Detection and genetic identification of pestiviruses in Brazilian lots of fetal bovine serum collected from 2006 to 2014 / Detecção e identificação genética de pestivírus em lotes brasileiros de soro fetal bovino coletado de 2006 a 2014

The present study performed a genetic identification of pestiviruses contaminating batches of fetal bovine serum (FBS) produced in Brazil from 2006 to 2014. Seventy-three FBS lots were screened by a RT-PCR targeting the 5'untranslated region (UTR) of the pestivirus genome. Thirty-nine lots (53.4%) were positive for pestivirus RNA and one contained infectious virus. Nucleotide sequencing and phylogenetic analysis of the 5'UTR revealed 34 lots (46.6%) containing RNA of bovine viral diarrhea virus type 1 (BVDV-1), being 23 BVDV-1a (5' UTR identity 90.8-98.7%), eight BVDV-1b (93.9-96.7%) and three BVDV-1d (96.2- 97.6%). Six lots (8.2%) contained BVDV-2 (90.3-100% UTR identity) being two BVDV-2a; three BVDV-2b and one undetermined. Four FBS batches (5.5%) were found contaminated with HoBi-like virus (98.3 to 100%). Five batches (6.8%) contained more than one pestivirus. The high frequency of contamination of FBS with pestivirus RNA reinforce the need for systematic and updated guidelines for monitoring this product to reduce the risk of contamination of biologicals and introduction of contaminating agents into free areas.(AU)

No presente estudo foi realizada a identificação genética de pestivírus contaminantes de lotes de soro fetal bovino (SFB) produzidos no Brasil de 2006 a 2014. Setenta e três lotes de SFB foram testados por RT-PCR para a região 5' não traduzida do genoma dos pestivírus. Trinta e nove lotes (53,4%) foram positivos para RNA de pestivírus e um continha vírus infeccioso. O sequenciamento de nucleotídeos e análise filogenética da região 5'UTR revelou que 34 lotes (46,6%) continham RNA do vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (BVDV-1), sendo 23 BVDV-1a (identidade na 5' UTR de 90,8-98,7%), oito BVDV-1b (93,9 a 96,7%) e três BVDV-1d (96,2%-97,6%). Seis lotes (8,2%) continham BVDV-2 (90,3 a 100% de identidade), sendo dois BVDV-2a, três BVDV-2b e um de subgenótipo indeterminado. Quatro lotes de SFB (5,5%) estavam contaminados com o vírus HoBi-like (98,3 a 100%). Cinco lotes (6,8%) continham mais do que um pestivírus. A alta frequência de contaminação de SFB com RNA de pestivírus reforça a necessidade para diretrizes sistemáticas atualizadas para a monitoração deste produto com a finalidade de reduzir a contaminação de produtos biológicos e a introdução de agentes contaminantes em áreas livres.(AU)

Detection and genetic identification of pestiviruses in Brazilian lots of fetal bovine serum collected from 2006 to 2014 / Detecção e identificação genética de pestivírus em lotes brasileiros de soro fetal bovino coletado de 2006 a 2014

The present study performed a genetic identification of pestiviruses contaminating batches of fetal bovine serum (FBS) produced in Brazil from 2006 to 2014. Seventy-three FBS lots were screened by a RT-PCR targeting the 5'untranslated region (UTR) of the pestivirus genome. Thirty-nine lots (53.4%) were positive for pestivirus RNA and one contained infectious virus. Nucleotide sequencing and phylogenetic analysis of the 5'UTR revealed 34 lots (46.6%) containing RNA of bovine viral diarrhea virus type 1 (BVDV-1), being 23 BVDV-1a (5' UTR identity 90.8-98.7%), eight BVDV-1b (93.9-96.7%) and three BVDV-1d (96.2- 97.6%). Six lots (8.2%) contained BVDV-2 (90.3-100% UTR identity) being two BVDV-2a; three BVDV-2b and one undetermined. Four FBS batches (5.5%) were found contaminated with HoBi-like virus (98.3 to 100%). Five batches (6.8%) contained more than one pestivirus. The high frequency of contamination of FBS with pestivirus RNA reinforce the need for systematic and updated guidelines for monitoring this product to reduce the risk of contamination of biologicals and introduction of contaminating agents into free areas.(AU)

No presente estudo foi realizada a identificação genética de pestivírus contaminantes de lotes de soro fetal bovino (SFB) produzidos no Brasil de 2006 a 2014. Setenta e três lotes de SFB foram testados por RT-PCR para a região 5' não traduzida do genoma dos pestivírus. Trinta e nove lotes (53,4%) foram positivos para RNA de pestivírus e um continha vírus infeccioso. O sequenciamento de nucleotídeos e análise filogenética da região 5'UTR revelou que 34 lotes (46,6%) continham RNA do vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (BVDV-1), sendo 23 BVDV-1a (identidade na 5' UTR de 90,8-98,7%), oito BVDV-1b (93,9 a 96,7%) e três BVDV-1d (96,2%-97,6%). Seis lotes (8,2%) continham BVDV-2 (90,3 a 100% de identidade), sendo dois BVDV-2a, três BVDV-2b e um de subgenótipo indeterminado. Quatro lotes de SFB (5,5%) estavam contaminados com o vírus HoBi-like (98,3 a 100%). Cinco lotes (6,8%) continham mais do que um pestivírus. A alta frequência de contaminação de SFB com RNA de pestivírus reforça a necessidade para diretrizes sistemáticas atualizadas para a monitoração deste produto com a finalidade de reduzir a contaminação de produtos biológicos e a introdução de agentes contaminantes em áreas livres.(AU)

Influência dos meios de estocagem durante o transporte de ovários bovinos a 4c sobre a recuperação e qualidade oocitária / Influence of storage media during transport of bovine ovaries at 4°c on oocyte recovery and quality

O objetivo foi avaliar diferentes meios na presença e ausência de soro fetal bovino (SFB; 10%) durante o transporte por 24 h de ovários a 4°C sobre a recuperação e a qualidade oocitária bovina. Cinco experimentos foram realizados comparando: (E1) NaCl vs. NaCl+SFB vs. controle (não resfriado), (E2) PBS vs. PBS+SFB vs. controle, (E3) DMEM vs. DMEM+SFB vs. controle, (E4) DPBS vs. DPBS+SFB vs. controle e (E5) melhores resultados dos experimentos anteriores. Após a aspiração folicular, oócitos foram avaliados quanto à qualidade por critérios morfológicos e ensaio de azul cresil brilhante. Ainda, células dos cumulus de oócitos viáveis foram avaliadas quanto à viabilidade pelo azul de tripan. No E1, NaCl permitiu uma maior taxa de recuperação em relação ao NaCl+SFB (46,0% vs. 39,6%), enquanto que os demais parâmetros não foram alterados. Já no E2, o SFB em PBS influenciou positivamente a taxa de recuperação (41,2% vs. 32,8%) e a viabilidade celular (46,3% vs. 41,7%), quando comparado ao PBS. No E3, o SFB em DMEM teve uma influência negativa sobre a taxa de recuperação (39,9% vs. 40,7%) e avaliação morfológica (59,0% vs. 73,1%). Contudo, a adição de SFB ao DMEM se mostrou benéfica à viabilidade celular (42,0% vs. 34,5%). Em relação ao E4, a presença de SFB em DPBS influenciou positivamente a viabilidade celular (50,7% vs. 47,0%). Já no E5, comparando os melhores grupos [NaCl, PBS+SFB, DMEM, DPBS+SFB], a viabilidade celular mostrou uma maior porcentagem em DMEM (54,0%) e DPBS (54,5%), quando comparada a NaCl (48,3%) e PBS (50,1%). Em conclusão, a presença do SFB em meios com alta capacidade de tamponamento (PBS e DPBS) pode se mostrar benéfica. Contudo, DMEM e DPBS resultam num ambiente mais propício para o resfriamento de ovários bovinos.

The aim was to evaluate different media in the presence and absence of fetal bovine serum (FBS; 10%) during 24 h transport of ovaries at 4°C on bovine oocyte recovery and quality. Five experiments were performed comparing: (E1) NaCl vs. NaCl+FBS vs. control (not cold), (E2) PBS vs. PBS+FBS vs. control, (E3) DMEM vs. DMEM+FBS vs. control, (E4) DPBS vs. DPBS+FBS vs. control and (E5) better results from previous experiments. After follicular aspiration, oocytes were evaluated for quality by morphological criteria and brilliant cresyl blue assay. Also, cumulus cells of viable oocytes were evaluated for viability by trypan blue. In E1, NaCl allowed a higher rate of recovery compared to NaCl+FBS (46.0% vs. 39.6%), while the other parameters were not altered. Already in E2, FBS in PBS positively influenced recovery rate (41.2% vs. 32.8%) and cell viability (46.3% vs. 41.7%) when compared to PBS. In E3, FBS in DMEM had a negative influence on the recovery rate (39.9% vs. 40.7%) and morphological evaluation (59.0% vs. 73.1%). Nevertheless, the addition of SFB to DMEM was shown to be beneficial to cell viability (42.0% vs. 34.5%). Regarding E4, the presence of FBS in DPBS positively influenced cell viability (50.7% vs. 47.0%). Already in E5, comparing the best groups (NaCl, PBS+FBS, DMEM, DPBS+FBS), cell viability showed a higher percentage in DMEM (54.0%) and DPBS (54.5%) when compared to NaCl (48.3%) and PBS (50.1%). In conclusion, the presence of FBS in media with high buffering capacity (PBS and DPBS) may show to be beneficial. Nevertheless, DMEM and DPBS result in an environment more favorable to the cooling of bovine ovaries.

Influência dos meios de estocagem durante o transporte de ovários bovinos a 4c sobre a recuperação e qualidade oocitária / Influence of storage media during transport of bovine ovaries at 4°c on oocyte recovery and quality

O objetivo foi avaliar diferentes meios na presença e ausência de soro fetal bovino (SFB; 10%) durante o transporte por 24 h de ovários a 4°C sobre a recuperação e a qualidade oocitária bovina. Cinco experimentos foram realizados comparando: (E1) NaCl vs. NaCl+SFB vs. controle (não resfriado), (E2) PBS vs. PBS+SFB vs. controle, (E3) DMEM vs. DMEM+SFB vs. controle, (E4) DPBS vs. DPBS+SFB vs. controle e (E5) melhores resultados dos experimentos anteriores. Após a aspiração folicular, oócitos foram avaliados quanto à qualidade por critérios morfológicos e ensaio de azul cresil brilhante. Ainda, células dos cumulus de oócitos viáveis foram avaliadas quanto à viabilidade pelo azul de tripan. No E1, NaCl permitiu uma maior taxa de recuperação em relação ao NaCl+SFB (46,0% vs. 39,6%), enquanto que os demais parâmetros não foram alterados. Já no E2, o SFB em PBS influenciou positivamente a taxa de recuperação (41,2% vs. 32,8%) e a viabilidade celular (46,3% vs. 41,7%), quando comparado ao PBS. No E3, o SFB em DMEM teve uma influência negativa sobre a taxa de recuperação (39,9% vs. 40,7%) e avaliação morfológica (59,0% vs. 73,1%). Contudo, a adição de SFB ao DMEM se mostrou benéfica à viabilidade celular (42,0% vs. 34,5%). Em relação ao E4, a presença de SFB em DPBS influenciou positivamente a viabilidade celular (50,7% vs. 47,0%). Já no E5, comparando os melhores grupos [NaCl, PBS+SFB, DMEM, DPBS+SFB], a viabilidade celular mostrou uma maior porcentagem em DMEM (54,0%) e DPBS (54,5%), quando comparada a NaCl (48,3%) e PBS (50,1%). Em conclusão, a presença do SFB em meios com alta capacidade de tamponamento (PBS e DPBS) pode se mostrar benéfica. Contudo, DMEM e DPBS resultam num ambiente mais propício para o resfriamento de ovários bovinos.(AU)

The aim was to evaluate different media in the presence and absence of fetal bovine serum (FBS; 10%) during 24 h transport of ovaries at 4°C on bovine oocyte recovery and quality. Five experiments were performed comparing: (E1) NaCl vs. NaCl+FBS vs. control (not cold), (E2) PBS vs. PBS+FBS vs. control, (E3) DMEM vs. DMEM+FBS vs. control, (E4) DPBS vs. DPBS+FBS vs. control and (E5) better results from previous experiments. After follicular aspiration, oocytes were evaluated for quality by morphological criteria and brilliant cresyl blue assay. Also, cumulus cells of viable oocytes were evaluated for viability by trypan blue. In E1, NaCl allowed a higher rate of recovery compared to NaCl+FBS (46.0% vs. 39.6%), while the other parameters were not altered. Already in E2, FBS in PBS positively influenced recovery rate (41.2% vs. 32.8%) and cell viability (46.3% vs. 41.7%) when compared to PBS. In E3, FBS in DMEM had a negative influence on the recovery rate (39.9% vs. 40.7%) and morphological evaluation (59.0% vs. 73.1%). Nevertheless, the addition of SFB to DMEM was shown to be beneficial to cell viability (42.0% vs. 34.5%). Regarding E4, the presence of FBS in DPBS positively influenced cell viability (50.7% vs. 47.0%). Already in E5, comparing the best groups (NaCl, PBS+FBS, DMEM, DPBS+FBS), cell viability showed a higher percentage in DMEM (54.0%) and DPBS (54.5%) when compared to NaCl (48.3%) and PBS (50.1%). In conclusion, the presence of FBS in media with high buffering capacity (PBS and DPBS) may show to be beneficial. Nevertheless, DMEM and DPBS result in an environment more favorable to the cooling of bovine ovaries.(AU)

UTILIZAÇÃO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

Um dos aspectos relevantes a se considerar para o sucesso durante a produção in vitro (PIV) de embriões é a constituição dos meios que compõem as etapas da biotecnologia reprodutiva. Os meios precisam suprir as necessidades metabólicas tanto dos gametas, durante a maturação oocitária e capacitação espermática, quanto do embrião durante as primeiras divisões celulares. A maior parte dos protocolos de PIV utiliza algum soro sanguíneo na composição dos meios como fonte de hormônios, proteínas, fatores de crescimento e nutrientes. Por outro lado, o soro contém citocinas, vitaminas e muitas outras substâncias que podem afetar a maturação, a fertilização e o desenvolvimento embrionário. Diversos trabalhos vêm reportando a utilização de Plasma Rico em Plaquetas (PRP) como alternativa para utilização de soros fetais durante o cultivo de células, principalmente de células tronco. Outros estudos demonstraram que o PRP está repleto de fatores de crescimento, como FGF, TGF, PDGF, IGF e EGF, bem como fatores de ligação como fibrinogênio e serotonina, vitais para a cultura celular e foliculogênese. Portanto, este trabalho tem por objetivo avaliar a utilização de PRP em substituição ao soro fetal bovino (SFB) durante a maturação de oócitos utilizados na produção in vitro de embriões bovinos. Os complexos cúmulos-oócitos (CCOs) foram distribuídos nos seguintes grupos experimentais durante a maturação in vitro (MIV): Grupo G1 (Meio de MIV com adição de 5% de PRP); Grupo G2 (Meio de MIV com adição de 5% de PRP mais 5% de SFB); Grupo G3 (Meio de MIV com adição de 5% de SFB); e grupo G4 (Meio de MIV sem adição de PRP e/ou SFB); . Após 20 horas de maturação, os CCOs foram passados para a placa de fecundação contendo o meio TALP FERT livre de soros. Aproximadamente 24 horas após a fertilização, os prováveis zigotos foram transferidos para gotas com meio SOF (Synthetic fluid oviduct) contendo 10% de SFB. foram avaliadas as taxas de clivagem e formação de blastocistos nos dias 2 e 7, do desenvolvimento embrionário, respectivamente. Também foi avaliada a qualidade dos CCOs maturados a partir da análise de expressão gênica de alguns marcadores genéticos. Os resultados demonstraram que não houveram diferenças significativas em relação aos grupos experimentais no tocante a taxas de produção de embriões (tanto nas primeiras clivagens quanto na formação de blastocistos) evidenciando que o PRP pode se tornar uma alternativa mais barata na PIVE em comparação ao SFB.

One of the relevant aspects to be considered for success during the in vitro production (IVP) of embryos is the constitution of the means that make up the stages of reproductive biotechnology. The media must meet the metabolic needs of both gametes, during oocyte maturation and sperm formation, and of the embryo during the first cell divisions. Most IVP protocols use some blood serum in the composition of the media as a source of hormones, proteins, growth factors, and nutrients. On the other hand, the serum contains cytokines, vitamins and many other substances that can affect maturation, fertilization, and embryonic development. Several studies have reported the use of Platelet Rich Plasma (PRP) as an alternative to the use of fetal sera during cell culture, mainly stem cells. Other studies have shown that PRP is full of growth factors, such as FGF, TGF, PDGF, IGF, and EGF, as well as binding factors such as fibrinogen and serotonin, which are vital for cell culture and folliculogenesis. Therefore, this work aims to evaluate the use of PRP to replace fetal bovine serum (SFB) during the maturation of oocytes used in the in vitro production of bovine embryos. Cumulus-oocyte complexes (CCOs) were distributed in the following experimental groups during in vitro maturation (IVM): Group G1 (IVM medium with addition of 5% PRP); Group G2 (MIV medium with addition of 5% PRP plus 5% SFB); Group G3 (MIV medium with addition of 5% SFB); and group G4 (MIV medium without addition of PRP and/or SFB). After 20 hours of maturation, the CCOs were passed to the fertilization plate containing the serum-free TALP FERT medium. Approximately 24 hours after fertilization, the probable zygotes were transferred to drops with SOF (Synthetic fluid oviduct) medium containing 10% SFB. the rates of cleavage and blastocyst formation were evaluated on days 2 and 7, of embryonic development, respectively. The quality of matured CCOs was also evaluated from the analysis of gene expression of some genetic markers. The results demonstrated that there were no significant differences in relation to the experimental groups regarding embryo production rates (both in the first cleavages and in the formation of blastocysts), showing that PRP can become a cheaper alternative in PIVE compared to SFB

Supplementation of fetal bovine serum alters histone modification H3R26me2 during preimplantation development of in vitro produced bovine embryos / Suplementação com soro fetal bovino altera a modificação de histona H3R26me2 durante o período pré-implantacional em embriões bovinos produzidos in vitro

In vitro production (IVP) of bovine embryos is not only of great economic importance to the cattle industry, but is also an important model for studying embryo development. The aim of this study was to evaluate the histone modification, H3R26me2 during pre-implantation development of IVP bovine embryos cultured with or without serum supplementation and how these in vitro treatments compared to in vivo embryos at the morula stage. After in vitro maturation and fertilization, bovine embryos were cultured with either 0 or 2.5% fetal bovine serum (FBS). Development was evaluated and embryos were collected and fixed at different stages during development (2-, 4-, 8-, 16-cell, morula and blastocyst). Fixed embryos were then used for immunofluorescence utilizing an antibody for H3R26me2. Images of stained embryos were analyzed as a percentage of total DNA. Embryos cultured with 2.5% FBS developed to blastocysts at a greater rate than 0%FBS groups (34.85±5.43% vs. 23.38±2.93%; P<0.05). Levels of H3R26me2 changed for both groups over development. In the 0%FBS group, the greatest amount of H3R26me2 staining was at the 4-cell (P<0.05), 16-cell (P<0.05) and morula (P<0.05) stages. In the 2.5%FBS group, only 4-cell stage embryos were significantly higher than all other stages (P<0.01). Morula stage in vivo embryos had similar levels as the 0%FBS group, and both were significantly higher than the 2.5%FBS group. These results suggest that the histone modification H3R26me2 is regulated during development of pre-implantation bovine embryos, and that culture conditions greatly alter this regulation.(AU)

A produção in vitro (PIV) de embriões de bovinos não é apenas de grande importância econômica para a pecuária, mas é também um importante modelo para estudar o desenvolvimento embrionário. O objetivo deste estudo foi avaliar a modificação de histona, H3R26me2 durante o desenvolvimento pré-implantacional em embriões bovinos produzidos in vitro, cultivados com ou sem suplementação de soro fetal bovino (SFB), bem como comparar essa modificação específica entre mórulas produzidas in vitro e in vivo. Após a maturação in vitro e fertilização, embriões foram cultivados com suplementação de 0 ou 2,5% SFB. O desenvolvimento embrionário foi avaliado e embriões foram coletados e fixados em diferentes fases durante o desenvolvimento (2, 4, 8 e 16 células, mórula e blastocisto). Os embriões fixados foram avaliados por imunofluorescência utilizando um anticorpo para H3R26me2. Imagens de embriões corados foram analisadas baseadas na porcentagem do DNA total. Embriões cultivados com 2,5% SFB tiveram uma taxa de desenvolvimento ao estágio de blastocisto maior que o grupo que não recebeu suplementação com SFB (34.85±5,43% vs 23.38±,93%; P<0,05). Níveis de H3R26me2 variaram para ambos os grupos ao longo do desenvolvimento. No grupo 0% SFB, a marcação para H3R26me2 foi mais intensa nos estágios de 4 células (P<0,05), 16 células (P<0,05) e mórula (P<0.05). No grupo 2.5% SFB, apenas os embriões de 4 células tiveram marcação significativamente maior que todas as outras fases (P<0,01). Mórulas produzidas in vivo apresentaram níveis de H3R26me2 semelhantes ao grupo 0% SFB, e ambos foram significativamente maiores que o grupo 2.5% SFB. Estes resultados sugerem que a modificação de histona H3R26me2 é regulada durante o desenvolvimento pré-implantacional de embriões bovinos, e que as condições de cultura alteram de maneira importante esta regulação.(AU)

Efeitos da redução ou substituição do soro fetal bovino por outros compostos na maturação in vitro de oócitos bovinos / Effects of reduction or replacement of fetal calf serum by other compounds during in vitro maturation of bovine oocytes

A utilização do soro fetal bovino (SFB), embora bastante disseminada na produção in vitro (PIV) de embriões bovinos, apresenta limitações por ser um meio indefinido e por causar efeitos que prejudicam a qualidade desses embriões. Por esse motivo, nos últimos anos, grande parte das pesquisas relacionadas à PIV está voltada para a substituição do SFB por outros compostos nos meios de cultura. No presente estudo, foram utilizados como compostos protéicos a albumina sérica bovina livre de ácidos graxos (BSA-FAF) e um produto comercial denominado fluido embriônico (FE) de maneira isolada ou em diferentes combinações e concentrações, com objetivo de substituir ou diminuir a concentração do SFB durante a maturação in vitro (MIV). [...] Ademais, o G3 também apresentou diminuição na taxa de maturação nuclear quando comparado ao G4. Quanto à maturação citoplasmática, nos grupos G2, G7, G6 e G3, houve redução (p<0,05) das taxas para 43,9por cento, 43,2 por cento, 43,1 por cento e 36,5 por cento, respectivamente, quando comparadas ao meio controle (G1), que permitiu a obtenção de valores médios de 62,4 por cento. Por outro lado, nos grupos G8, G4 e G5, a taxa de maturação citoplasmática não foi afetada com a redução do SFB, onde 59,3 por cento, 51,3 por cento e 50,8 por cento dos oócitos apresentaram os GC dispostos na periferia, respectivamente. Os resultados obtidos pelo teste de contrastes ortogonais complementam os obtidos na avaliação da maturação nuclear e migração de grânulos corticais, mostrando a necessidade do SFB durante a MIV, mesmo que em baixas concentrações, e a possibilidade de diminuir a sua concentração associando-o a BSA-FAF e/ou FE. Dessa forma, conclui-se que é possível reduzir a concentração de SFB no meio de MIV para até 3,5% sem prejuízo significativo aos índices de maturação nuclear e citoplasmática.(AU)

The use of fetal calf serum (FCS), although widely employed during in vitro production (IVP) of bovine embryos, has limitations. FCS is an undefined media and may have harmful effects on the quality of embryos. For this reason, in recent years, research efforts aimed at improving IVP of bovine embryos, have focused at the replacement of FCS by alternative compounds in culture media. In this study, fatty acid free bovine serum albumin (BSA-FAF) and embryonic fluid (EF) were used separately or in combination, in different concentrations, to replace or reduce the concentration of FCS during in vitro maturation (IVM). [...] Moreover, G3 also showed inferior nuclear maturation rate when compared to G4. Regarding cytoplasmic maturation, the rates were reduced to 43.9 percent, 43.2 percent, 43.1 percent and 36.5 percent in G2, G7, G6 and G3 groups, respectively, compared to the control group (G1; 62.4 percent). On the other hand, in the groups G8, G4 and G5, maturation rates were not affected by reduction of FCS, where 59.3 percent, 51.3 percent and 50.8 percent of the oocytes displayed CG arranged peripherally, respectively. The results obtained by the orthogonal contrast test are in accordance with the ones from the evaluation of the nuclear maturation and cortical granules migration. These data show the need of FCS on the MIV, even in low concentrations, and the possibility of decrease its concentration by associating it with BSA-FAF and/or EF. Therefore, we concluded that it is possible to reduce the concentration of FCS in IVM medium to a concentration of 3.5 percent without affecting nuclear and cytoplasmic maturation rates.(AU)

Detecção e identificação genética de pestivírus de bovinos

O gênero Pestivirus, pertencente à família Flaviviridae, compreende três espécies virais que infectam bovinos: vírus da diarreia viral bovina 1 (BVDV-1)/Pestivirus A, BVDV-2/ Pestivirus B e pestivirus HoBi-like (HoBiPeV)/Pestivirus H. As duas espécies de BVDV e o HoBiPeV assim como genótipos/subgenótipos - são identificados com base na comparação da região 5 não-traduzida do genoma (5UTR), que ainda permite agrupar os isolados nos 21 subgenótipos de BVDV-1 (-1a a -1u), quatro subgenótipos de BVDV-2 (-2a a -2d) e quatro do HoBiPeV (-3a a -3d). A região 5UTR também é utilizada para a detecção molecular de pestivírus em amostras clínicas, pois é muito conservada. Em um primeiro estudo, descreve-se a detecção e identificação genética de pestivírus de 73 lotes de soro fetal bovino (SFB) de origem brasileira, produzidos entre os anos de 2006 e 2014. Trinta e nove lotes de SFB (53,4%) foram positivos na RT-PCR para pestivírus. Trinta e quatro lotes (46,6%) continham RNA do BVDV-1, sendo 23 -1a, oito -1b e três -1d. Seis lotes (8,2%) continham BVDV-2, sendo dois -2a, três -2b e um de subgenótipo indeterminado. Quatro lotes de SFB (5,5%) estavam contaminados com o vírus HoBiPeV e cinco lotes (6,8%) continham mais de um pestivírus. Estes resultados demonstram a contaminação de SFB de origem brasileira com RNA de pestivírus. O segundo estudo, relata a caracterização de 90 pestivírus obtidos de amostras de soro de bovinos no estado do Rio Grande do Sul, destinados à exportação no de 2017, sendo 38 BVDV-1 (42,2%), 31 BVDV-2 (34,4%) e 21 HoBiPeV (23,4%). Das amostras de BVDV-1, apenas os subgenótipos -1a (n = 28, 31,1%) e -1b (n = 10, 11,1%) foram identificados. Todos os 30 isolados de BVDV-2 pertenciam ao subgenótipo -2b e os 21 HoBiPeV foram agrupados no subgrupo 3a. O terceiro estudo, descreve a utilização de um novo par de primers (BP189-389) para detecção das três espécies de pestivírus de bovinos (BVDV-1, -2 e HoBiPeV). A RT-PCR com o primer 324 - 326 detectou 110 amostras positivas, sendo 62 para BVDV-1, 38 para BVDV-2 e 10 para HoBiPeV; e o primer 90 - 368 detectou 97 amostras positivas (64 BVDV-1; 33 BVDV-2). O primer específico para BVDV-2 detectou 45 amostras positivas (incluindo 38 detectadas pelo 324 - 326 e 33 pelo 90 - 368); enquanto que a RT-PCR utilizando o primer específico para HoBiPeV detectou 26 amostras positivas (incluindo 10 detectadas com o 324 - 326). A RT-PCR utilizando o primer BP189-389 detectou todas as 135 amostras, incluindo os 26 HoBiPeV detectados pelo N2-R5. Assim, o primer BP189 389 demonstrou alta sensibilidade e especificidade na detecção de BVDV-1, BVDV-2 e HoBiPeV, e pode ser uma alternativa no diagnóstico de pestivírus de bovinos. Em resumo, o presente trabalho apresenta contribuições para o diagnóstico de pestivírus bovino e acrescenta informações acerca do perfil genético dos pestivírus circulantes em bovinos no RS.

he genus Pestivirus, belonging to the family Flaviviridae, comprises three viral species that infect cattle: bovine viral diarrhea virus 1 (BVDV-1)/Pestivirus A, BVDV-2/Pestivirus B and pestivirus HoBi-like (HoBiPeV)/Pestivirus H. The two BVDV species and HoBiPeV as well as the respective subgenotypes may be identified based on the comparison of sequences within the 5 non-translated region (5UTR) of the viral genome, which allows to group the isolates in twenty-one subgenotypes of BVDV-1 (1a-1u), four genotypes of BVDV-2 (2a2d) and four of HoBi-like (-3a to -3d). The 5UTR is also a target for molecular detection of pestiviruses due to its high conservation. In a first study, we describe the detection and genetic identification of pestiviruses present in 73 lots of fetal bovine serum (FBS) of Brazilian origin, produced between 2006 and 2014. Thirty-nine FBS batches (53.4%) were positive for pestivirus RNA. Thirty-four (46.6%) contained BVDV-1, being 23 -1a, eight -1b and three -1d. Six batches (8.2%) contained BVDV-2, two of them being -2a, three -2b and one of undetermined subgenotype. Four batches of FBS (5.5%) were contaminated with HoBiPeV and five batches (6.8%) contained more than one pestivirus. These results demonstrate the contamination of Brazilian origin FBS with pestivirus RNA. The second study reports the characterization of 90 pestiviruses obtained from serum samples from cattle in the state of Rio Grande do Sul for export in 2017, of which 38 BVDV-1 (42.2%), 31 BVDV-2 (34.4%) and HoBiPeV (23.4%). Of the BVDV-1 samples, only the 1a (n = 28, 31.1%) and -1b (n = 10, 11.1%) subgenotypes were identified. All 30 BVDV-2 isolates belonged to the -2b subgenotype and the 21 HoBiPeV viruses were grouped into subgroup 3a. The third study describes a new primer pair (BP189-389) for the detection of three bovine pestivirus species (BVDV-1, -2 and HoBiPeV). RT-PCR with primer 324-326 detected 110 positive samples, 62 for BVDV-1, 38 for BVDV-2 and 10 for HoBiPeV; and primer 90-368 detected 97 positive samples (64 BVDV-1; 33 BVDV-2). Primer specific for BVDV-2 detected 45 positive samples (including 38 detected by 324-326 and 33 by 90-368); while RT-PCR using the primer specific for HoBiPeV detected 26 positive samples (including 10 detected with 324-326). RT-PCR using primer BP189-389 detected all 135 samples, including the 26 HoBiPeV detected by N2-R5. Thus, primer BP189-389 demonstrated high sensitivity and specificity in the detection of BVDV-1, BVDV-2 and HoBiPeV and may be an alternative in the diagnosis of bovine pestiviruses. Summarizing, the present study presents contributions for the diagnosis of bovine pestiviruses and adds new information on the genetic profile of pestiviruses circulating in cattle from RS.

Avaliação molecular do potencial de diferencição espontânea de células tronco mesenquimais obtidas de gelatina de Wharton e tecido adiposo canino.

As células tronco mesenquimais (CTMs) são indicadas para a terapia alogênica pois seus riscos de rejeição são significativamente reduzidos, uma vez que não são células apresentadoras de antígenos. O objetivo deste trabalho foi investigar a influência da criopreservação por longo tempo e das concentrações de SFB (10 e 20%) na: viabilidade, proliferação e potencial de diferenciação de CTMs. Para isso CTMs-TA e CTMs-GW criopreservadas por 43 meses foram submetidas ao processo de caracterização através da citometria de fluxo, teste de proliferação e diferenciação (por imunocitoquímica e expressão gênica). Também foi avaliada a influência de duas concentrações de SFB sobre a expressão gênica de células induzidas e não induzidas à diferenciação adipogênica e osteogênica, sendo observada também a influência, do processo de indução de diferenciação sobre a expressão gênica de CTMS-TA e CTMs-GW. As CTM criopreservadas por longo tempo mantiveram sua viabilidade após a reconstituição e também o potencial de diferenciação osteogênica in vitro confirmada no RT-qPCR. No teste de proliferação realizado com as CTMs-TA e CTM-GW com 10 e 20% de SFB, observamos que as CTMs-TA podem ser cultivadas com qualquer uma das concentrações, porém nas CTMs-GW identificamos que a proliferação é maior quando são cultivadas com 20% de SFB. Através da imunocitoquímica observamos que a concentração de SFB não influencia a diferenciação induzida em nenhuma das duas fontes estudadas. Já a análise da diferenciação espontânea, por imunocitoquimica, mostrou maior acúmulo de gotículas de gordura nas CTMs-TA e CTMs-GW cultivadas com 20% de SFB, indicando a diferenciação espontânea para tecido adipogênico. Este fato não foi confirmado por RT-qPCR, uma vez que não houve a expressão do transcrito PPAR que deveria ser encontrado em células diferenciadas para essa linhagem. Considerando a influência da diferenciação na expressão de transcritos específicos para a linhagem adipogênica as CTMs-TA passaram a expressar menos os AdipoQ e PPAR e mantiveram a baixa expressão do PPAR, nas CTMs-GW não foi observada a expressão do PPAR e manteve a baixa expressão dos AdipoQ e PPAR. Os genes relacionados a diferenciação osteogênica nas CTMs-TA o RUNX2 apresentou maior expressão, enquanto que o OSC foi mantido. Dos genes relacionados a neuroproteção o GDNF apresentou-se mais expresso após a diferenciação adipogênica nas CTMS-GW, o mesmo foi observado quanto ao NES nas duas fontes estudadas. A diferenciação adipogênica influenciou de forma significativa as expressão dos transcritos TP53, CASP3 e BCL2L1 nas CTMs-TA e BCL2L1 nas CTMs-GW, já a diferenciação osteogênica influenciou nas expressão de BCL2L1 e CLU nas CTMS-TA e CTMs-WJ. Concluindo, o protocolo para criopreservação e a manutenção das células foram adequados, porém algumas alterações encontradas como expressão de CD34+ e CD105+ associada à expressão gênica de NES e GDNF podem indicar uma tendência a diferenciação espontânea para a linhagem endotelial. Além disso, nosso trabalho demonstrou que as diferenças na concentração de SFB não influenciam a expressão gênica das células. Contudo podemos sugerir que o processo de diferenciação induziu as CTMs a um estresse, porém as CTMs responderam de forma compensatória à esse estimulo, evidenciando assim suas características terapêuticas.

Mesenchymal stem cells (MSCs) are recomended for allogeneic therapy because their risks of rejection are significantly reduced since they are not antigen presenting cells. The objective of this work was to investigate the influence of long-term cryopreservation and FBS concentrations (10 and 20%) on viability, proliferation and differentiation potential of MSCs. For this, MSCs from adipose tissue (-AT) and CTMs from Wharton jelly (-WJ) cryopreserved for 43 months were submitted to the characterization process through flow cytometry, proliferation and differentiation test (by immunocytochemistry and gene expression). The influence of two concentrations of FBS on gene expression of cells induced and non-induced for adipogenic and osteogenic differentiation was also evaluated. Long-term cryopreserved MSCs maintained their viability after reconstitution and also the potential for in vitro osteogenic differentiation confirmed in RT-qPCR. In the proliferation test performed with MSC-AT and MSC-WG with 10 and 20% FBS, we observed that the MSC-AT can be grown at any of the concentrations, but in the MSC-WG proliferation is greater when cultivated with 20% FBS. Through immunocytochemistry we observed that the concentration of FBS does not influence the induced differentiation in either sources of cells studied. The analysis of the spontaneous differentiation, by immunocytochemistry, showed greater accumulation of fat droplets in MSC-AT and MSC-WG cultured with 20% FBS, indicating the spontaneous differentiation for adipogenic tissue. This fact was not confirmed by RT-qPCR, since there was no expression of the PPAR transcript that should be found in cells differentiated for this lineage. Considering the influence of the differentiation in the expression of specific transcripts for the adipogenic lineage the MSC-AT express less the AdipoQ and PPAR and maintained the low expression of the PPAR, in the MSC-WG group PPAR expression was not observed and maintained the low expression of AdipoQ and PPAR. From the genes related to osteogenic differentiation in MSC-AT, RUNX2 presented higher expression, while the OSC was maintained. Of the genes related to neuroprotection, GDNF was more expressed after adipogenic differentiation in MSC-WG, the same was observed for NES in the two studied sources. Adipogenic differentiation significantly influenced the expression of the TP53, CASP3 and BCL2L1 transcripts in the MSC-AT and BCL2L1 in the MSC-WG, whereas the osteogenic differentiation influenced the expression of BCL2L1 and CLU in MSC-AT and MSC-WG. In conclusion, the protocol for cryopreservation and cell maintenance were adequate, but some alterations found as increased expression of CD34 + and CD105 + associated with the gene expression of NES and GDNF may indicate a tendency for spontaneous differentiation into the endothelial cell lineage. In addition, our work demonstrated that differences in FBS concentration do not influence gene expression. However, we can suggest that the differentiation process induced the MSCs to a stress, but the MSCs responded in a compensatory way to this stimulus, thus showing its therapeutic characteristics.

Suplementação proteica no meio de cultivo in vitro de folículos pré-antrais / Protein supplementation on In Vitro Preantral Follicle Medium Culture

The in vitro culture of preantral follicles is an important tool to elucidate the mechanisms involved in controlling early folliculogenesis as well as to improve reproductive efficiency by providing a large number of oocytes for in vitro production of embryos. To this end, improvements in the performance of current culture systems are needed, including changes in the composition of the medium. Supplementation of culture medium with proteins is a great strategy to improve survival and in vitro development of preantral follicles. This review highlights the importance of in vitro culture of preantral follicles with emphasis on the main protein sources used to supplement the culture media.

Suplementação proteica no meio de cultivo in vitro de folículos pré-antrais / Protein supplementation on In Vitro Preantral Follicle Medium Culture

The in vitro culture of preantral follicles is an important tool to elucidate the mechanisms involved in controlling early folliculogenesis as well as to improve reproductive efficiency by providing a large number of oocytes for in vitro production of embryos. To this end, improvements in the performance of current culture systems are needed, including changes in the composition of the medium. Supplementation of culture medium with proteins is a great strategy to improve survival and in vitro development of preantral follicles. This review highlights the importance of in vitro culture of preantral follicles with emphasis on the main protein sources used to supplement the culture media.(AU)

Nanobacteria-like particles: a threat to cell cultures

The main goal of this study is to alert researchers who work with cell cultures for the risk of contamination by structures called nanobacteria (NB). NB are tiny structures with size varying from 80 to 500 nm, commonly occurring in clusters and producing a biofilm which contains carbonate or hydroxyl apatite. The most likely source of cell culture contamination by such organisms is serum used as supplement in culture media. The presence of NB leads to a progressive culture deterioration with accumulation of granules (probably phagocytized NB) in cytoplasmic vacuoles, an increasing number of dead cells in the supernatant and degeneration of cells that remained attached to the bottom of the vessel. NB can also be found in culture supernatants where they are found in clusters with variable size and displaying brownian movement. In this study, 19 cell lineages, 8 batches of sera and 1 batch of growth supplement from different sources were analyzed. Samples from sera were cultured in Eagle's Minimum Essential Medium (E-MEM) or incubated directly at 37ºC. Tests carried out to detect the presence of extracellular bacteria, Mycoplasma sp and viruses were all negative. Analysis by scanning electron microscopy (SEM) revealed tiny oval structures less than 500 nm in size, isolated or in small groups, in all material analyzed except in one fetal bovine serum batch.

O principal objetivo deste estudo é alertar aos pesquisadores que trabalham com cultivos celulares sobre o risco de contaminação por estruturas denominadas nanobactérias (NB). NB são estruturas muito pequenas cujo tamanho varia de 80 a 500 nm e que comumente ocorrem em agrupamentos, produzindo biofilme de carbonato ou hidroxiapatita. A fonte mais provável de contaminação dos cultivos celulares por tais organismos é o soro utilizado como suplemento nos meios de cultura. A presença de NB leva a uma progressiva deterioração do cultivo com acúmulo de grânulos (provavelmente NB fagocitadas) em vacúolos citoplasmáticos, um número cada vez maior de células mortas no sobrenadante e degeneração das células que permaneceram aderidas à superfície do frasco de cultura. NB podem ser encontradas também em sobrenadantes de cultivos onde são observadas em agrupamentos de tamanho variável com movimento browniano. Neste estudo, 19 linhagens celulares, 8 lotes de soro e 1 lote de suplemento de diferentes procedências foram analisados. Amostras de soros foram cultivadas em Meio Essencial Mínimo de Eagle (E-MEM) ou incubados diretamente a 37ºC. Testes efetuados para detectar a presença de bactérias extracelulares, Mycoplasma sp e vírus foram todos negativos. Análise por microscopia eletrônica de varredura (SEM) revelou minúsculas estruturas ovóides com tamanho inferior a 500 nm, isoladas ou em pequenos agrupamentos, em todos os materiais analisados exceto em um lote de soro fetal bovino.

Manutenção in vitro de células IDE8 em dois tipos de soro bovino / In vitro maintenance of IDE8 cells using two types of bovine serum

The present study had the objective of defining the culture conditions, optimizing the maintenance and expansion of an IDE-8 cell line in Brazil, with the aim to propose its use as a model for in vitro infection and multiplication of Brazilian strains of rickettsia and other hemoparasites. The supplementation of IDE-8 cells with two distinct fetal bovine sera (a Brazilian and an imported) was evaluated. Culture media were changed weekly and subcultures were carried out every 15 days. The development of cultures and subcultures was evaluated by the percentage of viability and cellular morphology. The results indicate that the imported SFB can be replaced by the Brazilian SFB one, as no significant differences (P<0.05) were seen among culture viabilities.(AU)

Efeito de sistema de cultivo, célula somática e soro em co-cultura sobre o desenvolvimento de embriões bovinos fecundados in vitro / Effects of culture system, somatic cells and serum in co-culture on the development of in vitro fertilized bovine embryos

O objetivo deste experimento foi o de avaliar o efeito de sistemas de cultivo e de diferentes células somáticas e soro bovino na co-cultura sobre a produção de embriões bovinos fecundados in vitro. No experimento um avaliou-se o efeito do sistema de co-cultura com células da tuba uterina e do sistema "definido". No experimento dois utilizaram-se células da granulosa ou da tuba uterina para a co-cultura em meio CR1aa (Charles Rosenkrans). No experimento três utilizou-se soro de vaca em cio (SVC) ou soro fetal bovino (SFB), ambos em co-cultura com células da granulosa em CR1aa. Os ovócitos utilizados foram obtidos de ovários colhidos em matadouro e maturados in vitro em meio 199 com soro de vaca em cio e FSH por 24h. Após a maturação, os ovócitos foram fecundados in vitro por 22h e posteriormente divididos aleatoriamente nos tratamentos. Avaliaram-se a taxa de clivagem no dia três do cultivo, a produção de blastocistos nos dias sete e oito, e de blastocistos eclodidos nos dias nove e dez. Não houve diferença entre os sistemas em co-cultura e "definido" quanto à taxa de clivagem (80,7% e 75,4%) e de produção de blastocisto (19,4% e 17,7%). Entretanto, a taxa de blastocistos eclodidos foi superior para o sistema em co-cultura (37,5%) quando comparado com o sistema "definido" (8,7%). O cultivo embrionário em células da tuba uterina ou da granulosa resultaram em taxas de clivagem, produção de blastocisto e blastocistos eclodidos semelhantes entre si (65,5% e 66,7% de clivagem, 11,6% e 13,7% de blastocistos e 23,1% e 50,0% de blastocistos eclodidos; P>0,05), bem como o cultivo com SFB ou SVC (63,9% e 70,2% de clivagem, 14,3% e 8,7% de blastocisto e 41,2% e 33,3% de blastocistos eclodidos; P>0,05). Conclui-se que o sistema de cultivo "definido" pode ser utilizado para estudos com cultivo de embriões in vitro, no entanto, os resultados quanto à taxa de eclosão ainda são inferiores ao sistema em co-cultura... (AU)

The aims of this study were to evaluate the effects of culture system and different somatic cells and bovine serum in co-culture on in vitro production of bovine embryos. On the first experiment oviduct epithelial cells for co-culture system in CR1aa (Charles Rosenkrans) medium for "defined" system were studied. On the second experiment granulosa or oviduct epithelial cells, both in CR1aa medium were used. On the third experiment estrous cow serum (ECS) or fetal calf serum (FCS), both in granulosa cells co-culture in CR1aa medium was used. Bovine cumulus-oocytes complexes, obtained from ovaries collected at slaughterhouse, were matured in vitro in medium 199 added with ECS and FSH for 24h. Right after, the oocytes were fertilized in vitro for 22h and randomly divided in the treatments of the experiments. The cleavage rate was evaluated on day three, the blastocyst production on seventh and eighth days and the hatched blastocysts on ninth and tenth days. No differences were obtained (P>0.05) between co-culture and "defined" systems on the cleavage rate (80.7% and 75.4%) and on the blastocysts production (19.4% and 17.7%). However, the hatched blastocyst rate was higher (P<0.05) in the co-culture than in the "defined" system (37.5 and 8,7%, respectively). Similar results of embryo co-culture in oviduct epithelial and granulosa cell cultures were obtained regarding to similar cleavages, blastocyst and hatched blastocyst rates (65.5% and 66.7% of cleavage, 11.6% and 13.7% of blastocyst and 23.1% and 50.0% of hatched blastocyst; P>0.05), as well as with FCS and ECS (63.9% and 70.2% of cleavage, 14.3% and 8.7% of blastocyst and 41.2% and 33.3% of hatched blastocyst; P>0,05). The results show that the "defined" system can be used for in vitro embryo culture studies. Nevertheless, the hatched blastocyst rate was higher in co-culture system. Granulosa and oviduct epithelial cells had similar effects on the in vitro embryonic development... (AU)