Experimental Frog Virus 3 infection using Brazilian strain: amphibians susceptibility / Infecção experimental utilizando estirpe brasileira de Frog Virus 3: suceptibilidade de anfíbios

An alarming number of global warnings concerning amphibian mortality outbreaks have been released in recent years. Emerging diseases stand out as the main potential causes. Ranavirus is a worldwide-spread highly infectious disease capable of affecting even other ectothermic animals such as fish and reptiles. One major issue regarding this pathology is the lack of clinical signs before it leads up to death. Aiming at having a better understanding of anurans susceptibility, this study analyzed bullfrog (Lithobates catesbeianus) survival rate, when challenged with three doses of a Brazilian strain of Frog Virus 3 (FV3). The qPCR analysis indicated a low infectivity rate in these animals both as larvae and as adults. To elucidate the results, the following hypothesis was performed: 1) The amount of inoculum used on the frogs was insufficient to trigger an infection; 2) For the FV3 to produce clinical signs in this species, there is the need for a cofactor; 3) The animals did undergo FV3 infection but recovered in the course of the experiment, and 4) The inoculum utilized might have been low-virulence. Finally, the presence of actual clinical signs of ranavirus is discussed, with the more likely hypothesis.(AU)

Um número alarmante de notificações globais sobre surtos de mortalidade de anfíbios tem sido realizado nos últimos anos. As doenças emergentes destacam-se como as principais causas potenciais. O ranavírus é uma doença altamente infecciosa disseminada em todo o mundo, capaz de afetar até outros animais ectotérmicos como peixes e répteis. Uma questão importante em relação a essa patologia é a falta de sinais clínicos antes de levar à morte. Com o objetivo de compreender melhor a suscetibilidade dos anuros, o presente trabalho analisou a taxa de sobrevivência de rãs-touro (Lithobates catesbeianus), desafiadas com três doses de uma estirpe brasileira do Frog virus 3 (FV3). A análise de qPCR indicou baixa taxa de infectividade nesses animais, tanto como larvas quanto como adultos. Procurando esclarecer os resultados, foram formuladas as seguintes hipóteses: 1) A quantidade de inóculo aplicada nas rãs foi insuficiente para desencadear uma infecção; 2) Para que o FV3 dê sinais clínicos nesta espécie, é necessário um cofator; 3) Os animais sofreram infecção por FV3, mas se recuperaram no decorrer do experimento, e 4) O inóculo utilizado pode ter sido de baixa virulência. Finalmente, foi discutida a presença de sinais clínicos reais de ranavírus e levantada a hipótese mais provável(AU)

Experimental Frog Virus 3 infection using Brazilian strain: amphibians susceptibility / Infecção experimental utilizando estirpe brasileira de Frog Virus 3: suceptibilidade de anfíbios

An alarming number of global warnings concerning amphibian mortality outbreaks have been released in recent years. Emerging diseases stand out as the main potential causes. Ranavirus is a worldwide-spread highly infectious disease capable of affecting even other ectothermic animals such as fish and reptiles. One major issue regarding this pathology is the lack of clinical signs before it leads up to death. Aiming at having a better understanding of anurans susceptibility, this study analyzed bullfrog (Lithobates catesbeianus) survival rate, when challenged with three doses of a Brazilian strain of Frog Virus 3 (FV3). The qPCR analysis indicated a low infectivity rate in these animals both as larvae and as adults. To elucidate the results, the following hypothesis was performed: 1) The amount of inoculum used on the frogs was insufficient to trigger an infection; 2) For the FV3 to produce clinical signs in this species, there is the need for a cofactor; 3) The animals did undergo FV3 infection but recovered in the course of the experiment, and 4) The inoculum utilized might have been low-virulence. Finally, the presence of actual clinical signs of ranavirus is discussed, with the more likely hypothesis.(AU)

Um número alarmante de notificações globais sobre surtos de mortalidade de anfíbios tem sido realizado nos últimos anos. As doenças emergentes destacam-se como as principais causas potenciais. O ranavírus é uma doença altamente infecciosa disseminada em todo o mundo, capaz de afetar até outros animais ectotérmicos como peixes e répteis. Uma questão importante em relação a essa patologia é a falta de sinais clínicos antes de levar à morte. Com o objetivo de compreender melhor a suscetibilidade dos anuros, o presente trabalho analisou a taxa de sobrevivência de rãs-touro (Lithobates catesbeianus), desafiadas com três doses de uma estirpe brasileira do Frog virus 3 (FV3). A análise de qPCR indicou baixa taxa de infectividade nesses animais, tanto como larvas quanto como adultos. Procurando esclarecer os resultados, foram formuladas as seguintes hipóteses: 1) A quantidade de inóculo aplicada nas rãs foi insuficiente para desencadear uma infecção; 2) Para que o FV3 dê sinais clínicos nesta espécie, é necessário um cofator; 3) Os animais sofreram infecção por FV3, mas se recuperaram no decorrer do experimento, e 4) O inóculo utilizado pode ter sido de baixa virulência. Finalmente, foi discutida a presença de sinais clínicos reais de ranavírus e levantada a hipótese mais provável(AU)

Use of polyclonal antibodies, electron microscopy and histopathology to detect iridovirus-like particles in bullfrogs / Uso de anticorpos policlonais, microscopia eletrônica e histologia para detecção de partículas semelhantes ao iridovírus em rãs-touro

Iridoviruses of the Ranavirus genus have been implicated in the decline in amphibians worldwide, capable of affecting animals both in the wild and in captivity. This study aimed to detect iridovirus-like particles from three frog farms in southeastern Brazil using primary polyclonal antibodies, transmission electron microscopy (TEM) and histologic findings. The target organs were liver and kidneys. Sixty adults and sixty tadpoles of bullfrogs (Lithobates catesbeianus) were used in the study. TEM revealed the presence of iridovirus-like particles in hepatic tissue using the negative staining technique. Positive results were also observed by immunoelectron microscopy and immunocytochemistry (ICC). The histological analysis of the samples showed liver hemorrhage and corpuscles inclusion in hepatocytes as well as glomerulotubular degeneration and necrosis in the kidneys. The methods used in this study were highly efficient to detect the presence of iridovirus-like particles and possible infection of ranavirus.(AU)

Os iridovirus do gênero Ranavirus têm sido implicados no declínio dos anfíbios em todo o mundo afetando animais de vida livre e aqueles em cativeiro. O objetivo deste estudo foi detectar a presença de partículas semelhantes ao iridovírus em três ranários na região sudeste do Brasil, utilizando anticorpos policlonais primários, microscopia eletrônica de transmissão (MET) e achados histológicos. Os órgãos alvo foram o fígado e os rins. Sessenta rãs-touro adultas (Lithobates catesbeianus) e sessenta girinos da mesma espécie foram usados para o estudo. A MET revelou a presença de partículas semelhantes ao iridovírus em tecido hepático utilizando a técnica de contrastação negativa. Os resultados positivos foram também observados por imunomicroscopia eletrônica e imunocitoquímica. As análises histológicas nas mesmas amostras evidenciaram hemorragia no fígado e corpúsculos de inclusão em hepatócitos, e degeneração glomerulotubular e necrose nos rins. Os métodos usados neste estudo foram altamente eficientes na detecção de partículas semelhantes ao iridovírus e possivel infecção por ranavirus.(AU)

Use of polyclonal antibodies, electron microscopy and histopathology to detect iridovirus-like particles in bullfrogs / Uso de anticorpos policlonais, microscopia eletrônica e histologia para detecção de partículas semelhantes ao iridovírus em rãs-touro

Iridoviruses of the Ranavirus genus have been implicated in the decline in amphibians worldwide, capable of affecting animals both in the wild and in captivity. This study aimed to detect iridovirus-like particles from three frog farms in southeastern Brazil using primary polyclonal antibodies, transmission electron microscopy (TEM) and histologic findings. The target organs were liver and kidneys. Sixty adults and sixty tadpoles of bullfrogs (Lithobates catesbeianus) were used in the study. TEM revealed the presence of iridovirus-like particles in hepatic tissue using the negative staining technique. Positive results were also observed by immunoelectron microscopy and immunocytochemistry (ICC). The histological analysis of the samples showed liver hemorrhage and corpuscles inclusion in hepatocytes as well as glomerulotubular degeneration and necrosis in the kidneys. The methods used in this study were highly efficient to detect the presence of iridovirus-like particles and possible infection of ranavirus.

Os iridovirus do gênero Ranavirus têm sido implicados no declínio dos anfíbios em todo o mundo afetando animais de vida livre e aqueles em cativeiro. O objetivo deste estudo foi detectar a presença de partículas semelhantes ao iridovírus em três ranários na região sudeste do Brasil, utilizando anticorpos policlonais primários, microscopia eletrônica de transmissão (MET) e achados histológicos. Os órgãos alvo foram o fígado e os rins. Sessenta rãs-touro adultas (Lithobates catesbeianus) e sessenta girinos da mesma espécie foram usados para o estudo. A MET revelou a presença de partículas semelhantes ao iridovírus em tecido hepático utilizando a técnica de contrastação negativa. Os resultados positivos foram também observados por imunomicroscopia eletrônica e imunocitoquímica. As análises histológicas nas mesmas amostras evidenciaram hemorragia no fígado e corpúsculos de inclusão em hepatócitos, e degeneração glomerulotubular e necrose nos rins. Os métodos usados neste estudo foram altamente eficientes na detecção de partículas semelhantes ao iridovírus e possivel infecção por ranavirus.

Detecção molecular de Ranavirus em espécies de anfíbios anuros selvagens da região centro-leste do estado de São Paulo

O objetivo do trabalho foi realizar investigação sobre ocorrência de ranavirose, infecção causada por vírus do gênero Ranavirus, família Iridoviridiae, em anfíbios anuros silvestres nos municípios de Porto Ferreira e Pirassununga, cidades da região centro-leste do estado de São Paulo, Brasil, utilizando diagnóstico molecular. Ao todo, 40 anuros adultos silvestres da espécie Leptodactylus fuscus foram capturados nos municípios citados, sendo coletados três órgãos alvos (fígado, baço e rins) de replicação viral, com registro de eventuais alterações macroscópicas nesses órgãos, e dos quais extraiu-se DNA. Na sequencia, fez-se a reação em cadeia pela polimerase (PCR), utilizando-se primers específicos para o gene MCP (major capsid protein) de Frog Virus 3 (FV3), ranavírus circulante no Brasil, com isolado de FV3 pertencente ao biobanco do Laboratório de Higiene Zootécnica da FZEA-USP empregado como controle positivo e água livre de nuclease como controle negativo. Como resultados, em relação às alterações macroscópicas, somente um espécime apresentou hepatoesplenomegalia e hipopigmentação do coração. No entanto, ao diagnóstico molecular, nenhum dos 40 animais amostrados foi positivo à ranavirose. Tal resultado pode estar associado tanto a fatores intrínsecos (espécie, idade, resposta imune) como extrínsecos ao hospedeiro (alterações ambientais, patogenicidade viral). Em paralelo, em rãs de criação comercial, surtos por FV3 já foram detectados em vários ranários do país; contudo, essa é a primeira vez que uma prospecção para ranavirose é realizada especificamente com representantes da espécie Leptodactylus fuscus, em municípios da região centro-leste do estado de São Paulo. Assim, são necessárias mais pesquisas com espécies silvestres de rãs, particularmente no entorno de ranários com histórico de animais positivos para FV3, para melhor conhecimento da epidemiologia e dinâmica de transmissão da ranavirose entre rãs silvestres.

The objective of this study was to investigate the occurrence of ranavirus infection caused by virus belonging to genus Ranavirus, Iridoviridiae family, in wild anuran amphibians from Porto Ferreira and Pirassununga municipalities, located in the central-eastern region of the state of São Paulo, Brazil, using molecular diagnostics. In all, 40 wild adult anurans of the species Leptodactylus fuscus were captured in the mentioned municipalities, and three target organs (liver, spleen and kidneys) of the viral replication were collected, being possible macroscopic changes in these organs recorded, and from which DNA was extracted. In the sequence, the polymerase chain reaction (PCR) was carried out using primers specific for the MCP (major capsid protein) gene of Frog Virus 3 (FV3), a circulating ranavirus in Brazil, with a FV3 isolate belonging to the biobank of the Laboratory of Zootechnical Hygiene of FZEA-USP employed as positive control and nuclease-free water as negative control. As a result, in relation to macroscopic alterations, only one specimen showed hepatosplenomegaly and heart hypopigmentation. However, for molecular diagnostics, none of the 40 animals sampled were positive for ranavirus. This result may be associated to both intrinsic (species, age, immune response) and extrinsic (environmental changes, viral pathogenicity) factors to the host. In parallel, FV3 outbreaks have already been detected in several frog farms in the country. However, this is the first time that a prospection for ranavirus infection is performed specifically with specimens of the Leptodactylus fuscus from municipalities in the central-eastern region of the state of São Paulo. Thus, more studies on wild-type frogs are needed, particularly in the settings of frog farms with positive animal history for FV3, to better understand the epidemiology and dynamics of ranavirus transmission among wild frogs.

Isolamento e caracterização de estirpe de Frog Virus 3-símile detectada em rãs-touro gigante (Lithobates catesbeianus) no Estado de São Paulo

A aquicultura é apontada como um mercado estratégico para o desenvolvimento sustentável, produção de alimentos e ampliação de fronteiras inexploradas no Brasil. No entanto, como outros sistemas de produção animal, este setor enfrenta problemas com doenças resultantes de sua intensificação, como os aspectos sanitários da produção e a falta de estrutura para o diagnóstico das principais enfermidades infecciosas. Durante os últimos 20 anos, os vírus da família Iridoviridae, em especial membros do gênero Ranavirus, têm sido responsáveis por epizootias de grande impacto ecológico e econômico, envolvendo um grande número de espécies de peixes, anfíbios e répteis de importância na aquicultura de várias partes do mundo. No entanto, as informações sobre a ocorrência de infecções de peixes e anfíbios causadas por ranavírus no Brasil são limitadas. O presente projeto compreendeu o isolamento em cultivo celular de estirpe de Frog Virus 3-símile, no Estado de São Paulo, confirmada por sequenciamento nucleotídico do gene MCP e subsequente RFLP, assim como caracterização fenotípica e de cinética de replicação do isolado. Amostras de fígado, baço e rins de rãs-touro gigante provenientes de ranário comercial, positivas ao diagnóstico molecular para Ranavirus, foram utilizadas para isolamento viral em cultivo celular. Efeito citopático foi detectado na segunda passagem em células BF-2 e posterior confirmação do isolamento foi feita por PCR e RFLP. A caracterização fenotípica viral foi feita com microscopia eletrônica de transmissão, a qual permitiu a confirmação de morfologia semelhante às partículas de Ranavirus, além da realização de curva de replicação, indicando maiores títulos virais no quarto dia após inoculação. Também foi feito teste de susceptibilidade a solventes, que confirmou a presença de partículas envelopadas. Os resultados obtidos nesse estudo poderão contribuir para a futura compreensão da biologia dos iridovírus circulantes como agentes etiológicos de ranaviroses em anfíbios no Estado de São Paulo.

Aquaculture is appointed as a strategic market for sustainable development, food production and expansion of unexplored frontiers in Brazil. However, just like other animal production systems, this area faces problems due its intensification, like the production sanitation aspects and the lack of structure for the diagnosis of major infectious diseases. During the last 20 years, viruses from Iridoviridae family, especially Ranavirus genera, have been responsible for major economic and ecological impactant epizootic diseases in a great number of fish, amphibian and reptile species in many parts of the world. However, information on the occurrence of infections in fishes and amphibians caused by ranavirus in Brazil are limited. In this context, this project aimed to isolate a Frog Virus 3-like strain detected in São Paulo state in cell culture, which was later confirmed by nucleotide sequencing of MCP gene and further RLFP technique and also phenotipical characterization and replication kinetics of the obtained strain. Liver, spleen and kidney samples from american bullfrogs from commercial frog ponds, positive by molecular diagnostic for Ranavirus, were used for viral isolation in cell culture. Citopathic effect was detected during the second passage in cells and later confirmed by PCR and RFLP. The viral characterization was carried out with transmission electronic microscopy, which confirmed similar morphology of viral particles to those of Ranavirus, besides the construction of a growth curve which indicated larger titres on the fourth day post inoculation. A test for solvent sensitivity was also performed and confirmed the presence of enveloped particles. The results obtained in this study will contribute to the understanding of the biology of the circulating iridovirus in São Paulo state as an etiological agent of ranavirus infection in amphibians.