Pantoea ananatis in Oryza sativa in Brazil / Pantoea ananatis em Oryza sativa no Brasil

ABSTRACT: The state of Santa Catarina is the second-largest producer of rice seeds in Brazil. Research on phytopathogenicbacterias in this crop is scarce and the high frequency of panicle diseases leads to the hypothesis that seeds may be infected by bacteria. This research quantified the incidence of bacteria in the seeds, verified the bacteria viability during the storage period and characterized the associated bacteria. Seeds from the 2018/19 and 2019/20 seasons were analyzed. To check the incidence, the seeds were disinfected, plated on a nutrient agar + fungicide culture medium, and incubated for seven days at 27 °C. To assess viability, every 45 days, three cultivars stored in a processing unit were subjected to the same detection methodology. To characterize, prevalent colonies were isolated on semi-selective culture medium Pantoea genus-specific agar (PGSA), where the ones that showed growth were subjected to deoxyribonucleic acid (DNA) extraction and Polymerase Chain Reaction (PCR), DNA sequencing, and sequence comparison on GenBank. The hypersensitivity reaction (HR) in tobacco was performed using a bacterial suspension of each isolate. All seed samples had an average incidence of 83%. During storage, the seeds maintained stable bacterial viability, with an average incidence of 95% at the beginning of storage and 99% at the end of it. All isolates that grew in PGSA culture medium were identified by molecular characterization with 100% identity with two specimens of Pantoeaananatis and one of them induced RH in tobacco.

RESUMO: O estado de Santa Catarina é o segundo maior produtor de sementes de arroz do Brasil. As pesquisas com bactérias fitopatogênicas nesta cultura são escassas e a alta frequência de doenças da panícula leva à hipótese de que sementes podem estar infectadas por bactérias. O objetivo desta pesquisa foi quantificar a incidência de bactérias nas sementes, verificar a viabilidade das bactérias durante o período de armazenamento e caracterizar as bactérias associadas. Foram analisadas sementes das safras 2018/19 e 2019/20. Para verificar a incidência, as sementes foram desinfestadas, plaqueadas em meio de cultura ágar nutriente + fungicida e incubadas por sete dias a 27 °C. Para avaliar a viabilidade, a cada 45 dias, três cultivares armazenadas em uma unidade de beneficiamento foram submetidas à mesma metodologia de detecção. Para caracterizar, colônias prevalentes foram isoladas em meio de cultura semisseletivo Pantoea genus-specific ágar (PGSA), onde as que apresentaram crescimento foram submetidas à extração do ácido desoxirribonucléico (DNA) e Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), sequenciamento do DNA e comparação de sequências no GenBank. A reação de hipersensibilidade (HR) em tabaco foi realizada utilizando uma suspensão bacteriana de cada isolado. Todas as amostras de sementes apresentaram incidência média de 83%. Durante o armazenamento, as sementes mantiveram viabilidade bacteriana estável, com incidência média de 95% no início do armazenamento e 99% ao fim. Todos os isolados que cresceram no meio de cultura PGSA, foram identificados por caracterização molecular com 100% de identidade com dois espécimes de Pantoea ananatis e um deles induziu HR em tabaco.

Fixation of pfcrt chloroquine resistance alleles in Plasmodium falciparum clinical isolates collected from unrest tribal agencies of Pakistan

Abstract Plasmodium falciparum resistance to Chloroquine (CQ) is a significant cause of mortality and morbidity worldwide. There is a paucity of documented data on the prevalence of CQ-resistant mutant haplotypes of Pfcrt and Pfmdr1 genes from malaria-endemic war effected Federally Administered Tribal Areas of Pakistan. The objective of this study was to investigate the prevalence of P. falciparum CQ-resistance in this area. Clinical isolates were collected between May 2017 and May 2018 from North Waziristan and South Waziristan agencies of Federally Administrated Trial Area. Subsequently, Giemsa-stained blood smears were examined to detect Plasmodium falciparum. Extraction of malarial DNA was done from microscopy positive P. falciparum samples, and P. falciparum infections were confirmed by nested PCR (targeting Plasmodium small subunit ribosomal ribonucleic acid (ssrRNA) genes). All PCR confirmed P. falciparum samples were sequenced by pyrosequencing to find out mutation in Pfcrt gene at codon K76T and in pfmdr1 at codons N86Y, Y184F, N1042D, and D1246Y. Out of 121 microscopies positive P. falciparum cases, 109 samples were positive for P. falciparum by nested PCR. Pfcrt K76T mutation was found in 96% of isolates, Pfmdr1 N86Y mutation was observed in 20%, and 11% harboured Y184F mutation. All samples were wild type for Pfmdr1 codon N1042D and D1246Y. In the FATA, Pakistan, the frequency of resistant allele 76T remained high despite the removal of CQ. However, current findings of the study suggest complete fixation of P. falciparum CQ-resistant genotype in the study area.

Resumo A resistência do Plasmodium falciparum à cloroquina (CQ) é uma causa significativa de mortalidade e morbidade em todo o mundo. Há uma escassez de dados documentados sobre a prevalência de haplótipos mutantes CQ-resistentes dos genes Pfcrt e Pfmdr1 da guerra endêmica da malária em áreas tribais administradas pelo governo federal do Paquistão. O objetivo deste estudo foi investigar a prevalência de resistência a CQ de P. falciparum nesta área. Isolados clínicos foram coletados entre maio de 2017 e maio de 2018 nas agências do Waziristão do Norte e do Waziristão do Sul da Área de Ensaio Administrada Federalmente. Posteriormente, esfregaços de sangue corados com Giemsa foram examinados para detectar Plasmodium falciparum. A extração do DNA da malária foi feita a partir de amostras de P. falciparum positivas para microscopia, e as infecções por P. falciparum foram confirmadas por nested PCR (visando genes de ácido ribonucleico ribossômico de subunidade pequena de Plasmodium (ssrRNA)). Todas as amostras de P. falciparum confirmadas por PCR foram sequenciadas por pirosequenciamento para descobrir a mutação no gene Pfcrt no códon K76T e em pfmdr1 nos códons N86Y, Y184F, N1042D e D1246Y. De 121 microscopias de casos positivos de P. falciparum, 109 amostras foram positivas para P. falciparum por nested PCR. A mutação Pfcrt K76T foi encontrada em 96% dos isolados, a mutação Pfmdr1 N86Y foi observada em 20% e 11% abrigou a mutação Y184F. Todas as amostras eram do tipo selvagem para o códon N1042D e D1246Y de Pfmdr1. No FATA, Paquistão, a frequência do alelo resistente 76T permaneceu alta apesar da remoção de CQ. No entanto, as descobertas atuais do estudo sugerem a fixação completa do genótipo resistente a CQ de P. falciparum na área de estudo.

Pantoea ananatis in Oryza sativa in Brazil / Pantoea ananatis em Oryza sativa no Brasil

The state of Santa Catarina is the second-largest producer of rice seeds in Brazil. Research on phytopathogenicbacterias in this crop is scarce and the high frequency of panicle diseases leads to the hypothesis that seeds may be infected by bacteria. This research quantified the incidence of bacteria in the seeds, verified the bacteria viability during the storage period and characterized the associated bacteria. Seeds from the 2018/19 and 2019/20 seasons were analyzed. To check the incidence, the seeds were disinfected, plated on a nutrient agar + fungicide culture medium, and incubated for seven days at 27 °C. To assess viability, every 45 days, three cultivars stored in a processing unit were subjected to the same detection methodology. To characterize, prevalent colonies were isolated on semi-selective culture medium Pantoea genus-specific agar (PGSA), where the ones that showed growth were subjected to deoxyribonucleic acid (DNA) extraction and Polymerase Chain Reaction (PCR), DNA sequencing, and sequence comparison on GenBank. The hypersensitivity reaction (HR) in tobacco was performed using a bacterial suspension of each isolate. All seed samples had an average incidence of 83%. During storage, the seeds maintained stable bacterial viability, with an average incidence of 95% at the beginning of storage and 99% at the end of it. All isolates that grew in PGSA culture medium were identified by molecular characterization with 100% identity with two specimens of Pantoeaananatis and one of them induced RH in tobacco.

O estado de Santa Catarina é o segundo maior produtor de sementes de arroz do Brasil. As pesquisas com bactérias fitopatogênicas nesta cultura são escassas e a alta frequência de doenças da panícula leva à hipótese de que sementes podem estar infectadas por bactérias. O objetivo desta pesquisa foi quantificar a incidência de bactérias nas sementes, verificar a viabilidade das bactérias durante o período de armazenamento e caracterizar as bactérias associadas. Foram analisadas sementes das safras 2018/19 e 2019/20. Para verificar a incidência, as sementes foram desinfestadas, plaqueadas em meio de cultura ágar nutriente + fungicida e incubadas por sete dias a 27 °C. Para avaliar a viabilidade, a cada 45 dias, três cultivares armazenadas em uma unidade de beneficiamento foram submetidas à mesma metodologia de detecção. Para caracterizar, colônias prevalentes foram isoladas em meio de cultura semisseletivo Pantoea genus-specific ágar (PGSA), onde as que apresentaram crescimento foram submetidas à extração do ácido desoxirribonucléico (DNA) e Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), sequenciamento do DNA e comparação de sequências no GenBank. A reação de hipersensibilidade (HR) em tabaco foi realizada utilizando uma suspensão bacteriana de cada isolado. Todas as amostras de sementes apresentaram incidência média de 83%. Durante o armazenamento, as sementes mantiveram viabilidade bacteriana estável, com incidência média de 95% no início do armazenamento e 99% ao fim. Todos os isolados que cresceram no meio de cultura PGSA, foram identificados por caracterização molecular com 100% de identidade com dois espécimes de Pantoea ananatis e um deles induziu HR em tabaco.

Fixation of pfcrt chloroquine resistance alleles in Plasmodium falciparum clinical isolates collected from unrest tribal agencies of Pakistan / Fixação de alelos de resistência à cloroquina pfcrt em isolados clínicos de Plasmodium falciparum coletados de agitações de agências tribais do Paquistão

Plasmodium falciparum resistance to Chloroquine (CQ) is a significant cause of mortality and morbidity worldwide. There is a paucity of documented data on the prevalence of CQ-resistant mutant haplotypes of Pfcrt and Pfmdr1 genes from malaria-endemic war effected Federally Administered Tribal Areas of Pakistan. The objective of this study was to investigate the prevalence of P. falciparum CQ-resistance in this area. Clinical isolates were collected between May 2017 and May 2018 from North Waziristan and South Waziristan agencies of Federally Administrated Trial Area. Subsequently, Giemsa-stained blood smears were examined to detect Plasmodium falciparum. Extraction of malarial DNA was done from microscopy positive P. falciparum samples, and P. falciparum infections were confirmed by nested PCR (targeting Plasmodium small subunit ribosomal ribonucleic acid (ssrRNA) genes). All PCR confirmed P. falciparum samples were sequenced by pyrosequencing to find out mutation in Pfcrt gene at codon K76T and in pfmdr1 at codons N86Y, Y184F, N1042D, and D1246Y. Out of 121 microscopies positive P. falciparum cases, 109 samples were positive for P. falciparum by nested PCR. Pfcrt K76T mutation was found in 96% of isolates, Pfmdr1 N86Y mutation was observed in 20%, and 11% harboured Y184F mutation. All samples were wild type for Pfmdr1 codon N1042D and D1246Y. In the FATA, Pakistan, the frequency of resistant allele 76T remained high despite the removal of CQ. However, current findings of the study suggest complete fixation of P. falciparum CQ‑resistant genotype in the study area.

A resistência do Plasmodium falciparum à cloroquina (CQ) é uma causa significativa de mortalidade e morbidade em todo o mundo. Há uma escassez de dados documentados sobre a prevalência de haplótipos mutantes CQ-resistentes dos genes Pfcrt e Pfmdr1 da guerra endêmica da malária em áreas tribais administradas pelo governo federal do Paquistão. O objetivo deste estudo foi investigar a prevalência de resistência a CQ de P. falciparum nesta área. Isolados clínicos foram coletados entre maio de 2017 e maio de 2018 nas agências do Waziristão do Norte e do Waziristão do Sul da Área de Ensaio Administrada Federalmente. Posteriormente, esfregaços de sangue corados com Giemsa foram examinados para detectar Plasmodium falciparum. A extração do DNA da malária foi feita a partir de amostras de P. falciparum positivas para microscopia, e as infecções por P. falciparum foram confirmadas por nested PCR (visando genes de ácido ribonucleico ribossômico de subunidade pequena de Plasmodium (ssrRNA)). Todas as amostras de P. falciparum confirmadas por PCR foram sequenciadas por pirosequenciamento para descobrir a mutação no gene Pfcrt no códon K76T e em pfmdr1 nos códons N86Y, Y184F, N1042D e D1246Y. De 121 microscopias de casos positivos de P. falciparum, 109 amostras foram positivas para P. falciparum por nested PCR. A mutação Pfcrt K76T foi encontrada em 96% dos isolados, a mutação Pfmdr1 N86Y foi observada em 20% e 11% abrigou a mutação Y184F. Todas as amostras eram do tipo selvagem para o códon N1042D e D1246Y de Pfmdr1. No FATA, Paquistão, a frequência do alelo resistente 76T permaneceu alta apesar da remoção de CQ. No entanto, as descobertas atuais do estudo sugerem a fixação completa do genótipo resistente a CQ de P. falciparum na área de estudo.

Fixation of pfcrt chloroquine resistance alleles in Plasmodium falciparum clinical isolates collected from unrest tribal agencies of Pakistan / Fixação de alelos de resistência à cloroquina pfcrt em isolados clínicos de Plasmodium falciparum coletados de agitações de agências tribais do Paquistão

Plasmodium falciparum resistance to Chloroquine (CQ) is a significant cause of mortality and morbidity worldwide. There is a paucity of documented data on the prevalence of CQ-resistant mutant haplotypes of Pfcrt and Pfmdr1 genes from malaria-endemic war effected Federally Administered Tribal Areas of Pakistan. The objective of this study was to investigate the prevalence of P. falciparum CQ-resistance in this area. Clinical isolates were collected between May 2017 and May 2018 from North Waziristan and South Waziristan agencies of Federally Administrated Trial Area. Subsequently, Giemsa-stained blood smears were examined to detect Plasmodium falciparum. Extraction of malarial DNA was done from microscopy positive P. falciparum samples, and P. falciparum infections were confirmed by nested PCR (targeting Plasmodium small subunit ribosomal ribonucleic acid (ssrRNA) genes). All PCR confirmed P. falciparum samples were sequenced by pyrosequencing to find out mutation in Pfcrt gene at codon K76T and in pfmdr1 at codons N86Y, Y184F, N1042D, and D1246Y. Out of 121 microscopies positive P. falciparum cases, 109 samples were positive for P. falciparum by nested PCR. Pfcrt K76T mutation was found in 96% of isolates, Pfmdr1 N86Y mutation was observed in 20%, and 11% harboured Y184F mutation. All samples were wild type for Pfmdr1 codon N1042D and D1246Y. In the FATA, Pakistan, the frequency of resistant allele 76T remained high despite the removal of CQ. However, current findings of the study suggest complete fixation of P. falciparum CQ‑resistant genotype in the study area.(AU)

A resistência do Plasmodium falciparum à cloroquina (CQ) é uma causa significativa de mortalidade e morbidade em todo o mundo. Há uma escassez de dados documentados sobre a prevalência de haplótipos mutantes CQ-resistentes dos genes Pfcrt e Pfmdr1 da guerra endêmica da malária em áreas tribais administradas pelo governo federal do Paquistão. O objetivo deste estudo foi investigar a prevalência de resistência a CQ de P. falciparum nesta área. Isolados clínicos foram coletados entre maio de 2017 e maio de 2018 nas agências do Waziristão do Norte e do Waziristão do Sul da Área de Ensaio Administrada Federalmente. Posteriormente, esfregaços de sangue corados com Giemsa foram examinados para detectar Plasmodium falciparum. A extração do DNA da malária foi feita a partir de amostras de P. falciparum positivas para microscopia, e as infecções por P. falciparum foram confirmadas por nested PCR (visando genes de ácido ribonucleico ribossômico de subunidade pequena de Plasmodium (ssrRNA)). Todas as amostras de P. falciparum confirmadas por PCR foram sequenciadas por pirosequenciamento para descobrir a mutação no gene Pfcrt no códon K76T e em pfmdr1 nos códons N86Y, Y184F, N1042D e D1246Y. De 121 microscopias de casos positivos de P. falciparum, 109 amostras foram positivas para P. falciparum por nested PCR. A mutação Pfcrt K76T foi encontrada em 96% dos isolados, a mutação Pfmdr1 N86Y foi observada em 20% e 11% abrigou a mutação Y184F. Todas as amostras eram do tipo selvagem para o códon N1042D e D1246Y de Pfmdr1. No FATA, Paquistão, a frequência do alelo resistente 76T permaneceu alta apesar da remoção de CQ. No entanto, as descobertas atuais do estudo sugerem a fixação completa do genótipo resistente a CQ de P. falciparum na área de estudo.(AU)

Fixation of pfcrt chloroquine resistance alleles in Plasmodium falciparum clinical isolates collected from unrest tribal agencies of Pakistan / Fixação de alelos de resistência à cloroquina pfcrt em isolados clínicos de Plasmodium falciparum coletados de agitações de agências tribais do Paquistão

Abstract Plasmodium falciparum resistance to Chloroquine (CQ) is a significant cause of mortality and morbidity worldwide. There is a paucity of documented data on the prevalence of CQ-resistant mutant haplotypes of Pfcrt and Pfmdr1 genes from malaria-endemic war effected Federally Administered Tribal Areas of Pakistan. The objective of this study was to investigate the prevalence of P. falciparum CQ-resistance in this area. Clinical isolates were collected between May 2017 and May 2018 from North Waziristan and South Waziristan agencies of Federally Administrated Trial Area. Subsequently, Giemsa-stained blood smears were examined to detect Plasmodium falciparum. Extraction of malarial DNA was done from microscopy positive P. falciparum samples, and P. falciparum infections were confirmed by nested PCR (targeting Plasmodium small subunit ribosomal ribonucleic acid (ssrRNA) genes). All PCR confirmed P. falciparum samples were sequenced by pyrosequencing to find out mutation in Pfcrt gene at codon K76T and in pfmdr1 at codons N86Y, Y184F, N1042D, and D1246Y. Out of 121 microscopies positive P. falciparum cases, 109 samples were positive for P. falciparum by nested PCR. Pfcrt K76T mutation was found in 96% of isolates, Pfmdr1 N86Y mutation was observed in 20%, and 11% harboured Y184F mutation. All samples were wild type for Pfmdr1 codon N1042D and D1246Y. In the FATA, Pakistan, the frequency of resistant allele 76T remained high despite the removal of CQ. However, current findings of the study suggest complete fixation of P. falciparum CQ-resistant genotype in the study area.

Resumo A resistência do Plasmodium falciparum à cloroquina (CQ) é uma causa significativa de mortalidade e morbidade em todo o mundo. Há uma escassez de dados documentados sobre a prevalência de haplótipos mutantes CQ-resistentes dos genes Pfcrt e Pfmdr1 da guerra endêmica da malária em áreas tribais administradas pelo governo federal do Paquistão. O objetivo deste estudo foi investigar a prevalência de resistência a CQ de P. falciparum nesta área. Isolados clínicos foram coletados entre maio de 2017 e maio de 2018 nas agências do Waziristão do Norte e do Waziristão do Sul da Área de Ensaio Administrada Federalmente. Posteriormente, esfregaços de sangue corados com Giemsa foram examinados para detectar Plasmodium falciparum. A extração do DNA da malária foi feita a partir de amostras de P. falciparum positivas para microscopia, e as infecções por P. falciparum foram confirmadas por nested PCR (visando genes de ácido ribonucleico ribossômico de subunidade pequena de Plasmodium (ssrRNA)). Todas as amostras de P. falciparum confirmadas por PCR foram sequenciadas por pirosequenciamento para descobrir a mutação no gene Pfcrt no códon K76T e em pfmdr1 nos códons N86Y, Y184F, N1042D e D1246Y. De 121 microscopias de casos positivos de P. falciparum, 109 amostras foram positivas para P. falciparum por nested PCR. A mutação Pfcrt K76T foi encontrada em 96% dos isolados, a mutação Pfmdr1 N86Y foi observada em 20% e 11% abrigou a mutação Y184F. Todas as amostras eram do tipo selvagem para o códon N1042D e D1246Y de Pfmdr1. No FATA, Paquistão, a frequência do alelo resistente 76T permaneceu alta apesar da remoção de CQ. No entanto, as descobertas atuais do estudo sugerem a fixação completa do genótipo resistente a CQ de P. falciparum na área de estudo.

Evaluation of eight protocols for genomic DNA extraction of Hypostomus commersoni Valenciennes, 1836 (Loricariidae: Siluriformes) / Avaliação de oito protocolos na extração de DNA genômico de Hypostomus commersoni Valenciennes, 1836 (Loricariidae: Siluriformes)

The principle and the techniques applied in DNA extraction play a pivotal role in the obtention of a purified genetic material. The present study investigates the efficiency of eight protocols in the DNA extraction of Hypostomus commersoni, an essential component of South American freshwater ichthyofauna. The quality of samples was assessed through spectrophotometry, gel electrophoresis, and PCR-RAPD markers amplification. The efficiency of DNA extraction was influenced both by the method applied and the target-tissue of choice. Higher concentrations and yield of DNA were obtained from ocular tissue, with a positive spectrum of incubation in lysis buffer for up to 36 hours after sample collection, using fresh tissues and in the presence of a high concentration of Proteinase K (20 mg.ml-1). In these conditions, samples were successfully amplified. To date, there is no record of description for the parameters analyzed in this work, neither the description of RAPD markers for the species H. commersoni.(AU)

Os princípios e as técnicas aplicadas na extração de DNA desempenham um papel crucial na obtenção de material genético purificado. O presente estudo investiga a eficiência de oito protocolos na extração de DNA de Hypostomus commersoni, um importante componente ictiofaunístico de riachos da América do Sul. A qualidade das amostras foi avaliada por espectrofotometria, eletroforese em gel e amplificação por marcadores de PCR-RAPD. A eficiência da extração de DNA foi influenciada tanto pelo método aplicado quanto pelo tecido-alvo de escolha. Maiores concentrações e rendimento de DNA foram obtidos a partir do tecido ocular, com um espectro positivo de incubação em tampão de lise por até 36 horas após a coleta da amostra, utilizando tecidos frescos e na presença de alta concentração de proteinase K (20 mg.ml-1). Nestas condições, as amostras foram amplificadas com sucesso. Até o momento, não há registro de descrição para os parâmetros analisados neste trabalho, nem a descrição de marcadores RAPD para a espécie H. commersoni.(AU)

Polymerase chain reaction using conjunctival swab samples for detecting Leishmania DNA in dogs / Reação em cadeia da polimerase usando amostras de Swab de conjuntiva para detecção de DNA de Leishmania em cães

The dog is the main domestic reservoir of Leishmania and font of infection for the vector, constituting an important host for the transmission of the parasite to humans. Non-invasive collection of swab samples for leishmaniasis diagnosis has been a promising alternative. This study analyzed the positivity of polymerase chain reaction (PCR) for the diagnosis of canine leishmaniasis in conjunctiva samples. DNA extraction was performed using SDS 20% and PCR was performed using 13A/13B primers that amplify 120-bp of Leishmania kDNA. Of the 77 dogs analyzed, 50 (64.93%) had ocular changes: 25 (32.47%) dogs had periocular lesion, 41 (53.25%) dogs had purulent eye discharge, and 17 (22.08%) dogs had both signals. PCR was positive in 35 dogs (45.45%), and there was no significant difference between dogs with and without ocular signals (p=0.4074). PCR positivity was significant higher in dogs without periocular injury (p=0.0018). Conjunctive PCR, a less invasive, fast, and painless collection technique, is indicated to complement the diagnosis, especially in dogs without periocular injury, independent of the presence of purulent eye discharge.(AU)

O cão é o principal reservatório doméstico de Leishmania e também fonte de infecção para o vetor, constituindo um importante hospedeiro para a transmissão do parasita ao homem. A coleta não invasiva de amostras em swab para diagnóstico das leishmanioses tem sido uma alternativa promissora. Este estudo analisou a positividade da reação em cadeia da polimerase (PCR) para o diagnóstico de leishmaniose canina em amostras de conjuntiva. A extração do DNA foi realizada com SDS 20%. A PCR foi realizada com primers 13A/13B que amplificam 120-pb do kDNA de Leishmania. Dos 77 cães analisados, 50 (64,93%) tiveram alterações oculares; 25 (32,47%) cães tiveram uma lesão periocular; 41 (53,25%) tiveram secreção ocular purulenta e 17 (22,08%) cães tiveram ambos os sinais. A PCR foi positiva em 35 cães (45,45%) e não houve diferença significativa em cães com e sem sinais oculares (p = 0,4074). A positividade da PCR foi significativamente maior em cães sem lesão periocular (p = 0,0018). PCR em conjuntiva, uma técnica de coleta menos invasiva, rápida e indolor, é indicada para complementar o diagnóstico, principalmente em cães sem lesão periocular, independentemente da presença de secreção ocular purulenta.(AU)

Polymerase chain reaction using conjunctival swab samples for detecting Leishmania DNA in dogs / Reação em cadeia da polimerase usando amostras de Swab de conjuntiva para detecção de DNA de Leishmania em cães

Abstract The dog is the main domestic reservoir of Leishmania and font of infection for the vector, constituting an important host for the transmission of the parasite to humans. Non-invasive collection of swab samples for leishmaniasis diagnosis has been a promising alternative. This study analyzed the positivity of polymerase chain reaction (PCR) for the diagnosis of canine leishmaniasis in conjunctiva samples. DNA extraction was performed using SDS 20% and PCR was performed using 13A/13B primers that amplify 120-bp of Leishmania kDNA. Of the 77 dogs analyzed, 50 (64.93%) had ocular changes: 25 (32.47%) dogs had periocular lesion, 41 (53.25%) dogs had purulent eye discharge, and 17 (22.08%) dogs had both signals. PCR was positive in 35 dogs (45.45%), and there was no significant difference between dogs with and without ocular signals (p=0.4074). PCR positivity was significant higher in dogs without periocular injury (p=0.0018). Conjunctive PCR, a less invasive, fast, and painless collection technique, is indicated to complement the diagnosis, especially in dogs without periocular injury, independent of the presence of purulent eye discharge.

Resumo O cão é o principal reservatório doméstico de Leishmania e também fonte de infecção para o vetor, constituindo um importante hospedeiro para a transmissão do parasita ao homem. A coleta não invasiva de amostras em swab para diagnóstico das leishmanioses tem sido uma alternativa promissora. Este estudo analisou a positividade da reação em cadeia da polimerase (PCR) para o diagnóstico de leishmaniose canina em amostras de conjuntiva. A extração do DNA foi realizada com SDS 20%. A PCR foi realizada com primers 13A/13B que amplificam 120-pb do kDNA de Leishmania. Dos 77 cães analisados, 50 (64,93%) tiveram alterações oculares; 25 (32,47%) cães tiveram uma lesão periocular; 41 (53,25%) tiveram secreção ocular purulenta e 17 (22,08%) cães tiveram ambos os sinais. A PCR foi positiva em 35 cães (45,45%) e não houve diferença significativa em cães com e sem sinais oculares (p = 0,4074). A positividade da PCR foi significativamente maior em cães sem lesão periocular (p = 0,0018). PCR em conjuntiva, uma técnica de coleta menos invasiva, rápida e indolor, é indicada para complementar o diagnóstico, principalmente em cães sem lesão periocular, independentemente da presença de secreção ocular purulenta.

First detection of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes in the Mearim River Watershed, Maranhão State, Brazil / Primeira detecção de patótipos diarreiogênicos de Escherichia coli na Bacia Hidrográfica do Rio Mearim, Estado do Maranhão, Brasil

The Mearim River Watershed has multiple uses e.g. leisure, navigation, fishing and subsistence agriculture and constitutes the main source of supply for the populations of municipalities situated along its course. In addition to being a water supply source, the existence of the 'pororoca' (tidal bore) effect in a stretch of the lower course of the Mearim River attracts people from several Brazilian states and different countries, as it offers excellent conditions for surfing in fresh water. In this respect, given the importance of the watershed, this study was developed to report the detection of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes in a stretch of the lower course of the Mearim River, located in the state of Maranhão, Brazil. Thirty water samples were collected from 10 sampling points. To quantify E. coli, the chromogenic enzymatic system was used and positive samples were isolated and biochemically identified. Pure cultures underwent DNA extraction by heating followed by polymerase chain reaction (PCR) characterization. At the time of the collections, an observation schedule was used to record information on the existence of rearing of livestock and domestic animals; businesses; residences; and fruit and vegetable farming on the riverbanks. The samples were analyzed for the mean populations of E. coli, which ranged from 444 to 2,585 MPN mL-1. Twenty bacterial isolates were identified and the diarrheal pathotypes ETEC, typical EPEC and atypical EPEC were detected. The detection of these pathotypes can represent an epidemiological risk and compromise several uses of this water resource, such as irrigation of fruits and vegetables consumed raw, fishing, animal watering and recreation. Structural investments in basic sanitation are essential to minimize environmental degradation resulting from anthropic activities and to act preventively in public health. In addition, the recovery of riparian forests along the watershed and the maintenance of vegetation in these areas are measures to reduce the transport of particles from the soil to the watercourses, improving the qualitative and quantitative characteristics of this water resource.(AU)

A Bacia Hidrográfica do Rio Mearim apresenta múltiplos usos - lazer, navegação, pesca e agricultura de subsistência - e constitui a principal fonte de abastecimento para as populações dos municípios inseridos em seu curso. Além de fonte hídrica de abastecimento, a existência do efeito pororoca em um trecho do baixo curso do Rio Mearim atrai pessoas de vários estados brasileiros e diferentes países, pois apresenta excelentes condições para a prática de surfe em água doce. Nesse sentido, considerando a importância da Bacia Hidrográfica, objetivou-se relatar a detecção de patótipos diarreiogênicos de Escherichia coli em um trecho do baixo curso do rio Mearim, localizado no estado do Maranhão. Para isso, foram realizadas coletas de 30 amostras de água em 10 pontos amostrais. Para a quantificação de E. coli utilizou-se o sistema cromogênico enzimático e das amostras positivas procedeu-se ao isolamento e identificação bioquímica dos isolados. A extração do DNA das culturas puras foi realizada por aquecimento seguido da caracterização por reação em cadeia da polimerase (PCR). No momento das coletas utilizou-se uma pauta de observação para anotação de informações sobre a existência de criação de animais de interesse pecuário e doméstico, empreendimentos comerciais, residências e cultivo de frutas e hortaliças nas margens do rio. Nas amostras analisadas, foram quantificadas populações médias de E. coli que variaram de 444 a 2.585 NMP.mL-1, identificados 20 isolados bacterianos e detectados os patótipos diarreiogênicos ETEC, EPEC-típica e EPEC-atípica. A detecção destes patótipos pode representar risco epidemiológico e compromete diversos usos desse recurso hídrico, como a irrigação de frutas e hortaliças ingeridas cruas, pesca, dessedentação animal e recreação. Investimentos estruturais em saneamento básico são fundamentais para minimizar a degradação ambiental resultante das atividades antrópicas e para atuar preventivamente na saúde pública. Adicionalmente, a recuperação das matas ciliares ao longo da Bacia Hidrográfica e manutenção da vegetação nestas áreas são medidas para a redução do transporte de partículas do solo para os cursos d'água, e em consequência, acarretará na melhoria das características quali-quantitativas desse recurso hídrico.(AU)

Presença de Mollicutes e Mycoplasma bovis em swabs nasais de bezerros e na secreção mastítica de vacas / Presence of Mollicutes and Mycoplasma bovis in nasal swabs from calves and in mastitic secretion from cows / Presencia de Mollicutes e Mycoplasma bovis en hisopos nasalses de terneros y secrecion de mastitis de vacas

Mycoplasma bovis faz parte da microbiota do trato respiratório bovino, mas é considerado um patógeno oportunista de extrema importância nas doenças respiratórias de bezerros. Causa ao rebanho diversas doenças como mastite, poliartrite, pneumonia e endometrite. Esse patógeno é altamente contagioso e os animais com mastite são potenciais disseminadores da infecção para o rebanho, pois liberam de 106a 108UFC por mL de leite. Da mesma forma, animais com pneumonia eliminam, por meio de secreções respiratórias, altas cargas microbianas do agente. O presente estudo teve como objetivo realizar a detecção molecular de Mycoplasma bovis em 185 amostras de secreção mastítica de vacas, bem como em 50 amostras de swab nasal de bezerros saudáveis com ou sem sinais de pneumonia e nascidos de vacas com mastite, pertencentes a quatro fazendas leiteiras do estado do Paraná, onde foram diagnosticados casos de mastite. A extração do DNA de ambas as secreções foi realizada pelo método de termólise. Para a reação em cadeia da polimerase (PCR), primers genéricos foram empregados para amplificar o DNA dos Mollicutes e as amostras positivas foram submetidas à PCR com primers específicos para M. bovis. A positividade para M. bovis foi de 3,78% nas amostras de secreção mastítica, independente da fazenda, e de 20% nos swabs nasais.

Mycoplasma bovis is part of the bovine respiratory tract microbiota but is considered an opportunistic pathogen of extreme importance in respiratory diseases of calves. It causes to the herd several diseases such as mastitis, polyarthritis, pneumonia and endometritis. This pathogen is highly contagious and animals with mastitis are potential disseminators of infection to the herd since they release from 106 to 108CFU per mL milk. Similarly, animals with pneumonia eliminate, through respiratory secretions, high microbial loads of the agent. The present study aimed to perform molecular detection of Mycoplasma bovis in 185 milk samples from cows with clinical mastitis, as well as in 50 nasal swab samples from healthy calves with or without signs of pneumonia and born from cows with mastitis, all belonging to four dairy farms in Paraná State, where cases of mastitis had been diagnosed. DNA extraction from both secretions was carried out according to the thermolysis method. For polymerase chain reaction (PCR), generic primers were employed to amplify the Mollicutes DNA and positive samples were subjected to PCR with primers specific for M. bovis. Positivity for M. bovis was 3.78% in mastitic samples, regardless of the farm, and 20% in nasal swabs.

Mycoplasma bovis forma parte de la microbiota del tracto respiratorio bovino, pero se considera un patógeno oportunista de extrema importancia en las enfermedades respiratorias de los terneros. Provoca en el rebaño diversas enfermedades como mastitis, poliartritis, neumonía y endometritis. Este patógeno es altamente contagioso y los animales con mastitis son potenciales diseminadores de la infección al hato, ya que liberan de 106 a 108 UFC por ml de leche. Asimismo, los animales con neumonía eliminan, através de secreciones respiratorias, altas cargas microbianas del agente. El presente estudio tuvo como objetivo realizar la detección molecular de Mycoplasma bovis en 185 muestras de secretion de mastitis de vacas con mastitis clínica, así como en 50 muestras de hisopos nasales de terneros sanos con o sin signos de neumonía y nacidos de vacas con mastitis, todos pertenecientes a cuatro granjas lecheras en el estado de Paraná, donde se diagnosticaron casos de mastitis. La extracción de ADN de ambas secreciones se realizó mediante el método de termólisis. Para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se utilizaron cebadores genéricos para amplificar el ADN de los Mollicutes y las muestras positivas se sometieron a PCR con cebadores específicos para M. bovis. La positividad para M. bovis fue del 3,78% en muestras de mastitis, independientemente de la granja, y del 20% en hisopos nasales.

Presença de Mollicutes e Mycoplasma bovis em swabs nasais de bezerros e na secreção mastítica de vacas / Presence of Mollicutes and Mycoplasma bovis in nasal swabs from calves and in mastitic secretion from cows / Presencia de Mollicutes e Mycoplasma bovis en hisopos nasalses de terneros y secrecion de mastitis de vacas

Mycoplasma bovis faz parte da microbiota do trato respiratório bovino, mas é considerado um patógeno oportunista de extrema importância nas doenças respiratórias de bezerros. Causa ao rebanho diversas doenças como mastite, poliartrite, pneumonia e endometrite. Esse patógeno é altamente contagioso e os animais com mastite são potenciais disseminadores da infecção para o rebanho, pois liberam de 106a 108UFC por mL de leite. Da mesma forma, animais com pneumonia eliminam, por meio de secreções respiratórias, altas cargas microbianas do agente. O presente estudo teve como objetivo realizar a detecção molecular de Mycoplasma bovis em 185 amostras de secreção mastítica de vacas, bem como em 50 amostras de swab nasal de bezerros saudáveis com ou sem sinais de pneumonia e nascidos de vacas com mastite, pertencentes a quatro fazendas leiteiras do estado do Paraná, onde foram diagnosticados casos de mastite. A extração do DNA de ambas as secreções foi realizada pelo método de termólise. Para a reação em cadeia da polimerase (PCR), primers genéricos foram empregados para amplificar o DNA dos Mollicutes e as amostras positivas foram submetidas à PCR com primers específicos para M. bovis. A positividade para M. bovis foi de 3,78% nas amostras de secreção mastítica, independente da fazenda, e de 20% nos swabs nasais.(AU)

Mycoplasma bovis is part of the bovine respiratory tract microbiota but is considered an opportunistic pathogen of extreme importance in respiratory diseases of calves. It causes to the herd several diseases such as mastitis, polyarthritis, pneumonia and endometritis. This pathogen is highly contagious and animals with mastitis are potential disseminators of infection to the herd since they release from 106 to 108CFU per mL milk. Similarly, animals with pneumonia eliminate, through respiratory secretions, high microbial loads of the agent. The present study aimed to perform molecular detection of Mycoplasma bovis in 185 milk samples from cows with clinical mastitis, as well as in 50 nasal swab samples from healthy calves with or without signs of pneumonia and born from cows with mastitis, all belonging to four dairy farms in Paraná State, where cases of mastitis had been diagnosed. DNA extraction from both secretions was carried out according to the thermolysis method. For polymerase chain reaction (PCR), generic primers were employed to amplify the Mollicutes DNA and positive samples were subjected to PCR with primers specific for M. bovis. Positivity for M. bovis was 3.78% in mastitic samples, regardless of the farm, and 20% in nasal swabs.(AU)

Mycoplasma bovis forma parte de la microbiota del tracto respiratorio bovino, pero se considera un patógeno oportunista de extrema importancia en las enfermedades respiratorias de los terneros. Provoca en el rebaño diversas enfermedades como mastitis, poliartritis, neumonía y endometritis. Este patógeno es altamente contagioso y los animales con mastitis son potenciales diseminadores de la infección al hato, ya que liberan de 106 a 108 UFC por ml de leche. Asimismo, los animales con neumonía eliminan, através de secreciones respiratorias, altas cargas microbianas del agente. El presente estudio tuvo como objetivo realizar la detección molecular de Mycoplasma bovis en 185 muestras de secretion de mastitis de vacas con mastitis clínica, así como en 50 muestras de hisopos nasales de terneros sanos con o sin signos de neumonía y nacidos de vacas con mastitis, todos pertenecientes a cuatro granjas lecheras en el estado de Paraná, donde se diagnosticaron casos de mastitis. La extracción de ADN de ambas secreciones se realizó mediante el método de termólisis. Para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se utilizaron cebadores genéricos para amplificar el ADN de los Mollicutes y las muestras positivas se sometieron a PCR con cebadores específicos para M. bovis. La positividad para M. bovis fue del 3,78% en muestras de mastitis, independientemente de la granja, y del 20% en hisopos nasales.(AU)

DNA extraction methods for molecular detection of Eimeria spp. in cattle and sheep

ABSTRACT: Molecular detection of Eimeria species in fecal samples can be useful for experimental and diagnostic purposes. However, the parasite quantity presence in feces and the oocyst wall are an obstacle in DNA extraction protocols. Therefore, adequate sampling and effective disruption of the oocysts are essential to improve the accuracy of DNA detection by PCR. The aims of this study were to evaluate the suitability of six protocols for DNA extraction from Eimeria spp. present in bovine and sheep. Twenty pools of fecal samples from cattle (10 pools) and sheep (10 pools) were distributed to six DNA extraction protocols: commercial kit, commercial kit with modification, DNAzol, cetyl-trimethyl ammonium bromide (CTAB), glass beads and commercial kit for fecal samples. Fecal samples were submitted to DNA extraction and PCR. Among the protocols tested, CTAB was determined to be most suitable for DNA extraction from oocysts (90% of DNA detection by PCR); DNAzol and CTAB resulted in higher DNA detection from bovine samples (80%). CTAB and commercial kit with modification improved PCR detection of Eimeria spp. in sheep samples, with positive amplification of DNA in all tested samples.

RESUMO: A detecção molecular de espécies de Eimeria em amostras fecais pode ser útil para fins experimentais e de diagnóstico. No entanto, a quantidade de parasitas nas fezes e a parede do oocisto são um obstáculo nos protocolos de extração de DNA. Portanto, uma amostragem adequada e a ruptura efetiva dos oocistos são essenciais para melhorar a precisão da detecção de DNA por PCR. Os objetivos deste estudo foram avaliar seis protocolos para extração de DNA de Eimeria spp. em amostras de bovinos e ovinos. Foram distribuídos 20 grupos de amostras fecais de bovinos (10 grupos) e ovinos (10 grupos) em seis protocolos de extração de DNA: kit comercial, kit comercial com modificação, DNAzol, brometo de cetil-trimetil amônio (CTAB), pérolas de vidro e kit comercial para amostras fecais. As amostras fecais foram submetidas à extração de DNA e PCR. Entre os protocolos testados, CTAB foi considerado o mais adequado para extração de DNA de oocistos (90% de detecção de DNA por PCR); DNAzol e CTAB resultaram em maior detecção de DNA em amostras de bovinos (80%). CTAB e kit comercial com modificação melhoraram a detecção por PCR de Eimeria spp. em amostras de ovinos, amplificação positiva de DNA em todas as amostras testadas.

Evaluation of eight protocols for genomic DNA extraction of Hypostomus commersoni Valenciennes, 1836 (Loricariidae: Siluriformes)

Abstract The principle and the techniques applied in DNA extraction play a pivotal role in the obtention of a purified genetic material. The present study investigates the efficiency of eight protocols in the DNA extraction of Hypostomus commersoni, an essential component of South American freshwater ichthyofauna. The quality of samples was assessed through spectrophotometry, gel electrophoresis, and PCR-RAPD markers amplification. The efficiency of DNA extraction was influenced both by the method applied and the target-tissue of choice. Higher concentrations and yield of DNA were obtained from ocular tissue, with a positive spectrum of incubation in lysis buffer for up to 36 hours after sample collection, using fresh tissues and in the presence of a high concentration of Proteinase K (20 mg.ml-1). In these conditions, samples were successfully amplified. To date, there is no record of description for the parameters analyzed in this work, neither the description of RAPD markers for the species H. commersoni.

Resumo Os princípios e as técnicas aplicadas na extração de DNA desempenham um papel crucial na obtenção de material genético purificado. O presente estudo investiga a eficiência de oito protocolos na extração de DNA de Hypostomus commersoni, um importante componente ictiofaunístico de riachos da América do Sul. A qualidade das amostras foi avaliada por espectrofotometria, eletroforese em gel e amplificação por marcadores de PCR-RAPD. A eficiência da extração de DNA foi influenciada tanto pelo método aplicado quanto pelo tecido-alvo de escolha. Maiores concentrações e rendimento de DNA foram obtidos a partir do tecido ocular, com um espectro positivo de incubação em tampão de lise por até 36 horas após a coleta da amostra, utilizando tecidos frescos e na presença de alta concentração de proteinase K (20 mg.ml-1). Nestas condições, as amostras foram amplificadas com sucesso. Até o momento, não há registro de descrição para os parâmetros analisados neste trabalho, nem a descrição de marcadores RAPD para a espécie H. commersoni.

DNA extraction methods for molecular detection of Eimeria spp. in cattle and sheep / Métodos de extração de DNA para detecção molecular de Eimeria spp. em bovinos e ovinos

Molecular detection of Eimeria species in fecal samples can be useful for experimental and diagnostic purposes. However, the parasite quantity presence in feces and the oocyst wall are an obstacle in DNA extraction protocols. Therefore, adequate sampling and effective disruption of the oocysts are essential to improve the accuracy of DNA detection by PCR. The aims of this study were to evaluate the suitability of six protocols for DNA extraction from Eimeria spp. present in bovine and sheep. Twenty pools of fecal samples from cattle (10 pools) and sheep (10 pools) were distributed to six DNA extraction protocols: commercial kit, commercial kit with modification, DNAzol, cetyl-trimethyl ammonium bromide (CTAB), glass beads and commercial kit for fecal samples. Fecal samples were submitted to DNA extraction and PCR. Among the protocols tested, CTAB was determined to be most suitable for DNA extraction from oocysts (90% of DNA detection by PCR); DNAzol and CTAB resulted in higher DNA detection from bovine samples (80%). CTAB and commercial kit with modification improved PCR detection of Eimeria spp. in sheep samples, with positive amplification of DNA in all tested samples.(AU)

A detecção molecular de espécies de Eimeria em amostras fecais pode ser útil para fins experimentais e de diagnóstico. No entanto, a quantidade de parasitas nas fezes e a parede do oocisto são um obstáculo nos protocolos de extração de DNA. Portanto, uma amostragem adequada e a ruptura efetiva dos oocistos são essenciais para melhorar a precisão da detecção de DNA por PCR. Os objetivos deste estudo foram avaliar seis protocolos para extração de DNA de Eimeria spp. em amostras de bovinos e ovinos. Foram distribuídos 20 grupos de amostras fecais de bovinos (10 grupos) e ovinos (10 grupos) em seis protocolos de extração de DNA: kit comercial, kit comercial com modificação, DNAzol, brometo de cetil-trimetil amônio (CTAB), pérolas de vidro e kit comercial para amostras fecais. As amostras fecais foram submetidas à extração de DNA e PCR. Entre os protocolos testados, CTAB foi considerado o mais adequado para extração de DNA de oocistos (90% de detecção de DNA por PCR); DNAzol e CTAB resultaram em maior detecção de DNA em amostras de bovinos (80%). CTAB e kit comercial com modificação melhoraram a detecção por PCR de Eimeria spp. em amostras de ovinos, amplificação positiva de DNA em todas as amostras testadas.(AU)

Molecular survey of Cryptosporidium spp. in calves from the state of Mato Grosso, Brazil / Levantamento molecular de Cryptosporidium spp. em bezerros do estado de Mato Grosso, Brasil

Cryptosporidium spp. is a protozoan that infects a wide range of vertebrate hosts; it has been reported to be the cause of severe illness or death in livestock worldwide, which leads to decreased performance and production losses, especially in young animals. This study investigated the presence of Cryptosporidiumin calves from beef farms in the state of Mato Grosso, midwestern Brazil. For this purpose, fecal samples from 237 animals aged ≤ 45 days, raised in 20 rural properties were subjected to DNA extraction and nested polymerase chain reaction (nPCR) targeting 18S ribosomal RNA (18S rRNA) gene followed by sequencing. Additionally, positive samples, previously identified as Cryptosporidium parvum by sequencing and phylogenetic analyses based on 18S rRNA gene, were subsequently analyzed focusing the amplification and sequencing using nPCR of a fragment of the 60 kDa glycoprotein (gp60) gene. Of the 237 fecal samples analyzed by PCR (18S rRNA), 50 (21.1%) fecal samples were positive for Cryptosporidium spp., while 14 (70%) of the 20 properties had at least one positive animal. The following Cryptosporidium species were detected: C. bovis, C. parvum, and C. ryanae. Thereafter, two potentially zoonotic subtypes (IIaA15G2R1 and IIaA16G3R1) of C. parvum were identified based on gp60 gene sequences. This study resulted in the detection of subtype IIaA16G3R1 for the first time in South America and showed a wide distribution of the protozoan in beef farms in the studied area of the State.

Cryptosporidium spp. é um protozoário que infecta uma grande variedade de hospedeiros vertebrados, sendo descrito como causa de doenças graves ou morte na pecuária em todo o mundo, o que leva à diminuição do desempenho e à perda de produção, especialmente em animais jovens. Este estudo investigou a presença de Cryptosporidium em bezerros de fazendas de bovinocultura de corte no estado de Mato Grosso, Centro-Oeste do Brasil. Para esse fim, amostras fecais de 237 animais com idade ≤ 45dias, criados em 20 propriedades rurais foram submetidas à extração de DNA e uma "nested" da reação em cadeia pela polimerase (nPCR) direcionada ao gene 18S RNA ribossomal (18S rRNA), seguido do sequenciamento. Adicionalmente, amostras positivas, previamente identificadas como Cryptosporidium parvum pelo sequenciamento e análises filogenéticas baseadas no gene 18S rRNA, foram posteriormente analisadas usando a nPCR buscando a amplificação e sequenciamento de um fragmento do gene de uma glicoproteína de 60 kDa (gp60). Das 237 amostras fecais analisadas pela PCR (18S rRNA), 50 (21,1%)amostras fecais foram positivas para Cryptosporidium spp., enquanto 14 (70%) das 20 propriedades tinham ao menos um animal positivo. As seguintes espécies de Cryptosporidium foram detectadas: C. bovis, C. parvum e C. ryanae. Posteriormente, dois subtipos potencialmente zoonóticos (IIaA15G2R1e IIaA16G3R1) foram identificados. Este estudo resultou na detecção do subtipo IIaA16G3R1 pela primeira vez na América do Sul e mostrou uma ampla distribuição do protozoário em rebanhos de corte na área estudada do Estado.

Molecular survey of Cryptosporidium spp. in calves from the state of Mato Grosso, Brazil / Levantamento molecular de Cryptosporidium spp. em bezerros do estado de Mato Grosso, Brasil

Cryptosporidium spp. is a protozoan that infects a wide range of vertebrate hosts; it has been reported to be the cause of severe illness or death in livestock worldwide, which leads to decreased performance and production losses, especially in young animals. This study investigated the presence of Cryptosporidiumin calves from beef farms in the state of Mato Grosso, midwestern Brazil. For this purpose, fecal samples from 237 animals aged ≤ 45 days, raised in 20 rural properties were subjected to DNA extraction and nested polymerase chain reaction (nPCR) targeting 18S ribosomal RNA (18S rRNA) gene followed by sequencing. Additionally, positive samples, previously identified as Cryptosporidium parvum by sequencing and phylogenetic analyses based on 18S rRNA gene, were subsequently analyzed focusing the amplification and sequencing using nPCR of a fragment of the 60 kDa glycoprotein (gp60) gene. Of the 237 fecal samples analyzed by PCR (18S rRNA), 50 (21.1%) fecal samples were positive for Cryptosporidium spp., while 14 (70%) of the 20 properties had at least one positive animal. The following Cryptosporidium species were detected: C. bovis, C. parvum, and C. ryanae. Thereafter, two potentially zoonotic subtypes (IIaA15G2R1 and IIaA16G3R1) of C. parvum were identified based on gp60 gene sequences. This study resulted in the detection of subtype IIaA16G3R1 for the first time in South America and showed a wide distribution of the protozoan in beef farms in the studied area of the State.(AU)

Cryptosporidium spp. é um protozoário que infecta uma grande variedade de hospedeiros vertebrados, sendo descrito como causa de doenças graves ou morte na pecuária em todo o mundo, o que leva à diminuição do desempenho e à perda de produção, especialmente em animais jovens. Este estudo investigou a presença de Cryptosporidium em bezerros de fazendas de bovinocultura de corte no estado de Mato Grosso, Centro-Oeste do Brasil. Para esse fim, amostras fecais de 237 animais com idade ≤ 45dias, criados em 20 propriedades rurais foram submetidas à extração de DNA e uma "nested" da reação em cadeia pela polimerase (nPCR) direcionada ao gene 18S RNA ribossomal (18S rRNA), seguido do sequenciamento. Adicionalmente, amostras positivas, previamente identificadas como Cryptosporidium parvum pelo sequenciamento e análises filogenéticas baseadas no gene 18S rRNA, foram posteriormente analisadas usando a nPCR buscando a amplificação e sequenciamento de um fragmento do gene de uma glicoproteína de 60 kDa (gp60). Das 237 amostras fecais analisadas pela PCR (18S rRNA), 50 (21,1%)amostras fecais foram positivas para Cryptosporidium spp., enquanto 14 (70%) das 20 propriedades tinham ao menos um animal positivo. As seguintes espécies de Cryptosporidium foram detectadas: C. bovis, C. parvum e C. ryanae. Posteriormente, dois subtipos potencialmente zoonóticos (IIaA15G2R1e IIaA16G3R1) foram identificados. Este estudo resultou na detecção do subtipo IIaA16G3R1 pela primeira vez na América do Sul e mostrou uma ampla distribuição do protozoário em rebanhos de corte na área estudada do Estado.(AU)

Genetic diversity of Lippia rotundifolia Cham. in Minas Gerais, Brazil

Lippia rotundifolia is an aromatic species, endemic from Campos rupestres and isolated by mountains. We aimed with the research to study the genetic variability of chá-de-pedestre (Lippia rotundifolia Cham.) with natural occurrence in ten places of the State of Minas Gerais, from molecular markers of ISSR type. The places of collection were: Parque Estadual de Serra Nova; Parque Estadual Veredas do Peruaçu; Abóboras community; Gigante community; edge of Rio do Peixe; environmental preservation area of Olhos d´água; private property in Joaquim Felício; Parque Estadual do Rio Preto; São Gonçalo do Rio das Pedras and brook of Rio Tigre. After the establishment of the extraction and amplification of DNA fragments with primers ISSR, an array of genetic distance was built. From this matrix, we analyzed the genetic diversity index as the allelic frequency (Na and Ne), Shannos´s index (H´), polymorphism (PLP), heterozygosity (He) and gene flow (Nm). The result showed higher genetic variability within the population (93%). The genetic diversity index was low (He = 0.132; H´= 0.214; Na = 1.111; Ne = 1.183; PLP = 56.67%). In general the species have low genetic diversity. The greatest diversity in populations occurred with an average temperature of 20°C. The Rio Tigre showed higher genetic distance and isolation.

Genetic diversity of Lippia rotundifolia Cham. in Minas Gerais, Brazil

Lippia rotundifolia is an aromatic species, endemic from Campos rupestres and isolated by mountains. We aimed with the research to study the genetic variability of chá-de-pedestre (Lippia rotundifolia Cham.) with natural occurrence in ten places of the State of Minas Gerais, from molecular markers of ISSR type. The places of collection were: Parque Estadual de Serra Nova; Parque Estadual Veredas do Peruaçu; Abóboras community; Gigante community; edge of Rio do Peixe; environmental preservation area of Olhos d´água; private property in Joaquim Felício; Parque Estadual do Rio Preto; São Gonçalo do Rio das Pedras and brook of Rio Tigre. After the establishment of the extraction and amplification of DNA fragments with primers ISSR, an array of genetic distance was built. From this matrix, we analyzed the genetic diversity index as the allelic frequency (Na and Ne), Shannos´s index (H´), polymorphism (PLP), heterozygosity (He) and gene flow (Nm). The result showed higher genetic variability within the population (93%). The genetic diversity index was low (He = 0.132; H´= 0.214; Na = 1.111; Ne = 1.183; PLP = 56.67%). In general the species have low genetic diversity. The greatest diversity in populations occurred with an average temperature of 20°C. The Rio Tigre showed higher genetic distance and isolation.(AU)

Comparison of three protocols to preserve Leptospira spp. in cat urine for efficient DNA extraction and PCR amplification

Background: The pathogenic leptospira infection in mammalian species can cause a range of acute or chronic manifestations and may result in a carrier state. Previous studies have suggested that cats were resistant to acute leptospirosis however, the description of some clinical cases suggests that Leptospira spp. may also be pathogenic to this species. Recentstudies have shown that leptospires may be shed in the urine of infected cats. Endogenous substances present in urine mayinhibit PCR and allow leptospires to evade detection. This study aims to compare three protocols for sample processingto optimize the detection of pathogenic leptospires in cat urine.Materials, Methods & Results: Three protocols to optimize the detection of pathogenic leptospires in cat urine were tested.Aliquots of standard concentration of L. interrogans serovar Canicola culture were added to urine samples to achieveconcentrations of 1×105 to 1×102 leptospires/mL for each protocol. In protocols A and B the urine was neutralized by theaddition of phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4, in a proportion of 1 PBS: 2.5 urine (v/v). In protocol A, PBS wasadded to neutralize the urine pH for the leptospiral organisms immediately after addition of leptospires. In protocol B,PBS was added just before DNA extraction. In protocol C, no PBS was added. DNA extraction was performed at 4, 24and 48 h after addition of the leptospires using a modified protocol. Samples were incubated at 37ºC for 10 min. Sampleswere then centrifuged (850 g) for 15 min, at 25ºC. The supernatants were transferred to another tube, and the pellets werediscarded. The supernatants were centrifuged (16060 g) for 20 min at 4ºC. The supernatants were then discarded, and thepellets resuspended and washed with 1000 µL of PBS. All the samples were centrifuged at 16060 g for an additional 20min at 25ºC. The supernatants were discarded and the pellets were resuspended in 100 µL of PBS and incubated at 94ºCfor...(AU)