Specific detection of bovine coronavirus N protein with TaqMan probe qRT-PCR

Background: Bovine Coronavirus (BCoV) can cause acute diarrhea in newborn calves and adult cattle. BCoV infectionmay cause losses to production by reduced weight gain and milk yield of the infected animals. Several methods have beenapplied to detect and diagnose BCoV. However, each assay has its deficiency. Currently, real-time quantitative PCR (qRTPCR) has been utilized to identify and quantify many viral pathogens since it is a highly sensitive. However, the technicalassay varies due to normalization control of the signal with an internal standard, typically a housekeeping gene.Materials, Methods & Results: The present study was aimed to establish a novel TaqMan probe real-time PCR (qRT-PCR)for detecting bovine coronaviruses (BCoV), and also to develop a diagnostic protocol which simplifies sample collectionand processing. One pair of specific primers, one pair of universal primers and a TaqMan probe were designed from theknown sequences of conserved nucleocapsid (N) protein of BCoV. Reaction systems of TaqMan qRT-PCR were optimizedincluding concentrations of the primers and probe as well as annealing temperatures. Prior to optimizing the assay, therecombinant plasmids of pMD18-T-BCoV-N were successfully constructed to make standard curves. The sensitivity, specificity and reproducibility were evaluated on the TaqMan qRT-PCR, respectively. A total of 321 feces specimens collectedfrom diarrheic calves were detected with this assay. The results showed the optimized reaction conditions for qRT-PCRwere 14.5 μM/L primers, 19.5 μM/L probes and 45.0°C annealing temperatures. The established TaqMan qRT-PCR assaycould specially detect BCoV without detecting any other viruses. Its minimum detection limit was 4.72 × 101 copies/μL.However, universal PCR could detect only 4.72 × 103 copies/μL...

Specific detection of bovine coronavirus N protein with TaqMan probe qRT-PCR

Background: Bovine Coronavirus (BCoV) can cause acute diarrhea in newborn calves and adult cattle. BCoV infectionmay cause losses to production by reduced weight gain and milk yield of the infected animals. Several methods have beenapplied to detect and diagnose BCoV. However, each assay has its deficiency. Currently, real-time quantitative PCR (qRTPCR) has been utilized to identify and quantify many viral pathogens since it is a highly sensitive. However, the technicalassay varies due to normalization control of the signal with an internal standard, typically a housekeeping gene.Materials, Methods & Results: The present study was aimed to establish a novel TaqMan probe real-time PCR (qRT-PCR)for detecting bovine coronaviruses (BCoV), and also to develop a diagnostic protocol which simplifies sample collectionand processing. One pair of specific primers, one pair of universal primers and a TaqMan probe were designed from theknown sequences of conserved nucleocapsid (N) protein of BCoV. Reaction systems of TaqMan qRT-PCR were optimizedincluding concentrations of the primers and probe as well as annealing temperatures. Prior to optimizing the assay, therecombinant plasmids of pMD18-T-BCoV-N were successfully constructed to make standard curves. The sensitivity, specificity and reproducibility were evaluated on the TaqMan qRT-PCR, respectively. A total of 321 feces specimens collectedfrom diarrheic calves were detected with this assay. The results showed the optimized reaction conditions for qRT-PCRwere 14.5 μM/L primers, 19.5 μM/L probes and 45.0°C annealing temperatures. The established TaqMan qRT-PCR assaycould specially detect BCoV without detecting any other viruses. Its minimum detection limit was 4.72 × 101 copies/μL.However, universal PCR could detect only 4.72 × 103 copies/μL...(AU)

Vacinação pré-parto de vacas Nelore contra diarreia neonatal

A diarreia neonatal dos bezerros (DNB) é um dos eventos de saúde mais importantes durante o período de criação de bezerros de corte, sendo responsável por grande parte da morbidade e mortalidade nesta fase. Entre as medidas para mitigar o risco de surtos de DNB, a vacinação da vaca na última fase da gestação é uma das mais importantes. O objetivo desta pesquisa foi avaliar a eficácia da vacinação pré-parto contra DNB, especialmente Rotavírus Bovino tipo A (BoRVA) e Coronavírus Bovino (BCoV), em animais da raça Nelore. Um total de 117 animais, divididos em vacas (n=81) e novilhas (n=36) foram distribuídos em dois grupos experimentais, sendo estes: grupo de animais vacinados (VAC: vacas=40; novilhas=19) e grupo de animais não vacinados (NVAC: vacas=41; novilhas=17). O tratamento dos animais ocorreu entre 60 a 50 dias antes da data prevista para o parto, sendo aplicado no grupo VAC uma única dose de uma vacina comercial (2mL), administrado por via intramuscular, e no grupo NVAC uma dose de solução salina 0,9%. Amostras de sangue foram coletadas imediatamente antes da vacinação e após 30 dias, para avaliar a resposta de anticorpos específicos (IgG1) contra BoRVA e BCoV. O nascimento dos bezerros foi monitorado e a transferência de imunidade passiva foi avaliada entre o segundo e o terceiro dias de vida. A diarreia foi monitorada nos primeiros 30 dias de idade, e amostras de fezes foram coletadas para identificação do agente etiológico em animais com diarreia. Como controle, amostras de fezes de bezerros saudáveis com idade semelhante à dos animais com diarreia, também foram coletadas. Os anticorpos específicos (IgG1) contra BoRVA e BCoV foram medidos usando a técnica Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA). A comparação de médias pelo teste T de Student mostrou títulos mais elevados de IgG1 contra BoRVA e BCoV no grupo VAC quando comparado ao grupo NVAC na categoria de vacas (P<0,0001) e no total de animais (P<0,0001). Em relação aos bezerros, não houve diferenças (P>0,05) entre os grupos para a concentração de proteína total sérica (PTS) e taxa (%) de falha da transferência imune passiva (FTIP). O título de IgG1 específico no soro de bezerros refletiu a resposta das mães, observando títulos mais elevados de IgG1 para BoRVA (P<0,0016) e BCoV (P<0,0095) nos bezerros nascidos da categoria de vacas do grupo VAC; e títulos mais elevados de IgG1 para BoRVA (P<0,0171) e BCoV (P<0,0200) nos bezerros nascidos do total de animais do grupo VAC. A incidência geral de diarreia observada foi de 18,6% (11/59) e 29,3% (17/58) nos bezerros nascidos do grupo VAC e NVAC, respectivamente. Apesar da diferença observada, o pequeno tamanho amostral não permitiu detectar diferenças estatísticas entre os grupos experimentais para diarreia (P>0,05). Entre bezerros com diarreia, o agente mais prevalente foi o BoRVA. A vacinação pré-parto com uma única dose da vacina testada aumentou os títulos de IgG1 contra BCoV e BoRVA, podendo ser utilizada como estratégia preventiva para diminuir a ocorrência de DNB em animais da raça Nelore.

Neonatal calf diarrhea (NCD) is one of the most important health events during the rearing period of beef calves, accounting for much of the morbidity and mortality at this stage. Among the measures to mitigate the risk of NCD outbreaks, cow vaccination in the last stage of pregnancy is one of the most important. The objective of this research was to evaluate the effectiveness of prepartum vaccination against NCD, especially Bovine Rotavirus type A (BoRVA) and Bovine Coronavirus (BCoV), in Nelore animals. A total of 117 animals, divided into cows (n=81) and heifers (n=36) were divided into two experimental groups, namely: vaccinated animal group (VAC: cows=40; heifers=19) and animal group unvaccinated (NVAC: cows=41; heifers=17). The treatment of the animals occurred between 60 to 50 days before the expected date of calving, with a single dose of a commercial vaccine (2mL) being applied to the VAC group, administered intramuscularly, and to the NVAC group a dose of saline solution 0, 9%. Blood samples were collected immediately before vaccination and after 30 days to assess the specific antibody response (IgG1) against BoRVA and BCoV. The calf birth was monitored and the transfer of passive immunity was evaluated between the second and third days of life. Diarrhea was monitored in the first 30 days of age, and stool samples were collected to identify the etiologic agent in animals with diarrhea. As a control, fecal samples from healthy calves with age similar to that of animals with diarrhea were also collected. Specific antibodies (IgG1) against BoRVA and BCoV were measured using the Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) technique. Comparison of means by Student's t test showed higher IgG1 titers against BoRVA and BCoV in the VAC group when compared to the NVAC group in the cows category (P<0.0001) and in total animals (P<0.0001) . In relation to calves, there were no differences (P>0.05) between groups for serum total protein concentration (STP) and rate (%) of passive immune transfer failure (PITF). The specific IgG1 titer in the serum of calves reflected the response of the dams, observing higher IgG1 titers for BoRVA (P<0.0016) and BCoV (P<0.0095) in calves born from the category of cows in the VAC group; and higher IgG1 titers for BoRVA (P<0.0171) and BCoV (P<0.0200) in calves born from the total number of animals in the VAC group. The overall incidence of diarrhea observed was 18.6% (11/59) and 29.3% (17/58) in calves born in the VAC and NVAC groups, respectively. Despite the observed difference, the small sample size did not allow detecting statistical differences between the experimental groups for diarrhea (P>0.05). Among calves with diarrhea, the most prevalent agent was BoRVA. Prepartum vaccination with a single dose of the tested vaccine increased IgG1 titers against BCoV and BoRVA, and can be used as a preventive strategy to reduce the occurrence of NCD in Nelore animals.

Isolamento, caracterização molecular e análise filogenética do gene da glicoproteína S de coronavírus bovino associado à doença respiratória

O coronavírus bovino (BCoV) é um vírus com duplo tropismo (entérico e respiratório) e desencadeia manifestações clínicas entéricas e respiratórias nos bovinos, em doenças como a disenteria de inverno (winter dysentery) em bovinos adultos, diarreia neonatal em bezerros e doença respiratória. O presente trabalho reporta a detecção de BCoV associado à doença respiratória em animais jovens e descreve a análise molecular e filogenética do isolado respiratório (BOV19-NS) com base em fragmentos parciais (1447 nt e 438 nt) do gene S. O trabalho também descreve o sucesso do isolamento da BOV19-NS em células da linhagem HRT-18 e compara molecularmente as sequências do gene da glicoproteína S do BCoV obtidas diretamente da amostra clínica e do isolado adaptado ao longo das passagens celulares. A matriz de identidade do fragmento maior (1447 nt) demonstrou maior identidade (98,2%) da amostra BOV19-NS com isolados brasileiros de BECoV, coletados em 2004, no estado de Minas Gerais (BRUEL-1, BRUEL-2 e BRUEL-3), enquanto do fragmento menor (438) a maior identidade (98,4%) foi observada com um isolado brasileiro de BECoV coletado em 2014 no Rio de Janeiro (PD1).  A árvore filogenética demonstrou uma tendência de separação filogeográfica dos isolados de BCoV. Comparando com o protótipo ancestral de BCoV, cepa Mebus, foram identificadas 33 substituições nucleotídicas, das quais 15 resultaram em mutações não sinônimas (9 transições e 6 transversões). Uma alteração de aa inédita foi detectada no resíduo 528 (Ala528Val) da região hipervariável da S1 em um isolado selvagem. Em comparação com a amostra selvagem, foi identificada apenas uma substituição nucleotídica na posição de nt 2428 (AATàTAT) a partir da 7ª passagem, que resultou na transversão, carga neutra-neutra, Asn810Tyr. Este é o primeiro relato de isolamento de BCoV em cultivo celular associado à doença respiratória no Brasil. Além disso é pioneiro na caracterização molecular do isolado selvagem e do respectivo adaptado em cultivo após sucessivas passagens.

Bovine coronavirus (BCoV) is a dual tropism virus (enteric and respiratory), which triggers enteric and respiratory clinical manifestations in cattle, with diseases such as winter dysentery in adult cattle, neonatal diarrhea in calves and respiratory disease. The present work reports the detection of BCoV associated with respiratory disease in young animals and describes the molecular and phylogenetic analysis of the respiratory isolate (BOV19-NS) based on partial fragments (1447 nt and 438 nt) of the S gene. Also, it reports the success of BOV19-NS isolation in HRT-18 cells lineage; molecular comparison of the BCoV sequences obtained directly from the clinical sample and the adaptation of the isolate along the cell passages. The biggest identity matrix (1447 nt) demonstrated greater identity (98.2%) of the BOV19-NS sample with Brazilian isolates of enteric BCoV, collected in 2004 in Minas Gerais (BRUEL-1, BRUEL-2 and BRUEL-3), while the smaller fragment showed the highest identity (98.4%) with a Brazilian isolate of enteric BCoV, collected in 2014 in Rio de Janeiro (PD1). The phylogenetic tree showed a tendency of phylogeographic separation of BCoV isolates. Comparing with the ancestral prototype of BCoV, Mebus strain, 33 nucleotide substitutions were identified, of which 15 resulted in non-synonymous mutations (9 transitions and 6 transversions). A new aa change was detected at residue 528 (Ala528Val) of the hypervariable region of S1 in a wild type isolate. Compared to the wild type isolate, only one nucleotide substitution at nt position 2428 (AATàTAT) was identified from the 7th passage, which resulted in the Asn810 Tyr transversion, neutral-neutral. This is the first report of BCoV isolation in cell culture associated with respiratory disease in Brazil. It is also pioneer in the molecular characterization of the wild isolate and its adapted culture after successive passages.

DOENÇA RESPIRATÓRIA BOVINA POR Mycoplasma bovis EM VACAS LACTANTES DE REBANHOS LEITEIROS DE ALTO RENDIMENTO

A ocorrência de doença respiratória bovina (DRB) ocasionada por Mycoplasma bovis foi avaliada em vacas leiteiras em lactação de três rebanhos (A C) de alta produção localizados na mesorregião central oriental do estado do Paraná, sul do Brasil. Com o objetivo de determinar a etiologia de casos clínicos de doença respiratória em vacas em lactação, foi acompanhado por um período de nove meses o rebanho A que apresentou casos recorrentes de DRB em vacas no pós parto. Neste intervalo de tempo, para investigar a etiologia, foram coletados 12 swabs nasais de vacas com quadro clínico de DRB e 12 fragmentos de pulmão de vacas que morreram por DRB. Nos rebanhos B e C, os problemas respiratórios ocorreram de forma diferente. Vacas em pico de lactação apresentaram sinais clínicos agudos de DRB sob a forma de surto comprometendo vários animais simultaneamente. Para o diagnóstico etiológico da DRB foram coletadas amostras de swab nasal em vacas com sinais clínicos de problemas respiratórios agudos no rebanho B (n=20) e no rebanho C (n=9). Todas as amostras foram avaliadas por PCR / RT-PCR para avaliar a presença dos principais agentes etiológicos envolvidos em DRB incluindo Mycoplasma bovis, Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida, Histophilus somni, vírus respiratório sincicial bovino (BRSV), coronavírus bovino (BCoV), vírus da diarreia viral bovina (BVDV), alfaherpesvírus bovino 1 (BoHV-1) e vírus parainfluenza bovino 3 (BPIV-3). Secções pulmonares de vacas do rebanho A que morreram com BRD foram submetidas à análise histopatológica. Amplicon com tamanho esperado de 488 pb foi obtido por nested-PCR para M. bovis em 9 (75%) dos 12 fragmentos de tecido pulmonar obtidos no rebanho A. Destas, sete vacas apresentaram infecção singular por M. bovis enquanto duas vacas apresentavam infecção mista com P. multocida (n=1) e BVDV (n=1). Nas amostras de swabs nasais (n=12) coletadas do rebanho A, as reações de PCR / RT28 PCR foram positivas para M. bovis (n=3; 25%), P. multocida (n=4; 33,3%), M. haemolytica (n=3; 25%), BVDV (n=2; 16,6%) e BoHV-1 (n=1; 8,3%). Os tecidos pulmonares apresentaram alterações histopatológicas clássicas descritas nos casos de pneumonia por M. bovis em bovinos. Nas vacas do rebanho B foram identificadas apenas infecções com M. bovis (n = 8; 40%) e H. somni (n = 15; 75%). No rebanho C, M. bovis, H. somni e P. multocida foram identificados em swabs nasais de seis (66,6%), duas (22,2%) e três (33,3%) das vacas, respectivamente. Em ambos os rebanhos, nenhum dos outros micro-organismos envolvidos na etiologia de DRB e que foram incluídos nas análises moleculares foi identificado. M. bovis é considerado um micro-organismo fastidioso, com isso, o diagnóstico laboratorial é frequentemente negligenciado e a maioria dos casos clínicos de micoplasmose em bovinos jovens e adultos não é diagnosticada. Este estudo, que envolveu a análise dos principais micro39 organismos causadores de BRD, demonstrou a importância da infecção por M. bovis em vacas adultas em três rebanhos bovinos leiteiros de alta produção. Ressalta-se que, em um rebanho (A), a infecção apresentou-se de forma recorrente, com o surgimento de vários casos clínicos durante os nove meses de avaliação. Em contraposição, nos outros dois rebanhos (B e C) a BRD ocorreu na forma de surto de sinais clínicos respiratórios agudos. Os resultados apontam para a importância de incluir o diagnóstico etiológico de M. bovis em casos de DRB em animais adultos, especialmente em vacas no pós-parto e em vacas no pico lactacional.

The occurrence of bovine respiratory disease (BRD) caused by Mycoplasma bovis was investigated in lactating dairy cows from three high milk yield dairy cattle herds of the eastern central mesoregion of the Paraná state, southern Brazil. With the objective of determining the etiology of clinical cases of respiratory disease in lactating cows, the A herd that presented recurrent cases of DRB in postpartum cows was followed for a period of nine months. In this time interval were collected for determination of the etiology of BRD 12 nasal swabs and 12 lung tissues fragments of cows that died from BRD. Differently, in the other two farms (B and C) the respiratory symptoms in lactating cows, targeting cows at peak lactation, occurred in the form of an outbreak, so several cows presented acute cases of BRD simultaneously. For BRD diagnostic 29 nasal swabs samples were collected in cows with clinical signs of acute respiratory problem in farm B (n=20) and farm C (n=9). All samples were evaluated by PCR / RT-PCR for nucleic acid detection of the main BRD etiological agents including Mycoplasma bovis, Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida, Histophilus somni, bovine respiratory syncytial virus (BRSV), bovine coronavirus (BCoV), bovine viral diarrhea virus (BVDV), bovine alphaherpesvirus 1 (BoHV-1), and bovine parainfluenza virus 3 (BPIV-3). Pulmonary sections cows that died with BRD were submitted to histopathological analysis. Amplicon with 488 bp length was obtained in nested-PCR for M. bovis in 9 (75%) of the 12 lung tissue fragments obtained from farm A. Of these, seven cows presented M. bovis single infection while two cows had mixed infection with P. multocida (n=1) and BVDV (n=1). In nasal swabs samples (n=12) collected from farm A the PCR / RT-PCR reactions were positive for M. bovis (n=3; 25%), P. multocida (n=4; 33.3%), M. haemolytica (n=3; 25%), BVDV (n=2; 16.6%), and BoHV-1 (n=1; 8.3%). Pulmonary tissues showed classic histopathological changes described in cases of M. bovis pneumonia in cattle. Differently, in cows from farm B were identified only infections with M. bovis (n=8; 40%) and H. somni (n=15; 75%). In farm C the M. bovis, H. somni, and P. multocida were identified in nasal swabs of 6 (66.6%), 2 (22.2%), and 3 (33.3%) cows, respectively. In both herds, none of the other microorganisms involved in BRD included in the analysis were identified. M. bovis is considered a fastidious microorganism. Thus, the laboratory diagnosis is neglected and most clinical cases of mycoplasmosis in cattle are not diagnosed. This study, which involved the analysis of the main microorganisms causing BRD, demonstrated the importance of M. bovis infection in adult cows in three high milk yield dairy cattle herds. It is highlighted that in a herd (A) the infection occurred recurrently, with several cases during 9 months of evaluation. In contrast, in the two other herds (B and C) the BRD occurred as an outbreak of acute respiratory clinical signs. The results point to the importance of including the M. bovis diagnosis in cases of BRD in adult animals, especially in newly calved cows and cows at peak milk yield.

Differentiation of Bovine coronavirus (BCoV) genotypes by a restriction enzyme assay

This article reports the use of the GsuI restriction enzyme to differentiate genotypes of Bovine Coronavirus (BCoV), based on an 18-nucleotide deletion of S1-coding region found in one of the two genotypes. It was concluded that this assay can be used as a rapid tool for BCoV genotypes differentiation.

A semi-nested RT-PCR assay targeted to hemagglutinin-esterase gene of Bovine Coronavirus / Reação de hemi-nested RT-PCR dirigida ao gene da hemaglutinina-esterase do Coronavírus Bovino

Bovine coronavirus (BCoV) is a non-segmented positive-sense single-stranded RNA virus whose envelope is constituted by a lipid bilayer with four structural proteins (HE, S, E and M) giving its characteristic crown-like virions appearance. Hemagglutinin-esterase (HE), is a polymorphic protein with a function of secondary receptor binder, and studies on the diversity of HE gene allow insights on BCoV evolution and host-parasite interactions. A semi-nested RT-PCR was developed for the amplification of a 441bp-long product of the HE gene of BCoV (nt 543 to 562). Optimal annealing temperatures were tested in a gradient thermocycler for the semi-nested assay and employed in the final protocol. The analytical sensitivity was determined by 10-fold serial dilutions of the BCoV Kakegawa strain (HA titer: 256) in a BCoV-free fecal suspension, with positive results up to 10-6 dilution, a high analytical sensitivity without PCR inhibition. The final semi-nested RT-PCR protocol was applied to 21 fecal samples of cows previously positive to BCoV and DNA sequencing of the 441bp amplicons of 14 of these resulted in highly-scored BCoV HE gene sequences after BLAST/n analysis. This semi-nested RT-PCR is a powerful tool for surveys of phylogenetic diversity in field strains of BCoV and for comparative studies among different genes of Coronavirus.(AU)

O coronavírus bovino (BCoV) é um vírus RNA simples fita, de sentido positivo, não segmentado com envelope constituído de uma camada dupla de lipídios com quatro proteínas (HE, S, E e M) que resultam no aspecto de coroa dos vírions. Como a HE (hemaglutinina-esterase) é uma proteína polimórfica com uma função de receptor aglutinante secundária, estudos sobre a diversidade do gene HE podem possibilitar maiores informações sobre a evolução e interação hospedeiro-parasita do BCoV. Uma reação de hemi-nested RT-PCR foi desenvolvida para a amplificação de um produto de 441pb do gene HE do BCoV (nt 543 ao 562). Temperaturas ótimas de hibridização foram testadas em um termociclador com gradiente para a reação de hemi-nested e utilizada no protocolo final. A sensibilidade analítica foi determinada por meio da diluição serial na base 10 do BCoV amostra Kakegawa (título HA: 256) em uma suspensão fecal negativa para BCoV, resultando positiva até a diluição de 10-6, mostrando uma alta sensibilidade analítica sem inibição na PCR. O protocolo final da hemi-nested RT-PCR foi aplicado a 21 amostras fecais de vacas previamente positivas para BCoV e o sequenciamento de DNA do produto de 441pb de 14 amostras resultaram em sequências com elevado escore do gene HE do BCoV após a análise no BLAST/n. Essa hemi-nested RT-PCR é uma ferramenta poderosa para estudos de diversidade filogenética de linhagens de campo de BCoV e para estudos comparativos entre os diferentes genes dos Coronavírus.(AU)

Rapid detection of bovine coronavirus by a semi-nested RT-PCR / Detecção rápida do Coronavírus Bovino (BCoV) por meio de uma semi-nested RT-PCR

Bovine coronavirus (BCoV) is a member of the group 2 of the Coronavirus (Nidovirales: Coronaviridae) and the causative agent of enteritis in both calves and adult bovine, as well as respiratory disease in calves. The present study aimed to develop a semi-nested RT-PCR for the detection of BCoV based on representative up-to-date sequences of the nucleocapsid gene, a conserved region of coronavirus genome. Three primers were designed, the first round with a 463bp and the second (semi-nested) with a 306bp predicted fragment. The analytical sensitivity was determined by 10-fold serial dilutions of the BCoV Kakegawa strain (HA titre: 256) in DEPC treated ultra-pure water, in fetal bovine serum (FBS) and in a BCoV-free fecal suspension, when positive results were found up to the 10-2, 10-3 and 10-7 dilutions, respectively, which suggests that the total amount of RNA in the sample influence the precipitation of pellets by the method of extraction used. When fecal samples was used, a large quantity of total RNA serves as carrier of BCoV RNA, demonstrating a high analytical sensitivity and lack of possible substances inhibiting the PCR. The final semi-nested RT-PCR protocol was applied to 25 fecal samples from adult cows, previously tested by a nested RT-PCR RdRp used as a reference test, resulting in 20 and 17 positives for the first and second tests, respectively, and a substantial agreement was found by kappa statistics (0.694). The high sensitivity and specificity of the new proposed method and the fact that primers were designed based on current BCoV sequences give basis to a more accurate diagnosis of BCoV-caused diseases, as well as to further insights on protocols for the detection of other Coronavirus representatives of both Animal and Public Health importance.(AU)

O Coronavírus bovino (BCoV) pertence ao grupo 2 do gênero Coronavirus (Nidovirales: Coronaviridae) e é agente causador de enterites tanto em bezerros como em bovinos adultos, bem como de doença respiratória em bezerros. O presente estudo teve por objetivo desenvolver uma semi-nested RT-PCR para a detecção do BCoV com base em seqüências representativas e recentes do gene do nucleocapsídeo, região conservada do genoma dos coronavírus. Três primers foram desenhados, a primeira amplificação com um fragmento esperado de 463pb e a segunda (semi-nested) com um fragmento esperado de 306pb. A sensibilidade analítica foi determinada pela diluição do BCoV cepa Kakegawa (título HA: 256) na base de 10 em água ultra-pura tratada com DEPC, em soro fetal bovino (SFB) e em uma suspensão fecal negativa para o BCoV, onde foram encontrados resultados positivos até a diluição de 10-2, 10-3 e 10-7, respectivamente. Este resultado sugere que a quantidade total de RNA na amostra influencia na precipitação dos pellets pelo método de extração utilizado. Quando se utiliza amostra fecal, a grande quantidade de RNA total funciona como carreadora do RNA do BCoV, demonstrando elevada sensibilidade analítica e ausência de possíveis substâncias inibidoras da PCR. O protocolo final da semi-nested RT-PCR foi aplicado a 25 amostras fecais de vacas adultas, previamente avaliadas por uma nested RT-PCR RdRp utilizada como teste de referência, resultando em 20 e 17 amostras positivas para o primeiro e segundo teste, respectivamente. Os resultados dos dois sistema de diagnóstico apresentaram concordância substancial (kappa: 0,694). A elevada sensibilidade e especificidade do novo método proposto e o fato de que os primers foram desenhados baseados em sequências atuais do BCoV, oferecem bases para o diagnóstico mais acurado de infecções causadas pelo BCoV, assim como para novas perspectivas em protocolos de detecção de outros Coronavírus de importância tanto em saninade animal ...(AU)

Um estudo sobre a diversidade molecular dos genes S e HE de Coronavírus bovino (BCoV) / A study on the molecular diversity of S and HE genes of Bovine coronavirus (BCoV)

Coronavírus bovino (BCoV) é o agente causador de doença, tanto entérica como respiratória em bovinos, mas até agora existem controvérsias sobre a relação genealógica entre as amostras de BCoV em diferentes tecidos. Neste estudo, amostras de fezes e secreções nasais de 14 vacas de um mesmo rebanho apresentando simultaneamente disenteria epizoótica e doença respiratória foram estudados quanto a presença de BCoV. As amostras virais detectadas tiveram tanto o gene de espícula (S) como o gene hemaglutinina-esterase (HE) parcialmente sequenciados. Para o gene HE, foram obtidas 12 sequências de secreções nasais e 12 de amostras de fezes e para o gene S, foram obtidas 14 sequências de secreções nasais e 12 de amostras de fezes, com 100% de identidade nucleotídica para cada gene para as amostras deste estudo. Estes resultados apresentam algumas divergências com estudos anteriores os quais relatam que linhagens diferentes de BCoV podem ser esperados em casos de disenteria e doença respiratória em vacas, pois linhagens com sequências idênticas dos genes S e HE podem não mostrar diferenças em relação tropismo pelos diferentes tecidos. Sequências completas de duas amostras brasileiras de BCoV mostram que o já descrito padrão filogeográfico baseado no sequenciamento do gene S parcial foi mantido, foram encontradas substituições de aminoácidos específicos.

Bovine coronavirus (BCoV) is the causative agent of both enteric and respiratory disease in cattle, but hitherto there were some controversy on the genealogic relationship amongst strains from these different tissues. In this study, samples of feces and nasal secretions of 14 cows from a same herd simultaneously presenting epizootic dysentery and respiratory disease were screened for BCoV and the strains detected had both the spike (S) and hemagglutinin-esterase (HE) genes partially sequenced. For HE gene, 12 sequences from nasal secretions and 12 from fecal samples were obtained and for S gene, 14 sequences from nasal secretions and 12 from fecal samples were obtained, with 100% nucleotide identities for each gene for the strains of this study. These results have some disagreements with previous reports which try to put forward that divergent BCoV strain should be expected in cases of dysentery and respiratory disease in cows, showing that strain with identical S and HE sequences might show no differences in tropisms. Complete S gene sequences of two Brazilian BCoV strains show that the already described phylogeographic pattern based on partial S gene is sustained, though specific amino acids subtitutions are found.

Um estudo sobre a diversidade molecular dos genes S e HE de Coronavírus bovino (BCoV) / A study on the molecular diversity of S and HE genes of Bovine coronavirus (BCoV)

Coronavírus bovino (BCoV) é o agente causador de doença, tanto entérica como respiratória em bovinos, mas até agora existem controvérsias sobre a relação genealógica entre as amostras de BCoV em diferentes tecidos. Neste estudo, amostras de fezes e secreções nasais de 14 vacas de um mesmo rebanho apresentando simultaneamente disenteria epizoótica e doença respiratória foram estudados quanto a presença de BCoV. As amostras virais detectadas tiveram tanto o gene de espícula (S) como o gene hemaglutinina-esterase (HE) parcialmente sequenciados. Para o gene HE, foram obtidas 12 sequências de secreções nasais e 12 de amostras de fezes e para o gene S, foram obtidas 14 sequências de secreções nasais e 12 de amostras de fezes, com 100% de identidade nucleotídica para cada gene para as amostras deste estudo. Estes resultados apresentam algumas divergências com estudos anteriores os quais relatam que linhagens diferentes de BCoV podem ser esperados em casos de disenteria e doença respiratória em vacas, pois linhagens com sequências idênticas dos genes S e HE podem não mostrar diferenças em relação tropismo pelos diferentes tecidos. Sequências completas de duas amostras brasileiras de BCoV mostram que o já descrito padrão filogeográfico baseado no sequenciamento do gene S parcial foi mantido, foram encontradas substituições de aminoácidos específicos. (AU)

Bovine coronavirus (BCoV) is the causative agent of both enteric and respiratory disease in cattle, but hitherto there were some controversy on the genealogic relationship amongst strains from these different tissues. In this study, samples of feces and nasal secretions of 14 cows from a same herd simultaneously presenting epizootic dysentery and respiratory disease were screened for BCoV and the strains detected had both the spike (S) and hemagglutinin-esterase (HE) genes partially sequenced. For HE gene, 12 sequences from nasal secretions and 12 from fecal samples were obtained and for S gene, 14 sequences from nasal secretions and 12 from fecal samples were obtained, with 100% nucleotide identities for each gene for the strains of this study. These results have some disagreements with previous reports which try to put forward that divergent BCoV strain should be expected in cases of dysentery and respiratory disease in cows, showing that strain with identical S and HE sequences might show no differences in tropisms. Complete S gene sequences of two Brazilian BCoV strains show that the already described phylogeographic pattern based on partial S gene is sustained, though specific amino acids subtitutions are found. (AU)

Mixed infections by bovine coronavirus, rotavirus and cryptosporidium parvum in an outbreak of neonatal diarrhea in beef cattle

ABSTRACT This article describes the role of bovine coronavirus, rotavirus and Cryptosporidium parvum in an outbreak of beef calf diarrhea in Presidente Epitácio, São Paulo State. Two out 9 fecal samples were positive to BCoV, 6 to C. parvum and 6 to rotavirus, with 4 rotavirus-C. parvumco-infections, 1 BCoV-C. parvumco-infection and 1 rotavirus-BCoV co-infection. These results show the need for a detailed survey of the etiology of diarrheas, aiming to evaluate the agents spread in a flock, allowing the design of prophylactic measures against gastroenteritis outbreaks.

RESUMO Estudou-se a participação de coronavírus bovino (BCoV) rotavírus e Cryptosporidium parvum em um surto de diarréia em bezerros de corte no Município de Presidente Epitácio, Estado de São Paulo. Das 9 amostras colhidas, 2 foram positivas para BCoV, 6 para C. parvum e 6 para rotavírus, sendo 4 co-infecções por rotavírus e C. parvum, 1 coinfecção por BCoV e C. parvume 1 co-infecção por rotavírus e coronavírus. Estes resultados reiteram a necessidade de que se pesquise de um modo abrangente a etiologia de diarréias, com o intuito de se avaliarem os agentes circulantes no rebanho, o que possibilita uma abordagem profilática mais exata para impedir o aparecimento de surtos epidêmicos de gastroenterites.

Identification of a mutation in the spike protein cleavage site in Brazilian strains of wild-type bovine coronavirus

The spike (S) protein of coronaviruses, a type I membrane glycoprotein, is primarily responsible for entry into susceptible cells by binding with specific receptors on cells and mediating subsequent virus-cell fusion. The bovine coronavirus (BCoV) S protein is cleaved into two subunits, the N-terminal S1 and the C-terminal S2. The proteolytic cleavage site of S protein is highly conserved among BCoV strains and is located between amino acids 763 and 768 (KRRSRR). This study describes a single mutation in the S protein cleavage site of three Brazilian strains of BCoV detected in diarrheic fecal samples from calves naturally infected. The sequenced PCR products revealed that amino acid sequence of the cleavage site of our strains was KRRSSR, indicating a mutation at amino acid position 767 (R FONT FACE=Symbol>® /FONT> S). This amino acid substitution occurred due to a single nucleotide substitution in the sequence of DNA corresponding to the proteolytic cleavage site, CGT to AGT. This is the first description of this nucleotide mutation (C to A), which resulted in the substitution of arginine to serine in the S cleavage site. In this study we speculated the probable effects of this mutation in the proteolytic cleavage site using the murine hepatitis coronavirus (MHV) as a comparative model.

A proteína da espícula (S), uma glicoproteína de membrana do tipo I, é primariamente responsável pela entrada do vírus em células susceptíveis por meio da interação inicial com receptores celulares específicos e subseqüente mediação da fusão vírus-célula. A proteína S do coronavírus bovino (BCoV) é clivada em duas subunidades: a S1, na região N-terminal e a S2, na região C-terminal. O sítio de clivagem proteolítica da proteína S é altamente conservado entre as estirpes de BCoV e está situado entre os aminoácidos 763-768 (KRRSRR). Este estudo descreve uma mutação no sítio de clivagem da proteína S de três estirpes do BCoV detectadas em amostras fecais diarréicas de bezerros naturalmente infectados no Brasil. O seqüenciamento dos produtos de PCR identificou a seqüência de aminoácidos KRRSSR no sítio de clivagem de nossas amostras, indicando uma mutação na posição 767 (R->S). Esta mutação ocorreu devido a uma única substituição de nucleotídeo no sítio de clivagem proteolítica, alterando o códon CGT para AGT. Esta é a primeira descrição desta mutação de nucleotídeo (C para A), que resultou na substituição do aminoácido arginina por serina no sítio de clivagem da proteína S. Neste estudo também são sugeridos os prováveis efeitos desta mutação no sitio de clivagem proteolítica utilizando o coronavírus da hepatite dos camundongos (MHV) como um modelo comparativo.

On the etiology of an outbreak of winter dysentery in dairy cows in Brazil / Sobre a etiologia de um surto de disenteria de inverno em vacas leiteiras no Brasil

Winter dysentery (WD) is a seasonal infectious disease described worldwide that causes a marked decrease in milk production in dairy cows. In the Northern hemisphere, where the disease is classically recognized, bovine coronavirus (BCoV) has been assigned as a major etiologic agent of the disease. Nonetheless, in the Southern hemisphere, an in-deep etiological survey on WD cases had not been carried out. This study aimed to survey for BCoV by nested-RT-PCR, rotavirus by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and ELISA, bacteria by classical bacteriological methods and PCR for virulence factors and parasites by sugar flotation test on fecal samples of 21 cows from a farm during an outbreak of WD in São Paulo state, Southeastern Brazil. BCoV was detected in all 21 samples, while rotavirus was detected in two symptomatic cows. Escherichia coli, Yersinia intermedia, Providencia rustigianii Proteus penneri, Klebsiella terrigena and Enterobacter aglomerans were detected in samples from both asymptomatic and healthy cows in different associations. The study of E. coli virulence factors revealed that the strains isolated were all apathogenic. Cysts of Eimeria sp. and eggs of Strongyloidea were detected at low numbers in four of the symptomatic cows, with one co-infestation. These results suggest BCoV as the main etiologic agent of the cases of WD in Brazil, a conclusion that, with the clinical and epidemiological patterns of the disease studied herein, match those already described elsewhere. These findings give basis to the development of preventive measures and contribute to the understanding of the etiology of WD.(AU)

Em vacas leiteiras, a disenteria de inverno (DI) é uma doença infecciosa sazonal mundialmente relatada que ocasiona uma marcada queda na produção de leite; no hemisfério Norte, onde a doença é classicamente reconhecida, o coronavirus bovino (BCoV) tem um importante papel como agente etiológico. Entretanto, no hemisfério Sul, pesquisas etiológicas aprofundadas em casos de DI nunca forma realizadas. Este estudo objetivou a pesquisa de BCoV utilizando nested-RT-PCR, rotavírus utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e ELISA, bactérias com métodos bacteriológicos clássicos e PCR para fatores de virulência e parasitas pela técnica de flutuação em açúcar em 21 amostras fecais de vacas de uma fazenda durante um surto de DI no estado de São Paulo, Sudeste do Brasil. BCoV foi encontrado em todas as 21 amostras, enquanto que rotavírus foi encontrado em duas vacas sintomáticas. Escherichia coli, Yersinia intermedia, Providencia rustigiani, Proteus penneri, Klebsiella terrigena e Enterobacter aglomerans foram encontradas tanto em amostras de vacas sintomáticas quanto assintomáticas. O estudo de fatores de virulência para E. coli revelou que as amostras isoladas eram todas apatogênicas. Cistos de Eimeria sp. e ovos de Strongyloidea foram encontrados em baixos números em quatro animais sintomáticos, com uma co-infestação. Tais resultados sugerem o BCoV como o principal agente etiológico em casos de DI no Brasil, uma conclusão que, somada aos padrões clínicos e epidemiológicos da doença aqui estudada, concordam com aqueles descritos em outras regiões. Estes achados fornecem base o desenvolvimento de medidas preventivas e também contribuem para o entendimento sobre a etiologia da DI.(AU)

Winter dysentery in cows associated with Bovine Coronavirus (BCoV) / Disenteria de inverno associada ao coronavírus bovino (BCoV) em vacas

Descreve-se a pesquisa de BCoV e rotavírus em 13 mostras fecais de vacas de surtos de disenteria utilizando uma nested PCR dirigida ao gene RdRp e PAGE, respectivamente. Todas as amostras fecais foram positivas para BCoV e nenhuma delas apresentou-se positiva para rotavírus em PAGE. O encontro de coronavírus bovino em amostras fecais de vacas com disenteria sugere que este vírus possa ser o agente primário envolvido na etiologia dos casos aqui relatados(AU)

Um enfoque multigênico para a genealogia comparada de Betacoronavirus em bovinos e equinos / A multigene approach for a compared genealogy of Betacoronavirus from cattle and horses

Gastroenterites são uma das causas mais comuns e importantes de morbidade e mortalidade entre animais neonatos e juvenis, em muitos casos, ocasionadas por uma infecção intestinal múltipla, sendo os principais agentes virais entéricos em bovinos o rotavírus e o coronavírus bovino (BCoV). O BCoV tem distribuição mundial e causa gastroenterites em bezerros, disenteria de inverno em bovinos adultos e processos patológicos respiratórios, enquanto que nos equinos os coronavírus causam enterocolite neonatal em potros. Considerando-se que o coronavírus bovino é mais estudado do que os coronavírus equinos, havendo possibilidade de transmissão interespécies, o presente trabalho teve por objetivo a comparação multigênica do coronavírus em bovinos adultos com disenteria de inverno e bezerros com diarréia neonatal e em equinos do Brasil, com base em sequências parciais dos genes codificadores das proteínas hemagluninina-esterase (HE), espícula (S) e nucleoproteína (N). Foram utilizadas amostras fecais de 11 vacas leiteiras de um surto de disenteria de inverno e de 27 equinos testadas quanto a presença de Betacoronavirus com uma RT-PCR dirigida ao gene RdRp; em seguida, as amostras positivas foram submetidas as reações parciais de PCR para os genes N, HE e S, e posterior sequenciamento e análise genealógica. Além destas amostras, foram utilizadas 15 amostras fecais de bezerros, já estudadas parcialmente quanto ao gene S, submetidas as reações de RT-PCR para N e HE, e posterior sequenciamento e análise genealógica. Sequências representativas da população em estudo foram obtidas para todos os genes. Pode-se concluir que a genealogia de amostras entéricas de BCoV detectadas em bovinos jovens e adultos é diretamente associada a padrões geográficos quando se consideram os genes S e HE, sendo a genealogia de menor resolução para os genes HE e nucleoproteína N, para a qual há uma tendência a segregação por faixa etária do hospedeiro e que equinos podem apresentar Betacoronavirus indistinguíveis daqueles encontrados em bovinos

Gastroenteritis is one of the leading causes of morbidity and mortality amongst young and newborn animals, often caused by multiple intestinal infections, being rotavirus and Bovine coronavirus (BCoV) the main viral causes in cattle. BCoV has a worldwide distribution and caused diarrhea in calves, winter dysentery in adult cattle and respiratory disease, while in horses coronaviruses lead to neonatal enterocolitis in foals. Taking into account that BCoV is more largely studied than equine coronaviruses and the possibility of interspecies transmission of these viruses, this research aimed to assess a multigenic comparison of coronaviruses from adult cattle with winter dysentery and calves with neonatal diarrhea as well as from equines, all from Brazil, based on partial sequences of the hemagglutinin-esterase (HE), spike (S) and nucleoprotein (N) genes. To this end, 11 samples from dairy cows with winter dysentery and 27 from horses were tested for Betacoronavirus using an RT-PCR targeted to the RdRp gene and the positive samples were next submitted to RT-PCRs to the partial amplification and sequencing of N, HE and S genes for genealogic analysis. Besides, 15 calves samples previously studied for the same S gene region were also submitted to the N and HE genes RT-PCRs and sequencing for genealogic analysis. Sequences representative of the population under study were obtained for all genes. It could be concluded that enteric BCoV genealogy from newborn and adult cattle is directly associated to geographic patterns when S and HE genes are taken into account, with a less-resolved genealogy for the HE and N genes, with a trend for an age-related segregation pattern for the last and also that horses might present Betacoronavirus undistinguishable from those found in cattle, a fact previously unknown

Isolation of bovine coronavirus (BCoV) in monolayers of HmLu-1 cells

Isolation of BCoV was performed in monolayers of HmLu-1 cells, using 20 fecal samples from clinical cases of diarrhea in calves. Samples were positive for BCoV by means of hemagglutination / hemagglutination inhibition (HA/HI). Up to the fifth serial passage, 13 of these isolates presented syncytial cytopathic effect, similar to Kakegawa standard strain. When isolates were submitted to seroneutralization with gammaglobulin anti-bovine coronavirus, 8 of them were considered to be positive, once cytopathic effect was neutralized. After titration and seroneutralization in microplates, only three of them were confirmed as positive. The lineage HmLu-1 showed higher permissivity to BCoV isolation, but the low intensity of viral replication demonstrated that new methodologies should be developed for this purpose and then submitted to confirmation of isolation by means of seroneutralization.

A partir de 20 amostras fecais de bezerros, com quadro clínico de diarréia, positivas para BCoV por hemaglutinação/inibição da hemaglutinação (HA/HI), procedeu-se o isolamento viral em monocamadas de células da linhagem HmLu-1. Até a quinta passagem seriada, 13 apresentaram efeito citopático do tipo sincicial, semelhante à amostra padrão Kakegawa de BCoV. Ao serem submetidas a uma reação de soroneutralização com gamaglobulina anti-coronavírus bovino, 8 delas foram consideradas positivas, uma vez que o efeito citopático foi neutralizado. Ao serem tituladas e submetidas à reação de soroneutralização em microplacas, apenas 3 delas puderam ser confirmadas como positivas. As células da linhagem HmLu-1 mostraram-se permissivas para o isolamento de BCoV, todavia a baixa intensidade na replicação viral demonstrou ser necessário o desenvolvimento de novas metodologias para se poder alcançar esse intuito e a confirmação do isolamento por soroneutralização.

Um estudo longitudinal da ocorrência de potenciais patógenos entéricos em fazendas com casos esporádicos e com casos recorrentes de diarréia em bezerros de corte / A longitudinal study on the occurrence of potential enteric pathogens in farms with recurrent and sporadic cases of diarrhea in beef calves

A diarréia em bezerros é comprovadamente uma das principais causas de perdas econômicas em rebanhos de corte, sendo os prejuízos diretamente derivados da redução do ganho de peso e custos com tratamento. Considerando-se que, para o delineamento de medidas profiláticas adequadas ao controle de uma doença é necessário o conhecimento de suas causas, o presente trabalho teve por objetivo estudar de modo longitudinal a freqüência de ocorrência de coronavírus bovino (BCoV), rotavírus do grupo A (RV-A), protozoários, helmintos e enterobactérias em uma propriedade com casos esporádicos e em outra com casos recorrentes de diarréia em bezerros. Investigou-se, ainda, a presença de genes codificadores de para as toxinas shiga-like 1 e 2 , para as adesinas K99 e F41 e para a intimina (eae) nas E. coli isoladas. Para a detecção de BCoV, utilizou-se uma nested-RT-PCR direcionada ao gene codificador da RNA polimerase RNA dependente, e para a detecção de RV-A utilizou-se ELISA direto duplo sanduíche. O isolamento e caracterização bioquímica das colônias de bactérias foram conduzidos de acordo com técnicas de bacteriologia clássica. A caracterização genotípica das colônias de E. coli isoladas foi realizada através de uma Multiplex-PCR, utilizando primers para os genes codificadores dos seguintes fatores de virulência: Stx1, Stx2, Sta, K99, F41 e eae. A detecção de parasitas foi realizada por centrífugo sedimentação em água-eter e centrífugo-flutuação em solução supersaturada de sacarose, considerando-se como resultado final do exame coproparasitológico todos os parasitas encontrados em ambas as técnicas em sua maior contagem. A freqüência de ocorrência de coronavírus bovino e rotavírus do grupo A foi baixa, restrita a animais com até quatro meses de idade, enquanto que protozoários, helmintos e enterobactérias apresentaram tendência crescente em freqüência relacionada à progressão da idade dos animais. Foram identificados os patotipos STEC, AEEC e um padrão atípico com os genes de K99 e eae. Além disso, encontrou-se associação entre baixo padrão sanitário e maior freqüência de ocorrência de Eimeria spp, Strongyloidea, Strongyloides spp, Trichuris spp e Escherichia coli portadora de fatores de virulência Stx1, Stx2, K99 e eae. O presente trabalho colabora para a caracterização da microbiota entérica de bezerros, mas mantém abertas as questões relativas às diferenças específicas entre as biotas entéricas de bezerros sadios e com diarréia, enfatizando a importância de se realizarem mais estudos que investiguem simultaneamente diversos enteropatógenos potenciais nestes animais

Diarrhea in calves is proved to be one of the main causes of economic loss in beef herds, which is direct originated by reduction of weight gain and increment of treatment costs. It is known that the determination of appropriate preventive measures to control a disease depends on the knowledge of its causes. In this manner, the present work aimed to study longitudinally the frequency of occurrence of bovine coronavirus (BCoV), group A rotavirus (RV-A), protozoa, helminths and enterobacteria in a beef farm presenting sporadic cases and other with recurrent cases of diarrhea. Moreover, the presence of genes that express the following virulence factors were investigated in the isolated E. coli: shiga-like toxins 1 and 2, adhesins K99 and F41 and intimin (eae). A nested-RT-PCR targeted to the RNA-dependent RNA polimerase gene was conducted to detect BCoV, and a double-sandwich direct ELISA was used to detect RV-A. Classical bacteriology techniques were used to isolate and indentify bacterial colonies. A Multiplex-PCR, with primers designed to previously described E. coli genes, was used to genotype these colonies. Centrifuge sedimentation in water-ether and centrifuge flotation in sucrose supersaturated solution were used to detect the presence of parasites. The final result was achieved by the highest count of all the parasites found. The observed frequency of occurrence of both BCoV and RV-A was low and restricted to animals up to 4 months of age whereas protozoa, helminths and enterobacteria showed an increasing tendency on its frequency related to progression of animals aging. STEC, AEEC and an atypical pathotype of E. coli, with K99 and eae genes were found. Moreover, an association between low sanitary pattern and a higher frequency of Eimeria spp, Strongyloidea, Strongyloides spp, Trichuris spp and Escherichia coli bearing Stx1, Stx2, K99 and eae genes was observed. The present study contributes to the characterization of calf enteric microbiota. However, the points related to the specific differences between healthy and diarrheic calves enteric microbiota remain unclear, emphasizing the importance of future studies to investigate different potential enteropathogens in beef calves simultaneously

Detecção simultânea de Coronavírus bovino e Rotavírus do grupo A em amostras fecais de bovinos utilizando uma multiplex hemi-nested RT-PCR / Simultaneous detection of bovine Coronavirus and group A Rotavirus in bovine fecal samples by a multiplex semi-nested RT-PCR

O coronavírus bovino (BCoV) e rotavírus (RV) são importantes agentes da diarréia neonatal bovina, causando grandes perdas econômicas. O BCoV é também responsável pela disenteria de inverno em vacas adultas e por desordens respiratórias e o RV possui um aspecto zoonótico de importância na saúde pública. Este estudo teve o objetivo de desenvolver uma multiplex hemi-nested RT-PCR para detecção simultânea de BCoV e RV do grupo A com a utilização de um controle interno. Para tanto, foram desenhados três primers dirigidos ao gene N de BCoV (306pb) e três primers dirigidos ao gene VP1 do RV do grupo A (228pb); para o controle interno, foram utilizados dois primers dirigidos ao mRNA do gene mitocondrial bovino ND5 (191pb). Foram utilizados como controles positivos a amostra Kakegawa de BCoV (título HA de 256), a amostra 8209 de rotavírus do grupo A (título viral de 101.66TCID50%/200µL) e suspensão de células MDBK para o controle interno. A extração de RNA foi realizada com o reagente comercial TRIzol, de acordo com as recomendações do fabricante. Foram realizados gradientes de temperatura para a determinação da temperatura ótima de hibridação para cada par de primers, resultando em 50ºC para PCR e 55ºC para a hemi-nested. Doze protocolos com diferentes concentrações de Taq DNA polymerase, MgCl2, primers e DNA-alvo foram testados. Para determinação do limiar de detecção, o protocolo final foi utilizado em diluições dos dois vírus em suspensão de amostras fecais negativas para BCoV e RV adicionadas de 10% de suspensão de células MDBK, obtendo o limiar de detecção de 10-8 para os dois vírus e aplicado em amostras fecais de bezerros (53) e vacas adultas (22). Todas as amostras foram previamente testadas para BCoV por uma nested RT-PCR dirigida ao gene RdPd, sendo 15 positivas, e para rotavírus pela PAGE, sendo 3 positivas. Para a multiplex, 15 amostras foram positivas para BCoV e 6 para rotavírus. O seqüenciamento de DNA das amostras positivas para multiplex demonstrou a especificidade do teste. Uma concordância ótima foi encontrada para BCoV (0,833) e substancial para rotavírus (0,648) calculada pela estatística kappa, comparando-se com os testes de referência. Estes resultados demonstram que a padronização da multiplex foi eficiente para a detecção de BCoV e RV, com elevadas sensibilidade e especificidade. Além disso, o diagnóstico simultâneo dos dois agentes permite um diagnóstico rápido e a um menor custo devido à utilização de reduzidas quantidades de reagentes e mão de obra, fornecendo uma importante ferramenta para o diagnóstico e estudo da etiologia da diarréia em bovinos

Bovine coronavirus (BCoV) and rotavirus (RV) are important agents of neonatal diarrhea in cattle, causing large economic losses. BCoV is also responsible for winter dysentery in adult cattle and respiratory disorders and RV has a zoonotic aspect of importance in public health. This study aimed to develop a multiplex hemi-nested RT-PCR for simultaneous detection of BCoV and RV of group A with an internal control. For this purpose, three primers were designed targeting the N gene of BCoV (306pb) and three primers targeting to the VP1 gene of group A RV (228pb); for internal control, two primers targeting to the mRNA of ND5 bovine mitochondrial gene (191pb) were used. Positive controls were BCoV Kakegawa strain (HA titer 256), group A bovine rotavirus strain 8209 (viral titer of 101.66TCID50%/200µL), and MDBK cells suspension for internal control. The RNA extraction was performed with the commercial reagent TRIzol. Temperature gradients were carried out for each primers pair for the determination of the optimal hybridization temperatures, resulting in 50°C for PCR and 55°C for the hemi-nested. Twelve protocols were tested with different concentrations of Taq DNA polymerase, MgCl2, primers and target DNA. The final protocol was used in 10-fold dilutions of the two viruses in suspension of fecal sample negative for BCoV and RV added to 10% of MDBK cells suspension, obtaining the detection limit of 10-8 for the two viruses, and applied to 75 fecal samples from calves (53) and cows (22). All samples were previously tested for BCoV by a nested RT-PCR to RdPd gene, being 15 positive; and for rotavirus by PAGE, being 3 positive. For multiplex, 15 samples were positive for BCoV and 6 for RV. The DNA sequencing of multiplex-positive samples substantiates the specificity of the test. A great agreement was found for BCoV (0.833) and substantial for RV (0.648) by calculating the kappa statistic in comparison to the reference tests. These results demonstrate that the multiplex standard was effective in the detection of BCoV and RV, with high sensitivity and specificity. In addition, simultaneous diagnosis of both agents allows a faster and at lower cost diagnosis due to use of smaller quantities of reagents and labor, providing an important tool for the diagnosis and study on the etiology of diarrhea in cattle

Epidemiologia molecular em um surto de disenteria de inverno em bovinos leiteiros adultos no Estado de São Paulo e descrição de genótipos para o Coronavírus bovino (BCoV) / Molecular epidemiology in an outbreak of winter dysentery in adult dairy cattle in the state of São Paulo and description of genotypes for Bovine coronavirus (BCoV)

O coronavírus bovino (BCoV) é classificado no Grupo 2 do gênero Coronavirus da ordem Nidovirales, família Coronaviridae, causando disenteria (disenteria de inverno) em bovinos adultos, diarréia em bezerros neonatos e processos respiratórios em bovinos adultos e jovens. No presente estudo, 21 amostras fecais de vacas leiteiras colhidas durante um surto de disenteria em uma propriedade de Paranapanema no Estado de São Paulo positivas para BCoV foram submetidas a reações de PCR para amplificação parcial dos genes codificadores das proteínas S (448pb) e HE (441pb) do BCoV. Destas amostras, 14 foram positivas para cada PCR (não simultaneamente), sendo os fragmentos amplificados submetidos a seqüenciamento de DNA para reconstrução genealógica por máxima parcimônia através de algoritmo heurístico em conjunto com seqüências homólogas recuperadas do GenBank. Considerando-se o gene S, a identidade de nucleotídeos entre as 14 amostras aqui estudadas foi de 100%, tendo as mesmas segregado em um grupo exclusivo; além disso, demais amostras brasileiras incluídas no estudo segregam em outros dois grupos. Em relação ao gene HE, as 14 amostras estudadas apresentaram identidade de nucleotídeos de 100%, mas a árvore genealógica apresentou topologia pouco resolvida, tendo estas amostras, segregado em grupo politômico com as seqüências homólogas incluídas. Comparações entre os diversos grupos nas árvores do gene S em termos de aminoácidos revelaram marcadores grupo-específicos, com substituições exclusivas para as amostras de BCoV aqui estudadas. Com base nestes resultados, conclui-se que, durante o transcorrer do surto de disenteria de inverno, uma única linhagem de BCoV estava presente, baseado no seqüenciamento parcial dos genes S e HE e que há pelo menos três genótipos de BCoV presentes no Brasil em relação ao gene S e ao menos um em relação ao gene HE, considerando-se as regiões gênicas e as seqüências incluídas no presente estudo

Bovine coronavirus (BCoV) is classified in group 2 of the genus Coronavirus, family Coronaviridae, order Nidovirales, and causes winter dysentery in adult bovine, neonatal calf diarrhea, and respiratory disorders in both adult and young bovine. In this investigation, 21 fecal samples from dairy cows collected during an outbreak of dysentery in a farm located at Paranapanema, São Paulo State, all positive to BCoV, were submitted to PCRs to partial amplification of genes S (448bp) and HE (441bp ) of BCoV. Fourteen out of these samples were positive for each PCR (not simultaneously) and the amplicons were submitted to DNA sequencing for genealogic reconstruction with maximum parsimony and heuristic algorithm with homologous sequences retrieved from the GenBank. Regarding S gene, the nucleotide identity among the 14 strains was 100% and these segregated in an exclusive cluster; furthermore, the other Brazilian strains included in the analysis segregated in other two clusters. Taking into account the HE gene, the 14 strains analyzed presented a nucleotide identity of 100%, but the genealogic tree showed a low-resolved topology, having these samples segregated in a polytomic cluster with the homologous sequences included. Amino acid comparisons among the different clusters in the trees of gene S revealed cluster-specific markers, with exclusive substitutions for the BCoV strains studied herein. Based on these results, one can conclude that, during the winter dysentery outbreak, a single BCoV lineage was involved based on partial S and HE genes sequences and that there are at least three genotypes of BCoV in Brazil regarding S gene and at least one regarding HE gene, taking into account the gene regions and the sequences included in this investigation

Diarreia neonatal por coronavírus bovino (BCoV) em rebanhos bovinos de corte / Neonatal diarrhea by bovine coronavirus (BCoV) in beef cattle herds

O coronavírus bovino (BCoV) é o segundo mais importante agente etiológico viral envolvido em diarreias neonatais em bezerros de todo o mundo. Os relatos sobre a frequência da infecção por BcoV em rebanhos bovinos de corte criados extensivamente são incomuns no Brasil. Este estudo analisou 93 amostras fecais diarreicas de bezerros de corte com até 60 dias de idade, provenientes de 13 rebanhos comerciais distribuídos nos estados de Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Paraná e Rondônia. As amostras fecais foram colhidas no período de 2009-2012 e haviam sido previamente analisadas quanto à presença de rotavírus bovino grupo A (BoRVA), com resultados negativos. A presença do BCoV nas amostras fecais foi avaliada por meio da amplificação parcial do gene N pela técnica da semi-nested PCR. Em 33,3% (31/93) das amostras analisadas foi possível a amplificação de produtos com tamanho de 251 pb esperados para o BCoV. Os resultados deste estudo demonstraram que a coronavirose tem importante participação no complexo diarreia neonatal em rebanhos bovinos de corte criados extensivamente em várias regiões brasileiras.

Bovine coronavirus (BCoV) is the second most important viral agent involved in neonatal diarrhea in calves worldwide. The reports on the frequency of BCoV infection in beef cattle herds under extensive management are uncommon in Brazil. The present study analyzed 93 diarrheic fecal samples of calves up to 60 days of age from 13 commercial beef cattle herds located in the states of Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Paraná, and Rondônia. The fecal samples were collected during 2009-2012 and were previously analyzed for the presence of bovine rotavirus group A (BoRVA), with negative results. The presence of BCoV in the fecal samples was evaluated by the partial amplification of the N gene by using the semi-nested PCR technique. The expected products of 251 bp length were amplified 33.3% (31/93) of the analyzed diarrheic fecal samples. The results revealed that coronaviruses has important participation in the neonatal diarrhea complex of beef cattle herds reared extensively from the different geographical regions of Brazil.