasitemia ao longo do tratamento da doença.

New sensitive real-time PCR targeting p28 gene for detection of Ehrlichia canis in blood samples from dogs / Novo PCR em tempo real sensível que visa o gene p28 para a detecção de Ehrlichia canis em amostras de sangue de cães

ABSTRACT: This study aims to describe a new detection method of a quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) targeting the 28 kDa outer membrane protein gene (p28) as well as to compare this method with a conventional PCR (cPCR), which targets the same gene, in order to evaluate the performance of the technique designed in this study in detecting Ehrlichia canis (E. canis). Optimum oligonucleotides concentrations were reached, and the analytical sensitivity and specificity of the qPCR were performed. A total of 218 dogs' whole blood samples were conventionally collected for this study. The DNA was extracted from each sample. Subsequently, the samples were tested by an established cPCR and the new qPCR to compare each technique's performances. This new qPCR method for the molecular detection of E. canis presented a detection limit of ten copies of the fragment and was considered specific for E. canis according to analytical specificity analyses performed in vitro and in silico. The standard curve revealed 100% efficiency and a coefficient of determination (R2) equivalent to 99.8%. Among the samples examined by qPCR, 24.31% were considered positive, significantly greater than those detected by cPCR (15.13%). The qPCR technique reached a higher sensitivity than the cPCR when targeting the p28 gene in detecting E. canis. The qPCR standardized in this study is an efficient method for confirming canine monocytic ehrlichiosis (CME) diagnosis and might provide the parasitemia monitoring during the disease treatment.

RESUMO: Este estudo tem como objetivo descrever um novo método de detecção de uma reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) visando o gene da proteína da membrana externa de 28 kDa (p28), bem como comparar este método com um PCR convencional (cPCR), que visa o mesmo gene, a fim de avaliar o desempenho da técnica desenhada neste estudo na detecção de Ehrlichia canis (E. canis). As concentrações ideais de oligonucleotídeos foram alcançadas e a sensibilidade analítica e a especificidade do qPCR foram determinadas. Um total de 218 amostras de sangue total de cães foram coletadas convencionalmente para este estudo. O DNA foi extraído de cada amostra. Posteriormente, as amostras foram testadas por um cPCR estabelecido e o novo qPCR para comparar os desempenhos entre cada técnica. A curva padrão revelou 100% de eficiência e coeficiente de determinação (R2) equivalente a 99,8%. Dentre as amostras examinadas por qPCR, 24,31% foram consideradas positivas, percentual significativamente maior do que as detectadas por cPCR (15,13%). A técnica qPCR atingiu uma sensibilidade maior do que a cPCR na detecção de E. canis. A qPCR padronizada neste estudo é um método eficiente para a confirmação do diagnóstico de erliquiose monocítica canina (EMC) e pode fornecer o monitoramento de níveis de parasitemia ao longo do tratamento da doença.

New sensitive real-time PCR targeting p28 gene for detection of Ehrlichia canis in blood samples from dogs / Novo PCR em tempo real sensível que visa o gene p28 para a detecção de Ehrlichia canis em amostras de sangue de cães

This study aims to describe a new detection method of a quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) targeting the 28 kDa outer membrane protein gene (p28) as well as to compare this method with a conventional PCR (cPCR), which targets the same gene, in order to evaluate the performance of the technique designed in this study in detecting Ehrlichia canis (E. canis). Optimum oligonucleotides concentrations were reached, and the analytical sensitivity and specificity of the qPCR were performed. A total of 218 dogs whole blood samples were conventionally collected for this study. The DNA was extracted from each sample. Subsequently, the samples were tested by an established cPCR and the new qPCR to compare each techniques performances. This new qPCR method for the molecular detection of E. canis presented a detection limit of ten copies of the fragment and was considered specific for E. canis according to analytical specificity analyses performed in vitro and in silico. The standard curve revealed 100% efficiency and a coefficient of determination (R²) equivalent to 99.8%. Among the samples examined by qPCR, 24.31% were considered positive, significantly greater than those detected by cPCR (15.13%). The qPCR technique reached a higher sensitivity than the cPCR when targeting the p28 gene in detecting E. canis. The qPCR standardized in this study is an efficient method for confirming canine monocytic ehrlichiosis (CME) diagnosis and might provide the parasitemia monitoring during the disease treatment.(AU)

Este estudo tem como objetivo descrever um novo método de detecção de uma reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) visando o gene da proteína da membrana externa de 28 kDa (p28), bem como comparar este método com um PCR convencional (cPCR), que visa o mesmo gene, a fim de avaliar o desempenho da técnica desenhada neste estudo na detecção de Ehrlichia canis (E. canis). As concentrações ideais de oligonucleotídeos foram alcançadas e a sensibilidade analítica e a especificidade do qPCR foram determinadas. Um total de 218 amostras de sangue total de cães foram coletadas convencionalmente para este estudo. O DNA foi extraído de cada amostra. Posteriormente, as amostras foram testadas por um cPCR estabelecido e o novo qPCR para comparar os desempenhos entre cada técnica. A curva padrão revelou 100% de eficiência e coeficiente de determinação (R²) equivalente a 99,8%. Dentre as amostras examinadas por qPCR, 24,31% foram consideradas positivas, percentual significativamente maior do que as detectadas por cPCR (15,13%). A técnica qPCR atingiu uma sensibilidade maior do que a cPCR na detecção de E. canis. A qPCR padronizada neste estudo é um método eficiente para a confirmação do diagnóstico de erliquiose monocítica canina (EMC) e pode fornecer o monitoramento de níveis de parasitemia ao longo do tratamento da doença.(AU)

Molecular detection of Babesia vogeli, Ehrlichia canis and Anaplasma platys in a hospital population of dogs clinically diagnosed with hemoparasitosis / Detecção molecular de Babesia vogeli, Ehrlichia canis e Anaplasma platys em uma população hospitalar de cães diagnosticados clinicamente com hemoparasitoses

There is an increase in tick-borne diseases in dogs in urban and rural areas in Brazil and some of these are of public health importance. Rhipicephalus sanguineus-transmitted hemoparasitoses are the main causes of mortality in dogs. The present study investigated the molecular occurrence of Ehrlichiacanis, Babesia vogeli and Anaplasma platys in dogs with clinical sings and hematological abnormalities suggestive of tick-borne diseases. These dogs were seen at a Veterinary Hospital of a Public University between January 2014 and December 2016, and were evaluated through anamnesis, clinical examination and complementary exams. The polymerase chain reaction technique was used to detect the presence of hemoparasites DNA. From the 461 dogs that were tested for B. vogeli, 10.6% (49/461) were positive, the associated variable was age. Regarding the 730 animals screened for E. canis, 15.1% (110/730) were positive, and the infection was associated with hematocrit and number of platelets. Relative to the 86 samples evaluated for A. platys, 15.1% (13/86) were positive, and no variable presented statistical significance. From the animals positive for B. vogeli, no of these showed positivity by qPCR for Rangelia vitalii. It is concluded that the occurrence of hemoparasitosis in dogs from the Londrina region is common. Therefore, it is emphasized that molecular techniques should be used as an auxiliary tool for the differential diagnosis of the different etiological agents causing hemoparasitosis. Additionally, these molecular tools are essential for better investigation and preventive assertiveness because it allows to detect parasite DNA.

Há um aumento na ocorrência das doenças transmitidas carrapato em cães em áreas urbanas e rurais no Brasil, algumas, inclusive, são de importância para a saúde pública. As hemoparasitoses transmitidas por Rhipicephalus sanguineus estão entre as principais causas de mortalidade em cães. O presente trabalho teve como objetivo investigar a ocorrência por meio de detecção molecular de Ehrlichia canis, Babesiavogeli e Anaplasma platys em cães com sinais clínicos e anormalidades hematológicas sugestivas de doenças transmitidas por carrapatos. Esses cães foram atendidos em um hospital veterinário de uma universidade pública entre janeiro de 2014 e dezembro de 2016, onde foram avaliados por anamnese, exame clínico e exames complementares. A técnica de reação em cadeia da polimerase foi utilizada para detectar a presença de hemoparasitas. Dos 461 cães testados para B. vogeli, 10,6% (49/461) foram positivos, a variável associada foi a idade. Em relação aos 730 animais testados para E. canis, 15,1%(110/730) foram positivos, e a infecção foi associada ao hematócrito e ao número de plaquetas. Das86 amostras testadas para A. platys, 15,1% (13/86) foram positivas e nenhuma variável apresentou significância estatística. Dentre os animais positivos para B. vogeli, nenhum foi positivo no qPCR para Rangelia vitalii. Conclui-se que a ocorrência de hemoparasitose em cães da região de Londrina é comum. Assim, enfatiza-se que as técnicas moleculares devem ser utilizadas como ferramentas auxiliares para o diagnóstico diferencial dos diferentes agentes etiológicos causadores da hemoparasitose. Além disso, são essenciais para uma melhor investigação e assertividade preventiva, pois permitem detectar o DNA do parasita.

Molecular detection of Babesia vogeli, Ehrlichia canis and Anaplasma platys in a hospital population of dogs clinically diagnosed with hemoparasitosis / Detecção molecular de Babesia vogeli, Ehrlichia canis e Anaplasma platys em uma população hospitalar de cães diagnosticados clinicamente com hemoparasitoses

There is an increase in tick-borne diseases in dogs in urban and rural areas in Brazil and some of these are of public health importance. Rhipicephalus sanguineus-transmitted hemoparasitoses are the main causes of mortality in dogs. The present study investigated the molecular occurrence of Ehrlichiacanis, Babesia vogeli and Anaplasma platys in dogs with clinical sings and hematological abnormalities suggestive of tick-borne diseases. These dogs were seen at a Veterinary Hospital of a Public University between January 2014 and December 2016, and were evaluated through anamnesis, clinical examination and complementary exams. The polymerase chain reaction technique was used to detect the presence of hemoparasites DNA. From the 461 dogs that were tested for B. vogeli, 10.6% (49/461) were positive, the associated variable was age. Regarding the 730 animals screened for E. canis, 15.1% (110/730) were positive, and the infection was associated with hematocrit and number of platelets. Relative to the 86 samples evaluated for A. platys, 15.1% (13/86) were positive, and no variable presented statistical significance. From the animals positive for B. vogeli, no of these showed positivity by qPCR for Rangelia vitalii. It is concluded that the occurrence of hemoparasitosis in dogs from the Londrina region is common. Therefore, it is emphasized that molecular techniques should be used as an auxiliary tool for the differential diagnosis of the different etiological agents causing hemoparasitosis. Additionally, these molecular tools are essential for better investigation and preventive assertiveness because it allows to detect parasite DNA.(AU)

Há um aumento na ocorrência das doenças transmitidas carrapato em cães em áreas urbanas e rurais no Brasil, algumas, inclusive, são de importância para a saúde pública. As hemoparasitoses transmitidas por Rhipicephalus sanguineus estão entre as principais causas de mortalidade em cães. O presente trabalho teve como objetivo investigar a ocorrência por meio de detecção molecular de Ehrlichia canis, Babesiavogeli e Anaplasma platys em cães com sinais clínicos e anormalidades hematológicas sugestivas de doenças transmitidas por carrapatos. Esses cães foram atendidos em um hospital veterinário de uma universidade pública entre janeiro de 2014 e dezembro de 2016, onde foram avaliados por anamnese, exame clínico e exames complementares. A técnica de reação em cadeia da polimerase foi utilizada para detectar a presença de hemoparasitas. Dos 461 cães testados para B. vogeli, 10,6% (49/461) foram positivos, a variável associada foi a idade. Em relação aos 730 animais testados para E. canis, 15,1%(110/730) foram positivos, e a infecção foi associada ao hematócrito e ao número de plaquetas. Das86 amostras testadas para A. platys, 15,1% (13/86) foram positivas e nenhuma variável apresentou significância estatística. Dentre os animais positivos para B. vogeli, nenhum foi positivo no qPCR para Rangelia vitalii. Conclui-se que a ocorrência de hemoparasitose em cães da região de Londrina é comum. Assim, enfatiza-se que as técnicas moleculares devem ser utilizadas como ferramentas auxiliares para o diagnóstico diferencial dos diferentes agentes etiológicos causadores da hemoparasitose. Além disso, são essenciais para uma melhor investigação e assertividade preventiva, pois permitem detectar o DNA do parasita.(AU)

Hemoparasitas e bactérias hemotrópicas observadas por microscopia direta em amostras de sangue periférico de cães em uma clínica particular no município de Lorena, São Paulo, Brasil / Hemoparasites and hemotropic bacteria detected through direct microscopy in dogs peripheric blood samples in a veterinarian private clinic in the municipality of Lorena, São Paulo, Brazil

As hemoparasitoses, afecções responsáveis por complicações clínicas e hematológicas, são um grande desafio para o clínico e patolo-gista clínico. Sua alta incidência em todo o território brasileiro e a dificuldade observada para o estabelecimento de um diagnóstico preciso levam muitas vezes ao emprego de tentativas e diagnós-tico terapêutico. Os principais agentes etiológicos encontrados no Brasil são Anaplasma platys, Babesia canis vogeli, Ehrlichia canis, Mycoplasma haemocanis e, com menor frequência e importância clí-nica, Anaplasma phagocytophilum. Os altos índices pluviométricos e temperaturas elevadas, observados no Brasil, país tropical, favorecem os ciclos de vida dos artrópodes vetores de tais agentes, e tornam seu controle um grande desafio para veterinários e proprietários de animais. Os agentes etiológicos determinam manifestações clínicas inespecíficas: febre, apatia, anorexia e alterações hematológicas como trombocitopenia e anemia, o que pode dificultar ainda mais sua detecção. Este trabalho descreve a ocorrência de hematozoá-rios em uma clínica veterinária particular no município de Lorena, São Paulo, e as principais alterações hematológicas encontradas nas avaliações dos animais acometidos pelas enfermidades(AU)

Hemoparasitosis, diseases that may cause clinical and hematological complications, are considered a great challenge to practitioners and clinical pathologists. Its high incidence in all Brazilian territory and the difficulty for a precise diagnosis can lead in most cases to a therapeutic diagnosis. Anaplasma platys, Babesia canis vogeli, Ehrlichia canis, Mycoplasma haemocanis and with a lower frequency and clinical relevance, Anaplasma phagocytophilum are the main etiological agents affecting dogs in Brazil. The climatic conditions found in several Brazilian areas, such as high rain and temperature levels, favor the arthropods vectors life cycles. This subject became an important challenge to both veterinarians and pet owners. These etiological agents determine unspecific clinical signs, such as fever, apathy, anorexia and hematological alterations like thrombocytopenia and anemia, which may make their detection even more difficult. This paper describes the occurrence of hemoparasites and the hematological results of dogs attended in a veterinarian private clinic in the municipality of Lorena, São Paulo, Brazil.CLÍNICA DE PEQUENOS ANIMAISHemoparasitas e bactérias hemotrópicas observadas por microscopia direta em amostras de sangue periférico de cães em uma clínica particular no município de Lorena, São Paulo, Brasil(AU)

Hemoparasitas e bactérias hemotrópicas observadas por microscopia direta em amostras de sangue periférico de cães em uma clínica particular no município de Lorena, São Paulo, Brasil / Hemoparasites and hemotropic bacteria detected through direct microscopy in dogs peripheric blood samples in a veterinarian private clinic in the municipality of Lorena, São Paulo, Brazil

As hemoparasitoses, afecções responsáveis por complicações clínicas e hematológicas, são um grande desafio para o clínico e patolo-gista clínico. Sua alta incidência em todo o território brasileiro e a dificuldade observada para o estabelecimento de um diagnóstico preciso levam muitas vezes ao emprego de tentativas e diagnós-tico terapêutico. Os principais agentes etiológicos encontrados no Brasil são Anaplasma platys, Babesia canis vogeli, Ehrlichia canis, Mycoplasma haemocanis e, com menor frequência e importância clí-nica, Anaplasma phagocytophilum. Os altos índices pluviométricos e temperaturas elevadas, observados no Brasil, país tropical, favorecem os ciclos de vida dos artrópodes vetores de tais agentes, e tornam seu controle um grande desafio para veterinários e proprietários de animais. Os agentes etiológicos determinam manifestações clínicas inespecíficas: febre, apatia, anorexia e alterações hematológicas como trombocitopenia e anemia, o que pode dificultar ainda mais sua detecção. Este trabalho descreve a ocorrência de hematozoá-rios em uma clínica veterinária particular no município de Lorena, São Paulo, e as principais alterações hematológicas encontradas nas avaliações dos animais acometidos pelas enfermidades

Hemoparasitosis, diseases that may cause clinical and hematological complications, are considered a great challenge to practitioners and clinical pathologists. Its high incidence in all Brazilian territory and the difficulty for a precise diagnosis can lead in most cases to a therapeutic diagnosis. Anaplasma platys, Babesia canis vogeli, Ehrlichia canis, Mycoplasma haemocanis and with a lower frequency and clinical relevance, Anaplasma phagocytophilum are the main etiological agents affecting dogs in Brazil. The climatic conditions found in several Brazilian areas, such as high rain and temperature levels, favor the arthropods vectors life cycles. This subject became an important challenge to both veterinarians and pet owners. These etiological agents determine unspecific clinical signs, such as fever, apathy, anorexia and hematological alterations like thrombocytopenia and anemia, which may make their detection even more difficult. This paper describes the occurrence of hemoparasites and the hematological results of dogs attended in a veterinarian private clinic in the municipality of Lorena, São Paulo, Brazil.CLÍNICA DE PEQUENOS ANIMAISHemoparasitas e bactérias hemotrópicas observadas por microscopia direta em amostras de sangue periférico de cães em uma clínica particular no município de Lorena, São Paulo, Brasil

Detection molecular of Rangelia vitalii in dogs from Parana State, Southern Brazil / Detecção molecular de Rangelia vitalii em cães do Estado do Paraná, Sul do Brasil

Rangelia vitalii infects erythrocytes, leukocytes and endothelial cells of dogs. The present study aimed to report the molecular detection confirmed by sequencing of R. vitalii in the state of Paraná, as well as describe the clinical, hematological and biochemical alterations of the infected dogs. Three sick dogs from the metropolitan area of Curitiba, PR, Brazil, underwent a physical exam, and laboratory tests included hematology, biochemistry, polymerase chain reaction (PCR), and gene sequencing. Clinical signs included apathy, anorexia, and hemorrhage. Intra-erythrocytic and extracellular piroplasms were found on peripheral blood smears from all three dogs. Blood samples from these animals were positive for Babesia sp. by PCR targeting 18S rRNA. PCR products from all three dogs were sequenced, and BLAST analysis showed that the PCR-generated sequences were highly homologous with those of R. vitalii previously reported. Hematologic findings included severe anemia, shift of neutrophils to the regenerative left, and thrombocytopenia. Serum urea levels were increased in all three dogs, and direct bilirubin levels were elevated in one dog.(AU)

Rangelia vitalii infecta eritrócitos, leucócitos e células endoteliais de cães. O presente estudo objetivou relatar a detecção molecular confirmada por sequenciamento de R. vitalii no estado do Paraná e descrever as alterações clínicas, hematológicas e bioquímicas dos cães infectados. Três cães doentes da região metropolitana de Curitiba, PR, Brasil, foram submetidos a exame físico e exames laboratoriais que incluíram hematologia, bioquímica, reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciamento genético. Os sinais clínicos incluíram apatia, anorexia e hemorragia. Piroplasmas intra-eritrocíticos e extracelulares foram encontrados em esfregaços de sangue periférico dos três cães. As amostras de sangue destes animais foram positivas para Babesia sp. pela PCR baseada no gene 18S rRNA. Os produtos de PCR dos três cães foram sequenciados e a análise de BLAST mostrou que as seqüências geradas por PCR eram altamente homólogas com as de R. vitalii previamente relatadas. Os achados hematológicos incluíram anemia grave, desvio de neutrófilos à esquerda regenerativo e trombocitopenia. Os níveis de uréia no soro aumentaram nos três cães, e os níveis de bilirrubina direta foram elevados em um cão.(AU)

Detection molecular of Rangelia vitalii in dogs from Parana State, Southern Brazil / Detecção molecular de Rangelia vitalii em cães do Estado do Paraná, Sul do Brasil

Rangelia vitalii infects erythrocytes, leukocytes and endothelial cells of dogs. The present study aimed to report the molecular detection confirmed by sequencing of R. vitalii in the state of Paraná, as well as describe the clinical, hematological and biochemical alterations of the infected dogs. Three sick dogs from the metropolitan area of Curitiba, PR, Brazil, underwent a physical exam, and laboratory tests included hematology, biochemistry, polymerase chain reaction (PCR), and gene sequencing. Clinical signs included apathy, anorexia, and hemorrhage. Intra-erythrocytic and extracellular piroplasms were found on peripheral blood smears from all three dogs. Blood samples from these animals were positive for Babesia sp. by PCR targeting 18S rRNA. PCR products from all three dogs were sequenced, and BLAST analysis showed that the PCR-generated sequences were highly homologous with those of R. vitalii previously reported. Hematologic findings included severe anemia, shift of neutrophils to the regenerative left, and thrombocytopenia. Serum urea levels were increased in all three dogs, and direct bilirubin levels were elevated in one dog.(AU)

Rangelia vitalii infecta eritrócitos, leucócitos e células endoteliais de cães. O presente estudo objetivou relatar a detecção molecular confirmada por sequenciamento de R. vitalii no estado do Paraná e descrever as alterações clínicas, hematológicas e bioquímicas dos cães infectados. Três cães doentes da região metropolitana de Curitiba, PR, Brasil, foram submetidos a exame físico e exames laboratoriais que incluíram hematologia, bioquímica, reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciamento genético. Os sinais clínicos incluíram apatia, anorexia e hemorragia. Piroplasmas intra-eritrocíticos e extracelulares foram encontrados em esfregaços de sangue periférico dos três cães. As amostras de sangue destes animais foram positivas para Babesia sp. pela PCR baseada no gene 18S rRNA. Os produtos de PCR dos três cães foram sequenciados e a análise de BLAST mostrou que as seqüências geradas por PCR eram altamente homólogas com as de R. vitalii previamente relatadas. Os achados hematológicos incluíram anemia grave, desvio de neutrófilos à esquerda regenerativo e trombocitopenia. Os níveis de uréia no soro aumentaram nos três cães, e os níveis de bilirrubina direta foram elevados em um cão.(AU)

Detection molecular of Rangelia vitalii in dogs from Parana State, Southern Brazil

Abstract Rangelia vitalii infects erythrocytes, leukocytes and endothelial cells of dogs. The present study aimed to report the molecular detection confirmed by sequencing of R. vitalii in the state of Paraná, as well as describe the clinical, hematological and biochemical alterations of the infected dogs. Three sick dogs from the metropolitan area of Curitiba, PR, Brazil, underwent a physical exam, and laboratory tests included hematology, biochemistry, polymerase chain reaction (PCR), and gene sequencing. Clinical signs included apathy, anorexia, and hemorrhage. Intra-erythrocytic and extracellular piroplasms were found on peripheral blood smears from all three dogs. Blood samples from these animals were positive for Babesia sp. by PCR targeting 18S rRNA. PCR products from all three dogs were sequenced, and BLAST analysis showed that the PCR-generated sequences were highly homologous with those of R. vitalii previously reported. Hematologic findings included severe anemia, shift of neutrophils to the regenerative left, and thrombocytopenia. Serum urea levels were increased in all three dogs, and direct bilirubin levels were elevated in one dog.

Resumo Rangelia vitalii infecta eritrócitos, leucócitos e células endoteliais de cães. O presente estudo objetivou relatar a detecção molecular confirmada por sequenciamento de R. vitalii no estado do Paraná e descrever as alterações clínicas, hematológicas e bioquímicas dos cães infectados. Três cães doentes da região metropolitana de Curitiba, PR, Brasil, foram submetidos a exame físico e exames laboratoriais que incluíram hematologia, bioquímica, reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciamento genético. Os sinais clínicos incluíram apatia, anorexia e hemorragia. Piroplasmas intra-eritrocíticos e extracelulares foram encontrados em esfregaços de sangue periférico dos três cães. As amostras de sangue destes animais foram positivas para Babesia sp. pela PCR baseada no gene 18S rRNA. Os produtos de PCR dos três cães foram sequenciados e a análise de BLAST mostrou que as seqüências geradas por PCR eram altamente homólogas com as de R. vitalii previamente relatadas. Os achados hematológicos incluíram anemia grave, desvio de neutrófilos à esquerda regenerativo e trombocitopenia. Os níveis de uréia no soro aumentaram nos três cães, e os níveis de bilirrubina direta foram elevados em um cão.

Rangeliosis: histopathological analysis, hematology and molecular detection of canine Rangelia vitalii in Rio Grande do Sul, Brazil / Rangeliose: achados anatomopatológicos, hematológicos e detecção molecular de Rangelia vitalii em cães no Rio Grande do Sul, Brasil

In the period from January 2004 to December 2015, 56 dogs were diagnosed with rangeliosis in the Setor de Patologia Veterinária at Universidade Federal do Rio Grande do Sul (SPV-UFRGS). The main hematological abnormalities were thrombocytopenia and anemia. The affected dogs showed signs of apathy, anorexia, fetid and bloody diarrhea, vomiting, and dehydration. At necropsy, the main changes were jaundice, splenomegaly, hepatomegaly, and lymphadenomegaly. Histological analyses revealed parasitophorous vacuoles of Rangelia vitalii in cytoplasmic endothelial cells, mainly in the heart, kidneys, lymph nodes, intestines, and pancreas. Inflammation characterized by mononuclear cells was predominant in the analysis, and most was due to the presence of plasma cells. Other lesion types observed were lymphoid hyperplasia, extramedullary hematopoiesis, erythrophagocytosis, and erythroid lineage hyperplasia in bone marrow. Of the total number of animals, 49 were diagnosed using necropsy and histological analysis, and seven were diagnosed using a molecular analysis (i.e., PCR and genetic sequencing of blood samples). This paper presented a different method of diagnosing rangeliosis in canines. This approach involved histological methods including the quantification and determination of the intensity and distribution of the infectious agent in different organs.

No período de janeiro de 2004 a dezembro de 2015, 56 caninos domésticos obtiveram o diagnóstico de rangeliose no Setor de Patologia Veterinária da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Os cães apresentaram sinais de apatia, anorexia, diarreia fétida e sanguinolenta, êmese e desidratação. As principais alterações hematológicas foram trombocitopenia e anemia. Na necropsia as principais alterações foram icterícia, esplenomegalia, hepatomegalia e linfadenomegalia. Na análise histológica observou-se vacúolos parasitóforos de Rangelia vitalii no citoplasma de células endoteliais, principalmente no coração, rins, linfonodos, intestinos e pâncreas. A inflamação mononuclear foi predominante na análise, sendo que a maioria deu-se pela presença de plasmócitos. Entre outras lesões frequentemente observadas estão hiperplasia linfoide, hematopoiese extramedular e eritrofagocitose, e hiperplasia de linhagem eritroide em medula óssea. Do total, 49 cães foram diagnosticados através de necropsia e análise histológica, e 7 animais através de análise molecular da PCR e sequenciamento genético de amostras de sangue. Este trabalho apresenta um diagnóstico diferencial de rangeliose em caninos, através do método histológico de quantificação e determinação de intensidade e distribuição do agente em diferentes órgãos.

Detection molecular of Rangelia vitalii in dogs from Parana State, Southern Brazil

Abstract Rangelia vitalii infects erythrocytes, leukocytes and endothelial cells of dogs. The present study aimed to report the molecular detection confirmed by sequencing of R. vitalii in the state of Paraná, as well as describe the clinical, hematological and biochemical alterations of the infected dogs. Three sick dogs from the metropolitan area of Curitiba, PR, Brazil, underwent a physical exam, and laboratory tests included hematology, biochemistry, polymerase chain reaction (PCR), and gene sequencing. Clinical signs included apathy, anorexia, and hemorrhage. Intra-erythrocytic and extracellular piroplasms were found on peripheral blood smears from all three dogs. Blood samples from these animals were positive for Babesia sp. by PCR targeting 18S rRNA. PCR products from all three dogs were sequenced, and BLAST analysis showed that the PCR-generated sequences were highly homologous with those of R. vitalii previously reported. Hematologic findings included severe anemia, shift of neutrophils to the regenerative left, and thrombocytopenia. Serum urea levels were increased in all three dogs, and direct bilirubin levels were elevated in one dog.

Resumo Rangelia vitalii infecta eritrócitos, leucócitos e células endoteliais de cães. O presente estudo objetivou relatar a detecção molecular confirmada por sequenciamento de R. vitalii no estado do Paraná e descrever as alterações clínicas, hematológicas e bioquímicas dos cães infectados. Três cães doentes da região metropolitana de Curitiba, PR, Brasil, foram submetidos a exame físico e exames laboratoriais que incluíram hematologia, bioquímica, reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciamento genético. Os sinais clínicos incluíram apatia, anorexia e hemorragia. Piroplasmas intra-eritrocíticos e extracelulares foram encontrados em esfregaços de sangue periférico dos três cães. As amostras de sangue destes animais foram positivas para Babesia sp. pela PCR baseada no gene 18S rRNA. Os produtos de PCR dos três cães foram sequenciados e a análise de BLAST mostrou que as seqüências geradas por PCR eram altamente homólogas com as de R. vitalii previamente relatadas. Os achados hematológicos incluíram anemia grave, desvio de neutrófilos à esquerda regenerativo e trombocitopenia. Os níveis de uréia no soro aumentaram nos três cães, e os níveis de bilirrubina direta foram elevados em um cão.

Rangeliosis: histopathological analysis, hematology and molecular detection of canine Rangelia vitalii in Rio Grande do Sul, Brazil / Rangeliose: achados anatomopatológicos, hematológicos e detecção molecular de Rangelia vitalii em cães no Rio Grande do Sul, Brasil

In the period from January 2004 to December 2015, 56 dogs were diagnosed with rangeliosis in the Setor de Patologia Veterinária at Universidade Federal do Rio Grande do Sul (SPV-UFRGS). The main hematological abnormalities were thrombocytopenia and anemia. The affected dogs showed signs of apathy, anorexia, fetid and bloody diarrhea, vomiting, and dehydration. At necropsy, the main changes were jaundice, splenomegaly, hepatomegaly, and lymphadenomegaly. Histological analyses revealed parasitophorous vacuoles of Rangelia vitalii in cytoplasmic endothelial cells, mainly in the heart, kidneys, lymph nodes, intestines, and pancreas. Inflammation characterized by mononuclear cells was predominant in the analysis, and most was due to the presence of plasma cells. Other lesion types observed were lymphoid hyperplasia, extramedullary hematopoiesis, erythrophagocytosis, and erythroid lineage hyperplasia in bone marrow. Of the total number of animals, 49 were diagnosed using necropsy and histological analysis, and seven were diagnosed using a molecular analysis (i.e., PCR and genetic sequencing of blood samples). This paper presented a different method of diagnosing rangeliosis in canines. This approach involved histological methods including the quantification and determination of the intensity and distribution of the infectious agent in different organs.(AU)

No período de janeiro de 2004 a dezembro de 2015, 56 caninos domésticos obtiveram o diagnóstico de rangeliose no Setor de Patologia Veterinária da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Os cães apresentaram sinais de apatia, anorexia, diarreia fétida e sanguinolenta, êmese e desidratação. As principais alterações hematológicas foram trombocitopenia e anemia. Na necropsia as principais alterações foram icterícia, esplenomegalia, hepatomegalia e linfadenomegalia. Na análise histológica observou-se vacúolos parasitóforos de Rangelia vitalii no citoplasma de células endoteliais, principalmente no coração, rins, linfonodos, intestinos e pâncreas. A inflamação mononuclear foi predominante na análise, sendo que a maioria deu-se pela presença de plasmócitos. Entre outras lesões frequentemente observadas estão hiperplasia linfoide, hematopoiese extramedular e eritrofagocitose, e hiperplasia de linhagem eritroide em medula óssea. Do total, 49 cães foram diagnosticados através de necropsia e análise histológica, e 7 animais através de análise molecular da PCR e sequenciamento genético de amostras de sangue. Este trabalho apresenta um diagnóstico diferencial de rangeliose em caninos, através do método histológico de quantificação e determinação de intensidade e distribuição do agente em diferentes órgãos.(AU)

Ocorrência de infecção concomitante natural por Ehrlichia sp., Anaplasma sp. e Babesia sp. em cão assistido no Hospital Veterinário da Universidade Federal de Uberlândia / Occurrence of concomitant natural infection by Ehrlichia sp., Anaplasma sp. and Babesia sp. in a dog assisted at the Hospital of the Veterinary University of Uberlândia

Foi atendido no ambulatório do Hospital Veterinário da Universidade Federal de Uberlândia um canino sem raça definida de quatro anos de idade, domiciliado. Na anamnese o proprietário relatou que o cão estava apático, inapetente, com prurido e dificuldade respiratória. Durante o exame clínico específico observou-se hipertrofia dos linfonodos poplíteos, esplenomegalia, além de uma discreta hipertermia. O hemograma revelou trombocitopenia e leucopenia com eosinopenia e monocitopenia. No esfregaço sanguíneo periférico foram encontradas mórulas de Ehrlichiasp. em monócitos, mórulas de Anaplasma sp. em plaquetas e inclusões intraeritrocitárias de Babesia sp. O animal foi tratado com doxiciclina e imizol, tendo seu retorno após quinze dias do início do tratamento, e ao realizar novos exames hematológicos os resultados se mostraram normais sem nenhum achado na pesquisa de hemoparasitos, o que indica o sucesso do tratamento proposto. (AU)

It was treated at the Hospital of the Veterinary University of Uberlândia a mixed breed dog with four years old, domiciled. In the interview the owner reported that the canine was lethargic, inapetente with itching and difficulty breathing. During the specific clinical examination there was hypertrophy of popliteal lymph nodes, splenomegaly, and a slight hyperthermia. The blood count revealed a thrombocytopenia, leukopenia, and with eosinopeniamonocytopenia. In peripheral blood smear was found morulae of Ehrlichia sp. into monocytes, morulaof Anaplasma sp. into platelets and inclusions intraerytrocytic Babesia sp. The animal was treated with doxycycline and imizol and hashis return after fifteen days of starting treatment, and after making new blood tests the results were normal with no finding in hemoparasite research, which indicates the success of the proposed treatment. (AU)

Serological evidence of exposure to Ehrlichia canis in cats / Evidências sorológicas da exposição de gatos a Ehrlichia canis

The aim of the present study was to estimate the occurrence of Ehrlichia canis in cats from the semiarid region of Northeast of Brazil. Sera of 101 healthy cats were submitted by Indirect Immunofluorescence Assay (IFA), and considered positive when antibody titers 40 were obtained. Seroprevalence of 35.6% (36/101) was found, with the following titers: 40 (15 animals); 160 (6); 320 (1); 640 (3), and 2,560 (11). No statistical differences were observed when comparing county of origin, gender, age, breed, and modus vivendi (pet and stray cats), and no ticks were observed in any of the cats. This study revealed exposure to E. canis in cats of the Semiarid Northeast of Brazil.

O objetivo do presente estudo foi estimar a ocorrência de Ehrlichia canis em gatos na região semiárida do Nordeste. Soros de 101 gatos saudáveis foram submetidos à Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), sendo considerados positivos títulos 40.  Soroprevalência de 35,6% (36/101) foi encontrada, com os seguintes títulos: 40 (15 animais); 160 (6); 320 (1); 640 (3) e 2560 (11). Não foram observadas diferenças estatísticas quanto ao município de origem, gênero, faixa etária, raça e modus vivendi (gatos domiciliados e errantes) e não foram observados carrapatos em qualquer um dos animais testados. Este estudo revelou exposição de gatos a E. canis na região semiárida do nordeste brasileiro.

Serological evidence of exposure to Ehrlichia canis in cats / Evidências sorológicas da exposição de gatos a Ehrlichia canis

The aim of the present study was to estimate the occurrence of Ehrlichia canis in cats from the semiarid region of Northeast of Brazil. Sera of 101 healthy cats were submitted by Indirect Immunofluorescence Assay (IFA), and considered positive when antibody titers 40 were obtained. Seroprevalence of 35.6% (36/101) was found, with the following titers: 40 (15 animals); 160 (6); 320 (1); 640 (3), and 2,560 (11). No statistical differences were observed when comparing county of origin, gender, age, breed, and modus vivendi (pet and stray cats), and no ticks were observed in any of the cats. This study revealed exposure to E. canis in cats of the Semiarid Northeast of Brazil.(AU)

O objetivo do presente estudo foi estimar a ocorrência de Ehrlichia canis em gatos na região semiárida do Nordeste. Soros de 101 gatos saudáveis foram submetidos à Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), sendo considerados positivos títulos 40.  Soroprevalência de 35,6% (36/101) foi encontrada, com os seguintes títulos: 40 (15 animais); 160 (6); 320 (1); 640 (3) e 2560 (11). Não foram observadas diferenças estatísticas quanto ao município de origem, gênero, faixa etária, raça e modus vivendi (gatos domiciliados e errantes) e não foram observados carrapatos em qualquer um dos animais testados. Este estudo revelou exposição de gatos a E. canis na região semiárida do nordeste brasileiro.(AU)

SEROLOGICAL EVIDENCE OF EXPOSURE TO Ehrlichia canis IN CATS

Abstract The aim of the present study was to estimate the occurrence of Ehrlichia canis in cats from the semiarid region of Northeast of Brazil. Sera of 101 healthy cats were submitted by Indirect Immunofluorescence Assay (IFA), and considered positive when antibody titers 40 were obtained. Seroprevalence of 35.6% (36/101) was found, with the following titers: 40 (15 animals); 160 (6); 320 (1); 640 (3), and 2,560 (11). No statistical differences were observed when comparing county of origin, gender, age, breed, and modus vivendi (pet and stray cats), and no ticks were observed in any of the cats. This study revealed exposure to E. canis in cats of the Semiarid Northeast of Brazil.

Resumo O objetivo do presente estudo foi estimar a ocorrência de Ehrlichia canis em gatos na região semiárida do Nordeste. Soros de 101 gatos saudáveis foram submetidos à Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), sendo considerados positivos títulos 40. Soroprevalência de 35,6% (36/101) foi encontrada, com os seguintes títulos: 40 (15 animais); 160 (6); 320 (1); 640 (3) e 2560 (11). Não foram observadas diferenças estatísticas quanto ao município de origem, gênero, faixa etária, raça e modus vivendi (gatos domiciliados e errantes) e não foram observados carrapatos em qualquer um dos animais testados. Este estudo revelou exposição de gatos a E. canis na região semiárida do nordeste brasileiro.

Ocorrência de infecção concomitante natural por Ehrlichia sp., Anaplasma sp. e Babesia sp. em cão assistido no Hospital Veterinário da Universidade Federal de Uberlândia / Occurrence of concomitant natural infection by Ehrlichia sp., Anaplasma sp. and Babesia sp. in a dog assisted at the Hospital of the Veterinary University of Uberlândia

Foi atendido no ambulatório do Hospital Veterinário da Universidade Federal de Uberlândia um canino sem raça definida de quatro anos de idade, domiciliado. Na anamnese o proprietário relatou que o cão estava apático, inapetente, com prurido e dificuldade respiratória. Durante o exame clínico específico observou-se hipertrofia dos linfonodos poplíteos, esplenomegalia, além de uma discreta hipertermia. O hemograma revelou trombocitopenia e leucopenia com eosinopenia e monocitopenia. No esfregaço sanguíneo periférico foram encontradas mórulas de Ehrlichiasp. em monócitos, mórulas de Anaplasma sp. em plaquetas e inclusões intraeritrocitárias de Babesia sp. O animal foi tratado com doxiciclina e imizol, tendo seu retorno após quinze dias do início do tratamento, e ao realizar novos exames hematológicos os resultados se mostraram normais sem nenhum achado na pesquisa de hemoparasitos, o que indica o sucesso do tratamento proposto.

It was treated at the Hospital of the Veterinary University of Uberlândia a mixed breed dog with four years old, domiciled. In the interview the owner reported that the canine was lethargic, inapetente with itching and difficulty breathing. During the specific clinical examination there was hypertrophy of popliteal lymph nodes, splenomegaly, and a slight hyperthermia. The blood count revealed a thrombocytopenia, leukopenia, and with eosinopeniamonocytopenia. In peripheral blood smear was found morulae of Ehrlichia sp. into monocytes, morulaof Anaplasma sp. into platelets and inclusions intraerytrocytic Babesia sp. The animal was treated with doxycycline and imizol and hashis return after fifteen days of starting treatment, and after making new blood tests the results were normal with no finding in hemoparasite research, which indicates the success of the proposed treatment.

Primeiro relato de Hepatozoon spp. em jaguatirica (Leopardus pardalis) em Mato Grosso do Sul / First report Hepatozoon spp. in ocelot (Leopardus pardalis) in Mato Grosso do Sul

A hepatozoonose é uma doença transmitida por carrapatos, causada pelo protozoário Hepatozoonspp. que acomete uma grande variedade de animais. No Brasil, existem poucos relatos da doença em jaguatiricas(Leopardus pardalis) assim como dados sobre sua epidemiologia, patogenicidade, vetores e caracterizaçãogenética. Este trabalho tem por objetivo a ocorrência de Hepatozoon spp em uma jaguatirica de vida livreatendida em um Hospital Veterinário Escola, em Mato Grosso do Sul. No hemograma, durante a pesquisa dehemoparasitas, foi observado gametócito de Hepatozoon spp. em neutrófilo e monócito. Na análise hematológicaconstatou-se anemia microcítica normocrômica e leucocitose com neutrofilia, monocitose e linfopenia

The hepatozoonosis is a tick-borne disease caused by protozoan Hepatozoon spp. affecting awide range of animals. In Brazil, there are few reports of the disease in ocelots (Leopardus pardalis) as well asdata on its epidemiology, pathogenicity, vectors and genetic characterization. This work aims the occurrence ofHepatozoon spp in a free ocelot life treated at a Veterinary School Hospital in Mato Grosso do Sul. In the CBC,when searching for hemoparasites was observed gametocyte of Hepatozoon spp. on neutrophils and monocytes.In hematological analysis it was found microcytic normochromic anemia and leukocytosis with neutrophilia,monocytosis and lymphopenia

Primeiro relato de Hepatozoon spp. em jaguatirica (Leopardus pardalis) em Mato Grosso do Sul / First report Hepatozoon spp. in ocelot (Leopardus pardalis) in Mato Grosso do Sul

A hepatozoonose é uma doença transmitida por carrapatos, causada pelo protozoário Hepatozoonspp. que acomete uma grande variedade de animais. No Brasil, existem poucos relatos da doença em jaguatiricas(Leopardus pardalis) assim como dados sobre sua epidemiologia, patogenicidade, vetores e caracterizaçãogenética. Este trabalho tem por objetivo a ocorrência de Hepatozoon spp em uma jaguatirica de vida livreatendida em um Hospital Veterinário Escola, em Mato Grosso do Sul. No hemograma, durante a pesquisa dehemoparasitas, foi observado gametócito de Hepatozoon spp. em neutrófilo e monócito. Na análise hematológicaconstatou-se anemia microcítica normocrômica e leucocitose com neutrofilia, monocitose e linfopenia(AU)

The hepatozoonosis is a tick-borne disease caused by protozoan Hepatozoon spp. affecting awide range of animals. In Brazil, there are few reports of the disease in ocelots (Leopardus pardalis) as well asdata on its epidemiology, pathogenicity, vectors and genetic characterization. This work aims the occurrence ofHepatozoon spp in a free ocelot life treated at a Veterinary School Hospital in Mato Grosso do Sul. In the CBC,when searching for hemoparasites was observed gametocyte of Hepatozoon spp. on neutrophils and monocytes.In hematological analysis it was found microcytic normochromic anemia and leukocytosis with neutrophilia,monocytosis and lymphopenia(AU)