Adaptação da tecnologia do ovário artificial para os animais silvestres / Adaptation of the artificial ovary technology for wild animals

A biodiversidade mundial tem sido consideravelmente reduzida nos últimos anos, principalmente devido as modificações antrópicas nos habitats. Como consequência, tem-se observado um rápido e contínuo declínio das espécies mamíferas silvestres. Nesse contexto, a biotécnica “Ovário Artificial”, surge como uma ferramenta para a conservação da biodiversidade, pois tem como objetivo a manipulação in vitro de oócitos inclusos em folículos préantrais visando o seu crescimento e maturação, além da preservação de oócitos por meio do resfriamento e/ou criopreservação, permitindo o fornecimento de milhares de oócitos, que poderão ser utilizados posteriormente. Este artigo de revisão descreve os aspectos gerais, importância e avanços do ovário artificial em animais silvestres.(AU)

The world biodiversity has declined in recent years, mainly due to anthropogenic changes in habitats. As consequence, a rapid and steady decline in wild mammalian species is observed. In this context, the "Artificial Ovary" biotechnology emerges as a tool for the biodiversity conservation, since its objective is the in vitro manipulation of oocytes enclosed in preantral follicles, aiming their growth and maturation, as well as their preservation by cooling and / or cryopreservation, allowing the supply of thousands of oocytes, which can be further used. This review describes the general aspects, importance and advances of the artificial ovary in wild animals.(AU)

Adaptação da tecnologia do ovário artificial para os animais silvestres / Adaptation of the artificial ovary technology for wild animals

A biodiversidade mundial tem sido consideravelmente reduzida nos últimos anos, principalmente devido as modificações antrópicas nos habitats. Como consequência, tem-se observado um rápido e contínuo declínio das espécies mamíferas silvestres. Nesse contexto, a biotécnica “Ovário Artificial”, surge como uma ferramenta para a conservação da biodiversidade, pois tem como objetivo a manipulação in vitro de oócitos inclusos em folículos préantrais visando o seu crescimento e maturação, além da preservação de oócitos por meio do resfriamento e/ou criopreservação, permitindo o fornecimento de milhares de oócitos, que poderão ser utilizados posteriormente. Este artigo de revisão descreve os aspectos gerais, importância e avanços do ovário artificial em animais silvestres.

The world biodiversity has declined in recent years, mainly due to anthropogenic changes in habitats. As consequence, a rapid and steady decline in wild mammalian species is observed. In this context, the "Artificial Ovary" biotechnology emerges as a tool for the biodiversity conservation, since its objective is the in vitro manipulation of oocytes enclosed in preantral follicles, aiming their growth and maturation, as well as their preservation by cooling and / or cryopreservation, allowing the supply of thousands of oocytes, which can be further used. This review describes the general aspects, importance and advances of the artificial ovary in wild animals.

The role of androgens in mammals folliculogenesis / Papel dos andrógenos na foliculogênese em mamíferos

Introduction: Steroid hormones production is a physiological process termed steroidogenesis. An important stage of this process is the conversion of androgens into estrogens through aromatase enzyme. Furthermore, androgens are important in the process of folliculogenesis, promoting follicular growth in different species. Thus, the aim of this review was to present the process of synthesis, mechanism of action, and importance of androgens in folliculogenesis. Additionally, the main results of in vitro culture of ovarian cells in the presence of these hormones were emphasized. Review: Folliculogenesis begins in prenatal life in most of species and can be defined as the process of formation, follicular growth, and oocyte maturation. Preantral follicles represent 95% of the follicular population and assisted reproductive technologies have been developed (e.g., Manipulation of Oocytes Enclosed in Preantral Follicles - MOEPF) in order to avoid the great follicle loss that occurs naturally in vivo by atresia. The MOEPF aim to obtain a large number of competent oocytes from preantral follicles and then subject to in vitro maturation, fertilization, and culture for embryo production. However, the development of an efficient medium to ensure the follicular survival and oocyte maturation is the major challenge of this biotechnology. To achieve the success on in vitro culture, the effects [...](AU)

The role of androgens in mammals folliculogenesis / Papel dos andrógenos na foliculogênese em mamíferos

Introduction: Steroid hormones production is a physiological process termed steroidogenesis. An important stage of this process is the conversion of androgens into estrogens through aromatase enzyme. Furthermore, androgens are important in the process of folliculogenesis, promoting follicular growth in different species. Thus, the aim of this review was to present the process of synthesis, mechanism of action, and importance of androgens in folliculogenesis. Additionally, the main results of in vitro culture of ovarian cells in the presence of these hormones were emphasized. Review: Folliculogenesis begins in prenatal life in most of species and can be defined as the process of formation, follicular growth, and oocyte maturation. Preantral follicles represent 95% of the follicular population and assisted reproductive technologies have been developed (e.g., Manipulation of Oocytes Enclosed in Preantral Follicles - MOEPF) in order to avoid the great follicle loss that occurs naturally in vivo by atresia. The MOEPF aim to obtain a large number of competent oocytes from preantral follicles and then subject to in vitro maturation, fertilization, and culture for embryo production. However, the development of an efficient medium to ensure the follicular survival and oocyte maturation is the major challenge of this biotechnology. To achieve the success on in vitro culture, the effects [...]

CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO DE FOLÍCULOS OVARIANOS PRE-ANTRAIS DE FETOS BOVINOS E CULTIVO IN VITRO DE TECIDO OVARIANO ASSOCIADO A PROTEÍNA MORFOGENÉTICA ÓSSEA 9

Aumentaraeficácia docultivo invitrodefolículos pré-antrais aindaéum grandedesafio pois as condições dedesenvolvimentoin vivoenvolvemdiversos fatores ainda desconhecidos.Paraisso,são necessárias pesquisas visando aperfeiçoar esimplificarametodologia eas condições decultivo durante as várias etapas do processo. Diante destesmotivos, esta tesecompõe-sedetrês capítulos, quetiveram como objetivo principal avaliar o desenvolvimento in vitrodefolículos pré-antrais de fetos bovinos inclusos em fragmentos, em meios decultivo suplementados com aproteína morfogenéticaóssea9 (BMP-9) em três concentrações (50, 100 e200 ng/ml) durante 7 dias. Oprimeirocapítuloabordaconsideraçõesgerais referentesaostemas abordadosnos demais capítulos. Osegundo capítuloobjetivoucaracterizar apopulação folicularpré-antraldefetos bovinos, paraservirem dereferênciaparao experimento descritono terceiro capitulo. Estepropôs um meio decultivo parasuportarocrescimento defolículos pré-antrais defetos bovinos. Adicionou-seaproteína morfogenéticaóssea9(BMP-9) aomeio e mensurou-seseus efeitos nas característicashistológicas enasobrevivência eviabilidadein vitrodefolículos pré-antrais bovinos.Concluímosquefetos bovinosapartir dequatro meses deidadeapresentam população defolículos pré-antraisformadacom processos deativaçãofolicularassociados,podendoser utilizados em biotecnias. Concluiu-setambém queaadição de50ng/ml deBMP-9 aomeio decultivoexerceumaação benéficanapreservação daviabilidadedefolículos primordiais,além deumefeito inibitório na ativação folicular durante o período de cultivo.

Increasing the efficiencyof in vitro cultureofpreantral follicles is stillamajorchallengeas in vivo development conditions involve several unknown factors.For this purpose, itis necessaryresearches aimingto improveand simplifythemethodologyandconditions of cellcultureduringthe various stages of theprocess. Dueto thesereasons, thisthesis is composed ofthreechapters, that had as main objectiveto evaluatethein vitrodevelopment of preantral follicles of bovine fetuses included in fragments, in culturemediasupplemented with bonemorphogeneticprotein 9 (BMP-9) at threeconcentrations (50, 100and 200 ng/ml) for 7 days. Thefirstchapter addresses general considerations regarding the topics covered in the other chapters. Thesecond chapteraimed to characterizehistologicallythe ovariandevelopment of bovine fetuses, analyzingthemorphological and quantitativeaspects of thefollicularpopulation, to serveas referenceforthe experiment described in the final chapter. This proposed aculturemedium tosupport the growth of preantral follicles of bovine fetuses.Bonemorphogeneticprotein 9(BMP-9) was added tothe medium anditseffects on the histological characteristics and survival and in vitro viabilityof bovine preantralfollicles weremeasured.Weconclude that bovinefetuses from the ageoffour months presentapopulation ofpreantralfollicles formed with associated follicular activation processes,andcan beused in biotechniques. It was also concluded that the addition of 50 ng/mlof BMP-9 to the culturemedium exerts abeneficial effect in preservingthe viabilityof primordial follicles, in addition to an inhibitoryeffect on follicular activation during the cultureperiod.

Caracterização e criopreservação de folículos ovarianos pré-antrais de jumentas da raça nordestina

Os jumentos (Equus asinus) são animais historicamente relevantes para a ocupação de áreas inóspitas em todo o mundo, mas tem perdido espaço devido à modernização dos centros urbanos e a mecanização agrícola e transporte motorizado. Assim, muitas raças de jumentos já foram extintas ou encontram-se em rápido processo de queda populacional, e dentre elas está a raça Nordestina, endêmica do Brasil. Uma das estratégias de conservação é o uso de biotecnologias que favoreçam a reprodução assistida, como a manipulação de oócitos inclusos em folículos pré-antrais (MOIFOPA) que maximiza a disponibilidade de oócitos para outras biotécnicas. O ponto de partida para o uso desta e outras biotécnicas é conhecer detalhes da fisiologia reprodutiva e dos gametas da espécie ou raça que se deseja manipular. O objetivo desta tese é caracterizar e conservar por meio da vitrificação a população de folículos ovarinos pré-antrais (FP) em fêmeas asininas da raça Nordestina. No primeiro experimento, dez fêmeas com idade média de 5,1 ± 3,2 anos e peso médio de 105,2 ± 18,6 kg, constituíram o grupo de estudo. As mesmas foram submetidas a procedimento de ovariectomia guiada por laparoscopia para coleta dos ovários. Assim como nos demais equídeos, os ovários das jumentas apresentam formato reniforme e suas zonas parenquimatosa, incluindo a fossa ovariana, foram extraídas. Fragmentos do ovário foram fixados com carnoy, desidratados com etanol em concentrações crescentes (70 a 99%), clarificados usando xilol e finalmente inclusos em blocos de parafina histológica. Estes blocos foram sequencialmente seccionados em micrótomo em frações de 7m. Uma a cada 120 frações foi montada em lâminas de vidro e corada com hematoxilina-eosina e lida em microscópio ótico. Os FPs que apresentaram núcleo visível foram fotografados, mensurados com uso de software e classificados como primordiais, primários e secundários. Os FPs classificados e contados foram identificados como normais ou degenerados. A população de FPs foi estimada usando a fórmula: (número de PF observados × número total de secções × espessura das secções) dividido pelo (número de secções observadas × diâmetro médio do núcleo dos oócitos). A população média estimada foi de 21.135,3 ± 10.646,1 FPs por animal. Destes, 91,3% foram identificados como primordiais, 8,2% como folículos primários e 0,4% como secundários. Folículos com múltiplos oócitos foram observados em todos os animais, todos classificados como primordiais, representando 0,99% do total de folículos. A população de PF estimada estava distribuída entre os ovários direito e esquerdo, em 54,6% e 45,4% respectivamente. A maior parte dos PFs foi considerada morfologicamente normal (90,2%) e a menor parcela, degenerados (9,8%). Foi identificada uma relação inversamente proporcional entre a idade e a população folicular, semelhante à relação entre peso e população folicular. No segundo experimento, o tecido ovariano de jumentas foram submetidos a procedimento de vitrificação em superfície sólida usando dimetil sulfóxido (DMSO) e etileno glicol (EG), isoladamente em diferentes concentrações (3M e 6M) e associados, como agentes crioprotetores. Quando comparados aos tratamentos o uso do DMSO 3M (81,7 ± 37,5%), EG 3M (83,7 ± 27,4%) e a combinação de DMSO 3M + EG 3M (81,8 ± 46,8%) apresentaram um grande percentual de folículos morfologicamente normais. O uso do DMSO 3M + EG 3M, apresentou o maior percentual (62,5 ± 29,1%) de folículos viáveis em relação aos demais tratamentos (P <0,05). Pela técnica TUNEL, todos os tratamentos apresentaram fragmentação de DNA nas células foliculares, exceto no caso do DMSO 3M + EG 3M. Quando avaliada a presença de NORs, não foi verificada diferenças significativas entre o número de NORs no grupo controle e no tratamento DMSO 3M + EG 3M (P < 0,05). A combinação DMSO 3M e EG 3M mostrou-se mais eficiente para a vitrificação de tecido ovariano de jumentas, apresentando-se de forma adequada para a preservação da morfologia e viabilidade de folículos pré antrais, bem como a integridade do DNA e a capacidade de proliferação celular. Este trabalho apresentou de forma inédita a estimativa de folículos pré-antrais ovarianos em jumentas da raça nordestina bem como uma estratégia de criopreservação com resultados positivos.

The donkeys (Equus asinus) are individuals historically relevant for the occupation of inhospitable areas around the world, but they have been losing importance due to the modernization of urban centers and the creation of traction and cultivation technologies. Due to this fact, many donkey breeds are already extinct or passing through a rapid process of population decrease. Among these breeds, the Northeast donkey, an endemic breed in Brazil, is highlighted. One of the strategies for conservation is the use of biotechnologies that facilitate reproduction, such as the manipulation of oocytes enclosed in preantral follicles (MOEPF) that maximize the availability of oocytes for in vitro fertilization. The starting point for the use of this and other techniques are known reproductive physiology details of this breed as the characteristics of their gametes. The objective of this study was to estimate and to characterize the population of ovarian PFs derived from Northeast breed donkeys. Twenty females aging 5.1 ± 3.2 years and weighing 105.2 ± 18.6 kg were used. Animals were subjected to an ovariectomy procedure guided by laparoscopy for ovary collection. As the equines, donkey ovaries presented a kidney form and their parenchymal zone were extracted, taking the ovulation fossa as basis. Fragments of ovary were fixed in Carnoy, dehydrated in increasing Ethanol concentrations (70 to 99%), clarified using xylene and finally included in histological paraffin wax blocks. These blocks were serially sectioned on 7 m slices at using a microtome. Every 120th slice was mounted on glass slides, stained with hematoxylineosin and read in inverted optical microscope. PFs presenting visible oocyte nuclei were measured at using an ocular micrometer and classified as primordial, primary or secondary. PFs were also classified and counted as morphologically normal, when containing an oocyte with regular shape and uniform cytoplasm, and organized layers of granulosa cells; or as degenerated, when the oocyte exhibited pycnotic nucleus and/or ooplasm shrinkage, and occasionally, granulosa cell layers became disorganized, detached from the basement membrane and/or included enlarged cells. The PF population was estimated by using the formula: (number of follicles × number of sections × thickness of sections)/(number of sections observed × range of oocyte nuclei diameter). The results allowed us to estimate a total population of 21,135.3 ± 10,646.1 PFs per animal. From this population, 91.3% PFs were classified as primordial, 8.2% PFs as primary, and 0.3% as secondary. multioocyte PFs were observed in all animals, and they were more frequently present in primordial follicles, representing 0.99% of total PFs counted. The estimated population was distributed between the right and left ovaries, at 54.6% and 45.4%, respectively. Most PFs were considered morphologically normal (90.2%) and the smallest, degenerate (9.8%). An inversely proportional relationship between age and follicular population was identified, similarly to the relation between weight and follicular population. In the second experiment, the ovarian tissue of animals from the same group was subjected to a vitrification procedure using dimethylsulfoxide (DMSO) and ethylene glycol (EG) as cryoprotectants in separate and associated. When comparing treatments, the use of DMSO 3M (81.7 ± 37.5%), EG 3M (83.7 ± 27.4%) and the combination of both DMSO 3M + EG 3M (81.8 ± 46.8%) allowed a greater percentage of follicular survival. When vitrified using the DMSO + EG combination, a higher percentage (62.5 ± 29.1%) of viable follicles was observed in relation to the other vitrification treatments (P <0.05). The TUNEL technique identified that all treatments tested showed DNA fragmentation in the follicular cells, except in the case of the DMSO 3M plus EG 3M treatment. When evaluating the presence of NORs, no significant differences were observed in the amount of NORs between the fresh and vitrified groups using DMSO 3M plus EG 3M (P >0.05). Thus, we concluded that the combination DMSO 3M plus EG was more efficient for the vitrification of ovarian tissue taken from Equus asinus, allowing adequate preservation of PAFS morphology, viability, DNA integrity and cell proliferative capacity. This work presented for the first time the estimate of ovarian preantral follicles in donkeys of the Northeastern breed and successful vitrification.

Potencial do cultivo in vitro e do xenotransplante na sobrevida e no desenvolvimento de folículos ovarianos pré-antrais em matrizes de ruminantes domésticos em risco de morte: revisão de literatura / Potential of in vitro culture and xenotransplantation on surviving and development of ovarian preantral follicles in ruminant females at risk of death: a review

A presente revisão aborda os principais avanços do cultivo in vitro e do xenotransplante de folículos ovarianos pré-antrais e como estas técnicas poderão contribuir, de maneira isolada ou conjunta, para a produção in vitro de embriões a partir de matrizes de estimado valor genético ou zootécnico e que estejam em situações de morte iminente ou imediatamente post-mortem. As informações apresentadas nesta revisão permitem concluir que ambas as biotécnicas estão em constante desenvolvimento e que, num futuro próximo, poderão fornecer, isolada ou conjuntamente, folículos antrais aptos à rotina de produção in vitro de embriões de ruminantes.(AU)

This review approaches the main contributions on advances and how does in vitro culture and xenotransplantation of preantral follicles can contribute in each one or both of these techniques, for in vitro production of embryos from ruminants of high genetic or zootechnic merits that are in imminent death or in the immediately post-mortem period. The informations presented in this review allows the conclusion that both biotecniques are in progress and, in a near future, they could provide, separately or in conjunction, antral follicles suitable for routine in vitro production of embryos from ruminants.(AU)

Potencial do cultivo in vitro e do xenotransplante na sobrevida e no desenvolvimento de folículos ovarianos pré-antrais em matrizes de ruminantes domésticos em risco de morte: revisão de literatura / Potential of in vitro culture and xenotransplantation on surviving and development of ovarian preantral follicles in ruminant females at risk of death: a review

A presente revisão aborda os principais avanços do cultivo in vitro e do xenotransplante de folículos ovarianos pré-antrais e como estas técnicas poderão contribuir, de maneira isolada ou conjunta, para a produção in vitro de embriões a partir de matrizes de estimado valor genético ou zootécnico e que estejam em situações de morte iminente ou imediatamente post-mortem. As informações apresentadas nesta revisão permitem concluir que ambas as biotécnicas estão em constante desenvolvimento e que, num futuro próximo, poderão fornecer, isolada ou conjuntamente, folículos antrais aptos à rotina de produção in vitro de embriões de ruminantes.

This review approaches the main contributions on advances and how does in vitro culture and xenotransplantation of preantral follicles can contribute in each one or both of these techniques, for in vitro production of embryos from ruminants of high genetic or zootechnic merits that are in imminent death or in the immediately post-mortem period. The informations presented in this review allows the conclusion that both biotecniques are in progress and, in a near future, they could provide, separately or in conjunction, antral follicles suitable for routine in vitro production of embryos from ruminants.

Advances in artificial ovary in goats

Background: In livestock including goats, the modern assisted reproductive technologies are being used for the improvement and preservation of livestock genetics and the enhancement of reproductive efficiency. It is well known that mammalian ovaries contain many thousands of immature oocytes enclosed predominantly in preantral follicles (PF). However, more than 99.9% of follicles will not ovulate but instead they will be eliminated by a physiological process called atresia. The rescue of PF from the ovaries follow by the development of in vitro culture systems (artificial ovary) which allow the in vitro growth and maturation (IVGM) of their enclosed immature oocytes up to maturation stage by preventing follicular atresia could have a major impact on the in vitro embryo production in the future. In vitro studies have demonstrated satisfactory results with laboratory animals. The birth of a mouse from primordial follicles grown, matured and fertilized in vitro was obtained. Despite the good results in mice, in other animals, including livestock, at most a few embryos have been produced from IVGM oocytes from in vitro grown oocytes. Review: The in vitro culture of preantral follicle, also called artificial ovary, is an important step of the Manipulation of Oocytes Enclosed in Preantral Follicles (MOEPF). It aims to create in vitro an appropriated culture system which allows the survival, grow, maturation and further fertilization of small oocytes from preantral follicles, by preventing the follicular atresia that occurs abundantly in the ovaries. This article emphasizes the different steps of the MOEPF, its importance and finally, the main results obtained by our research team related to the in vitro culture of caprine preantral follicles. Our group has developed research with PF including isolation, conservation (cooling and cryopreservation) and in vitro culture of PF, focus on caprine species. In our laboratory, it was established efficient protocols for the isolation and conservation of PF, being the in vitro culture of PF up to maturation stages the major limitation at present. The types of in vitro culture systems available for preantral follicles include the culture of whole ovary, ovarian cortical slices and mechanically and/or enzimatically isolated follicles. We have been tested the effects of several substances including coconut water solution, antioxidants, serum, different types of hormones and growth factors on in vitro culture of preantral follicles enclosed in ovarian fragments. The early work of our group with culture of isolated secondary follicles were conducted involving the basic conditions of culture, i.e., ideal oxygen tension, regime of medium change, and how to culture the isolated follicles, individual or group, with or without FSH, in the presence or absence of antral follicles. The basic culture system for the in vitro culture of caprine PF which maintains follicular survival is well established. Primordial follicle activation and their further growth up to secondary stage in vitro were achieved. Isolated primary follicles can growth up to antral stage although this rate is still low. Antrum formation and fully grown oocytes were obtained from in vitro culture of large secondary follicles even yielding a few mature oocytes and embryos. Conclusion: In vitro embryo production from caprine preantral follicles grown in vitro was successfully achieved by our research group. At present, the key challenge for researchers in this important field of reproduction is to increase the rates of maturation and in vitro production of embryos from oocytes enclosed in preantral follicles at early stages, in order to produce, in the future, large number of offsprings.

EFEITO DAS DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE GDF-9 NO CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS OVARIANOS PRÉ-ANTRAIS NA ESPÉCIE EQUINA

Devido ao interesse por parte dos criadores de cavalos no desenvolvimento de novas biotecnologias voltadas à reprodução equina, estudos estão sendo realizados em fêmeas afim de avaliar os folículos ovarianos pré-antrais por meio da biotécnica de MIOFOPA. Com o objetivo de avaliar o efeito das diferentes concentrações de GDF-9 no cultivo in vitro de folículos ovarianos pré-antrais na espécie equina, foram utilizados ovários de éguas provenientes de abatedouro local (n=5) em anestro estacional. Os tecidos ovarianos foram seccionados sob condições assépticas em nove fragmentos de cada dos cinco animais (total= 45 fragmentos) sendo cada um deles fixados imediatamente em Bouin para controle não cultivado do experimento. Os outros fragmentos foram destinados ao cultivo in vitro em duas placas de 24 poços contendo meio base (MEM) mais a adição de diferentes concentrações de GDF-9 (50 ng/ml, 100 ng/ml e 200 ng/ml) em estufa a 39ºC em atmosfera a 5% de CO2 em ar por um período de dois e seis dias. Após o cultivo os fragmentos foram fixados em bouin por 24 horas e mantidos em álcool 70% até o processamento histológico. A avaliação morfológica dos folículos pré-antrais foi realizada por meio de histologia clássica. Dos 445 folículos classificados, 49% (220/445) eram folículos primordiais, 51% (225/445) encontravam-se em desenvolvimento e 60% (266/445) apresentavam-se morfologicamente normais (p<0,05). Os folículos cultivados in vitro na concentração de 200 ng/ml foi superior (63%) quando comparado as outras concentrações de GDF-9 após dois dias de cultivo (p<0,05) e os folículos que estavam em desenvolvimento cultivados até seis dias nas diferentes concentrações de GDF-9 50, 100 e 200 ng/ml (63,6%, 77,3% e 87,5% respectivamente), apresentaram desenvolvimento similar ao grupo controle MEM D6 (81,6%) (p>0,05). Em conclusão, o GDF-9 na concentração de 200 ng/ml por um período de dois dias de cultivo promove o desenvolvimento folicular, podendo ser utilizado no cultivo in vitro de folículos ovarianos pré-antrais na espécie equina por até dois dias de cultivo, mas não obteve bons resultados com 6 dias de cultivo.

Due to the interest of horse breeders at developing new biotechnologies aiming the equine reproduction, studies are being conducted on females in order to assess the pre-antral follicles by biotech MIOFOPA. Aiming to evaluate the effect of different concentrations of GDF-9 in vitro pre-antral follicles culture in the equine specie, seasonal anoestrus mares ovaries from a local slaughterhouse were used (n = 5). Ovarian tissues were cut under aseptic conditions into nine fragments of five animals each (total = 45 fragments) each one being immediately fixed in Bouin, as not cultivated experiment control. Other fragments were used to in vitro culture in two 24-well plates containing basal medium (MEM) plus the addition of different concentrations of GDF-9 (50 ng / ml, 100 ng / ml and 200 ng / mL) in an oven at atmosphere of 39 ° C in 5% CO2 air for a period of two to six days. After the cultivation the fragments were fixed in Bouin solution for 24 hours and kept in 70% alcohol until histological processing. Morphological assessment of pre-antral follicles was performed by histology. Of 445 follicles classified 49% (220/445) were primordial follicles, 51% (225/445) were in development and 60% (266/445) seem to be morphologically normal (p <0.05). The follicles cultured in vitro at a concentration of 200 ng / ml were higher (63%) when compared to other concentrations of GDF-9 after two days of cultivation (p <0.05) and follicles that were in development culture up to six days in different concentrations of GDF-9 50, 100 and 200 ng / ml (63.6%, 77.3% and 87.5% respectively), presented similar development to the control group MEM D6 (81.6%) (P> 0.05). In conclusion, the GDF-9 at 200 ng / mL concentration for a period of two days of cultivation promotes promoting follicular development, and presenting high chance of being used in vitro cultivation of preantral follicles in the equine specie for up to two days of culture, but did not presented good results with at the six days cultivation.