In silico and in vitro evaluation of primers for molecular differentiation of Leishmania species / Avaliação in silico e in vitro de iniciadores para a diferenciação molecular de espécies de Leishmania

Leishmaniasis is a zoonotic disease caused by over 20 species of protozoan parasites of the genus Leishmania. Infection is commonly spread by sandflies and produces a wide spectrum of clinical signs and symptoms. Therefore, from an epidemiological and therapeutic standpoint, it is important to detect and differentiate Leishmania spp. The objective of this study was to combinate in silico and in vitro strategies to evaluate the analytical specificity of primers previously described in the literature. According to electronic PCR (e-PCR) analysis, 23 out of 141 pairs of primers selected through literature search matched their previously reported analytical specificity. In vitro evaluation of nine of these primer pairs by quantitative PCR (qPCR) confirmed the analytical specificity of five of them at the level of Leishmania spp., L. mexicana complex or Leishmania and Viannia subgenera. Based on these findings, the combination of e-PCR and qPCR is suggested to be a valuable approach to maximize the specificity of new primer pairs for the laboratory diagnosis of infections with Leishmania spp.(AU)

As leishmanioses são zoonoses causadas por mais de 20 espécies de protozoários do gênero Leishmania. As infecções são comumente disseminadas por flebotomíneos e causam um amplo espectro de manifestações clínicas. Portanto, a detecção e diferenciação de espécies de Leishmania são importantes do ponto de vista epidemiológico e terapêutico. O objetivo deste estudo foi combinar estratégias in silico e in vitro para avaliar a especificidade analítica dos primers descritos anteriormente na literatura. De acordo com a PCR eletrônica (e-PCR), 23 dos 141 pares de primers selecionados por meio de pesquisa da literatura estavam de acordo com a especificidade analítica anteriormente relatada. A avaliação in vitro de nove desses pares de primers, por PCR quantitativa (qPCR), confirmou a especificidade analítica de cinco deles ao nível de espécie de Leishmania, do complexo L. mexicana ou dos subgêneros Leishmania e Viannia. Com base nos resultados, sugere-se que a combinação de e-PCR e qPCR é uma abordagem valiosa para a validação e maximização da especificidade de novos pares de primers para o diagnóstico laboratorial de infecções com Leishmania spp.(AU)

Evaluation of quantitative polymerase chain reaction for the detection of Toxoplasma gondii oocysts shed by cats / Avaliação da reação em cadeia da polimerase quantitativa para a detecção de oocistos de Toxoplasma gondii eliminados por gatos

Abstract Felines are definitive hosts of Toxoplasma gondii and can shed oocysts in their feces, contaminating the environment. Sporulated oocysts are highly resistant to the environment and have higher infectivity, which are attributed to many toxoplasmosis outbreaks. The aim of the present study was to evaluate a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) technique for the detection of T. gondii oocysts shed by cats. Twelve cats from a previous vaccine experiment were challenged orally with 600 cysts of the TgDoveBr8 strain on day 72. Fecal samples were collected daily using the centrifugal flotation technique, with microscopic examination (Sheather technique) and qPCR for 20 days after the challenge. Cats from all groups shed oocysts in their feces. Five negative cats in the Sheather were positive according to qPCR on the 3rd day post-inoculation (dpi). Oocysts were detected on the 4th dpi using the Sheather; however, there was no statistical difference between the two methods (p=0.1116). In addition, there was no statistically significant difference in oocyst shedding between the groups according to the Sheather technique (p=0.6534) and qPCR (p=0.9670). In conclusion, these results demonstrate that qPCR can be used as an alternative to the Sheather to detect and quantify T. gondii oocysts.

Resumo Felinos são hospedeiros definitivos do Toxoplasma gondii e podem eliminar oocistos nas fezes, contaminando o meio ambiente. Oocistos esporulados são altamente resistentes ao meio ambiente com elevada infectividade, sendo atribuído a muitos surtos de toxoplasmose. O objetivo do estudo foi avaliar a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) para a detecção de oocistos de T. gondii eliminados por gatos. Doze gatos de um experimento prévio de vacina foram desafiados por via oral com 600 cistos da cepa TgDoveBr8 no dia 72. Amostras fecais foram coletadas diariamente pela técnica de centrifugo-flutuação seguida de exame microscópico (técnica de Sheather) e qPCR por 20 dias após desafio. Gatos de todos os grupos eliminam oocistos nas fezes. Cinco gatos negativos na técnica Sheather foram positivos de acordo com a qPCR no 3º dia pós-inoculação (dpi). Oocistos foram detectados no 4º dpi no Sheather; entretanto, não houve diferença estatística entre os dois métodos (p=0,1116). Não houve diferença estatisticamente significativa na eliminação de oocistos entre os grupos de acordo com a técnica de Sheather (p = 0,6534) e qPCR (p = 0,9670). Em conclusão, esses resultados demonstram que qPCR pode ser usada como uma alternativa ao Sheather para detectar e quantificar oocistos de T. gondii.

Bovine Vaccinia in dairy cattle and suspicion of vesicular disease on milkers in Brazil / Vaccinia bovina em gado leiteiro e suspeita de doença vesicular em ordenhadores no Brasil

Bovine vaccinia (BV) is a vesicular disease induced by the Vaccinia virus (VACV) that affects milk production and is an occupational zoonosis. This research had the following objectives: (i) detection of VACV by qPCR in cattle with clinical suspicion of vesicular disease; (ii) symptoms characterization in animals and milkers with clinical suspicion of the disease and virus detection in humans; and (iii) identification of risk factors for infections of VACV in herds from several Brazilian states. A total of 471 bovine epithelial samples from dairy farms, in 15 Brazilian states, were evaluated between 2007 and 2012. The samples were tested by quantitative PCR (qPCR) using SYBR Green® reagents, validated with a lower limit of detection of 10 TCID50/50µL (1.7x10 viral particles), and 45.1% of VACV positive samples were detected. Using official forms for epidemiological investigation (FORM-IN), the risk factors for VACV infections in cattle were determined to be farms with a lack of technological facilities (P=0.029) and the presence of rodents (P=0.001). There was an effect of seasonality in cattle with a higher occurrence of BV during the dry season. A total of 420 epidemiological questionnaires were applied at public health care centers, where 100% of the milkers had vesicular lesions on their hands (98.1%) and on their arms (6.9%). The most frequent clinical symptoms in humans were: local swelling (74.2%), headache (20.7%), fever (10.4%) and inguinal lymphadenopathy (74.2%). Only 19.98% of milkers aged between 39 and 58 years were seroreactive to VACV and were immunized with the human anti-smallpox vaccine. There was an increase in the frequency of BV in older individuals due to their natural decrease in specific immunity. It has been shown that the implementation of zootechnical management techniques and health planning are important for the prevention of BV in animals and humans.(AU)

Vaccinia bovina (VB) é uma doença vesicular induzida pelo Vaccinia virus (VACV) que afeta a produção de leite e é uma zoonose ocupacional. Este trabalho teve os seguintes objetivos: (i) detecção de VACV por qPCR em bovinos com suspeita clínica de doença vesicular; (ii) caracterização dos sintomas apresentados por animais e ordenhadores com suspeita clínica da doença e detecção do vírus em humanos; e (iii) identificação de fatores de risco para infecção por VACV em rebanhos de vários estados brasileiros. Um total de 471 amostras de epitélio bovino de fazendas leiteiras, em 15 estados brasileiros, foram avaliados entre 2007 e 2012. As amostras foram testadas por PCR quantitativa (qPCR) usando reagentes SYBR Green®, validados com um limite inferior de detecção de 10TCID50/50L (1,7x10 partículas virais) e 45,1% das amostras positivas de VACV foram detectadas. Usando formulários oficiais de investigação epidemiológica (FORM-IN), os fatores de risco para infecções por VACV em bovinos foram determinados como fazendas com falta de instalações tecnológicas (P=0,029) e presença de roedores (P=0,001). Houve um efeito da sazonalidade no gado com maior ocorrência de VB durante a estação seca. Um total de 420 questionários epidemiológicos foram aplicados nos centros públicos de saúde, onde 100% dos ordenhadores apresentaram lesões vesiculares nas mãos (98,1%) e nos braços (6,9%). Os sintomas clínicos mais frequentes em humanos foram: inchaço local (74,2%), cefaleia (20,7%), febre (10,4%) e linfadenopatia inguinal (74,2%). Apenas 19,98% dos produtores de leite com idade entre 39 e 58 anos foram sororreagentes ao VACV e foram imunizados com a vacina contra a varíola humana. Houve um aumento na frequência de BV em indivíduos mais velhos devido à sua diminuição natural na imunidade específica. Demonstrou-se que a implementação de técnicas de gestão zootécnica e planejamento sanitário são importantes para a prevenção da VB em animais e seres humanos.(AU)

Bovine Vaccinia in dairy cattle and suspicion of vesicular disease on milkers in Brazil / Vaccinia bovina em gado leiteiro e suspeita de doença vesicular em ordenhadores no Brasil

Bovine vaccinia (BV) is a vesicular disease induced by the Vaccinia virus (VACV) that affects milk production and is an occupational zoonosis. This research had the following objectives: (i) detection of VACV by qPCR in cattle with clinical suspicion of vesicular disease; (ii) symptoms characterization in animals and milkers with clinical suspicion of the disease and virus detection in humans; and (iii) identification of risk factors for infections of VACV in herds from several Brazilian states. A total of 471 bovine epithelial samples from dairy farms, in 15 Brazilian states, were evaluated between 2007 and 2012. The samples were tested by quantitative PCR (qPCR) using SYBR Green® reagents, validated with a lower limit of detection of 10 TCID50/50µL (1.7x10 viral particles), and 45.1% of VACV positive samples were detected. Using official forms for epidemiological investigation (FORM-IN), the risk factors for VACV infections in cattle were determined to be farms with a lack of technological facilities (P=0.029) and the presence of rodents (P=0.001). There was an effect of seasonality in cattle with a higher occurrence of BV during the dry season. A total of 420 epidemiological questionnaires were applied at public health care centers, where 100% of the milkers had vesicular lesions on their hands (98.1%) and on their arms (6.9%). The most frequent clinical symptoms in humans were: local swelling (74.2%), headache (20.7%), fever (10.4%) and inguinal lymphadenopathy (74.2%). Only 19.98% of milkers aged between 39 and 58 years were seroreactive to VACV and were immunized with the human anti-smallpox vaccine. There was an increase in the frequency of BV in older individuals due to their natural decrease in specific immunity. It has been shown that the implementation of zootechnical management techniques and health planning are important for the prevention of BV in animals and humans.

Vaccinia bovina (VB) é uma doença vesicular induzida pelo Vaccinia virus (VACV) que afeta a produção de leite e é uma zoonose ocupacional. Este trabalho teve os seguintes objetivos: (i) detecção de VACV por qPCR em bovinos com suspeita clínica de doença vesicular; (ii) caracterização dos sintomas apresentados por animais e ordenhadores com suspeita clínica da doença e detecção do vírus em humanos; e (iii) identificação de fatores de risco para infecção por VACV em rebanhos de vários estados brasileiros. Um total de 471 amostras de epitélio bovino de fazendas leiteiras, em 15 estados brasileiros, foram avaliados entre 2007 e 2012. As amostras foram testadas por PCR quantitativa (qPCR) usando reagentes SYBR Green®, validados com um limite inferior de detecção de 10TCID50/50L (1,7x10 partículas virais) e 45,1% das amostras positivas de VACV foram detectadas. Usando formulários oficiais de investigação epidemiológica (FORM-IN), os fatores de risco para infecções por VACV em bovinos foram determinados como fazendas com falta de instalações tecnológicas (P=0,029) e presença de roedores (P=0,001). Houve um efeito da sazonalidade no gado com maior ocorrência de VB durante a estação seca. Um total de 420 questionários epidemiológicos foram aplicados nos centros públicos de saúde, onde 100% dos ordenhadores apresentaram lesões vesiculares nas mãos (98,1%) e nos braços (6,9%). Os sintomas clínicos mais frequentes em humanos foram: inchaço local (74,2%), cefaleia (20,7%), febre (10,4%) e linfadenopatia inguinal (74,2%). Apenas 19,98% dos produtores de leite com idade entre 39 e 58 anos foram sororreagentes ao VACV e foram imunizados com a vacina contra a varíola humana. Houve um aumento na frequência de BV em indivíduos mais velhos devido à sua diminuição natural na imunidade específica. Demonstrou-se que a implementação de técnicas de gestão zootécnica e planejamento sanitário são importantes para a prevenção da VB em animais e seres humanos.

[RETRACTED ARTICLE] Bovine Vaccinia in dairy cattle and suspicion of vesicular disease on milkers in Brazil / [ARTIGO RETRATADO] Vaccinia bovina em gado leiteiro e suspeita de doença vesicular em ordenhadores no Brasil

Bovine vaccinia (BV) is a vesicular disease induced by the Vaccinia virus (VACV) that affects milk production and is an occupational zoonosis. This research had the following objectives: (i) detection of VACV by qPCR in cattle with clinical suspicion of vesicular disease; (ii) symptoms characterization in animals and milkers with clinical suspicion of the disease and virus detection in humans; and (iii) identification of risk factors for infections of VACV in herds from several Brazilian states. A total of 471 bovine epithelial samples from dairy farms, in 15 Brazilian states, were evaluated between 2007 and 2012. The samples were tested by quantitative PCR (qPCR) using SYBR Green® reagents, validated with a lower limit of detection of 100TCID50/50µL (1.7x100 viral particles), and 45.1% of VACV positive samples were detected. Using official forms for epidemiological investigation (FORM-IN), the risk factors for VACV infections in cattle were determined to be farms with a lack of technological facilities (P= 0.029) and the presence of rodents (P= 0.001). There was an effect of seasonality in cattle with a higher occurrence of BV during the dry season. A total of 420 epidemiological questionnaires were applied at public health care centers, where 100% of the milkers had vesicular lesions on their hands (98.1%) and on their arms (6.9%). The most frequent clinical symptoms in humans were: local swelling (74.2%), headache (20.7%), fever (10.4%) and inguinal lymphadenopathy (74.2%). Only 19.98% of milkers aged between 39 and 58 years were seroreactive to VACV and were immunized with the human anti-smallpox vaccine. There was an increase in the frequency of BV in older individuals due to their natural decrease in specific immunity. It has been shown that the implementation of zootechnical management techniques and health planning are important for the prevention of BV in animals and humans.

Vaccinia bovina (VB) é uma doença vesicular induzida pelo Vaccinia virus (VACV) que afeta a produção de leite e é uma zoonose ocupacional. Este trabalho teve os seguintes objetivos: (i) detecção de VACV por qPCR em bovinos com suspeita clínica de doença vesicular; (ii) caracterização dos sintomas apresentados por animais e ordenhadores com suspeita clínica da doença e detecção do vírus em humanos; e (iii) identificação de fatores de risco para infecção por VACV em rebanhos de vários estados brasileiros. Um total de 471 amostras de epitélio bovino de fazendas leiteiras, em 15 estados brasileiros, foram avaliados entre 2007 e 2012. As amostras foram testadas por PCR quantitativa (qPCR) usando reagentes SYBR Green®, validados com um limite inferior de detecção de 100TCID50 / 50L (1,7x100 partículas virais) e 45,1% das amostras positivas de VACV foram detectadas. Usando formulários oficiais de investigação epidemiológica (FORM-IN), os fatores de risco para infecções por VACV em bovinos foram determinados como fazendas com falta de instalações tecnológicas (P= 0,029) e presença de roedores (P= 0,001). Houve um efeito da sazonalidade no gado com maior ocorrência de VB durante a estação seca. Um total de 420 questionários epidemiológicos foram aplicados nos centros públicos de saúde, onde 100% dos ordenhadores apresentaram lesões vesiculares nas mãos (98,1%) e nos braços (6,9%). Os sintomas clínicos mais frequentes em humanos foram: inchaço local (74,2%), cefaleia (20,7%), febre (10,4%) e linfadenopatia inguinal (74,2%). Apenas 19,98% dos produtores de leite com idade entre 39 e 58 anos foram sororreagentes ao VACV e foram imunizados com a vacina contra a varíola humana. Houve um aumento na frequência de BV em indivíduos mais velhos devido à sua diminuição natural na imunidade específica. Demonstrou-se que a implementação de técnicas de gestão zootécnica e planejamento sanitário são importantes para a prevenção da VB em animais e seres humanos.

[RETRACTED ARTICLE] Bovine Vaccinia in dairy cattle and suspicion of vesicular disease on milkers in Brazil / [ARTIGO RETRATADO] Vaccinia bovina em gado leiteiro e suspeita de doença vesicular em ordenhadores no Brasil

Bovine vaccinia (BV) is a vesicular disease induced by the Vaccinia virus (VACV) that affects milk production and is an occupational zoonosis. This research had the following objectives: (i) detection of VACV by qPCR in cattle with clinical suspicion of vesicular disease; (ii) symptoms characterization in animals and milkers with clinical suspicion of the disease and virus detection in humans; and (iii) identification of risk factors for infections of VACV in herds from several Brazilian states. A total of 471 bovine epithelial samples from dairy farms, in 15 Brazilian states, were evaluated between 2007 and 2012. The samples were tested by quantitative PCR (qPCR) using SYBR Green® reagents, validated with a lower limit of detection of 100TCID50/50µL (1.7x100 viral particles), and 45.1% of VACV positive samples were detected. Using official forms for epidemiological investigation (FORM-IN), the risk factors for VACV infections in cattle were determined to be farms with a lack of technological facilities (P= 0.029) and the presence of rodents (P= 0.001). There was an effect of seasonality in cattle with a higher occurrence of BV during the dry season. A total of 420 epidemiological questionnaires were applied at public health care centers, where 100% of the milkers had vesicular lesions on their hands (98.1%) and on their arms (6.9%). The most frequent clinical symptoms in humans were: local swelling (74.2%), headache (20.7%), fever (10.4%) and inguinal lymphadenopathy (74.2%). Only 19.98% of milkers aged between 39 and 58 years were seroreactive to VACV and were immunized with the human anti-smallpox vaccine. There was an increase in the frequency of BV in older individuals due to their natural decrease in specific immunity. It has been shown that the implementation of zootechnical management techniques and health planning are important for the prevention of BV in animals and humans.(AU)

Vaccinia bovina (VB) é uma doença vesicular induzida pelo Vaccinia virus (VACV) que afeta a produção de leite e é uma zoonose ocupacional. Este trabalho teve os seguintes objetivos: (i) detecção de VACV por qPCR em bovinos com suspeita clínica de doença vesicular; (ii) caracterização dos sintomas apresentados por animais e ordenhadores com suspeita clínica da doença e detecção do vírus em humanos; e (iii) identificação de fatores de risco para infecção por VACV em rebanhos de vários estados brasileiros. Um total de 471 amostras de epitélio bovino de fazendas leiteiras, em 15 estados brasileiros, foram avaliados entre 2007 e 2012. As amostras foram testadas por PCR quantitativa (qPCR) usando reagentes SYBR Green®, validados com um limite inferior de detecção de 100TCID50 / 50L (1,7x100 partículas virais) e 45,1% das amostras positivas de VACV foram detectadas. Usando formulários oficiais de investigação epidemiológica (FORM-IN), os fatores de risco para infecções por VACV em bovinos foram determinados como fazendas com falta de instalações tecnológicas (P= 0,029) e presença de roedores (P= 0,001). Houve um efeito da sazonalidade no gado com maior ocorrência de VB durante a estação seca. Um total de 420 questionários epidemiológicos foram aplicados nos centros públicos de saúde, onde 100% dos ordenhadores apresentaram lesões vesiculares nas mãos (98,1%) e nos braços (6,9%). Os sintomas clínicos mais frequentes em humanos foram: inchaço local (74,2%), cefaleia (20,7%), febre (10,4%) e linfadenopatia inguinal (74,2%). Apenas 19,98% dos produtores de leite com idade entre 39 e 58 anos foram sororreagentes ao VACV e foram imunizados com a vacina contra a varíola humana. Houve um aumento na frequência de BV em indivíduos mais velhos devido à sua diminuição natural na imunidade específica. Demonstrou-se que a implementação de técnicas de gestão zootécnica e planejamento sanitário são importantes para a prevenção da VB em animais e seres humanos.(AU)

High occurrence of Mycoplasma suis infection in swine herds from non-technified farms in Mossoró, state of Rio Grande do Norte, Northeastern Brazil / Alta ocorrência de infecção por Mycoplasma suis em suínos de criações não tecnificadas de Mossoró, estado do Rio Grande do Norte, Nordeste brasileiro

Abstract Mycoplasma suis, the etiological agent of swine hemoplasmosis, has been neglected in swine herds around the world. Swine hemoplasmosis is frequently associated with hemolytic anemia, disgalacty, infertility and immunosuppression, and it results in significant economic losses. This study investigates the occurrence of M. suis in non-technified swine herds in the northeastern region of Brazil using quantitative PCR (qPCR) based on the 16S rRNA gene. Between March and August 2013, blood samples from 147 swine were collected during slaughter in the city of Mossoró, state of Rio Grande do Norte, northeastern Brazil. One hundred and twelve samples (76.19%) were positive for M. suis by qPCR assays. The range of Cqs and quantification (copies of a M. suis-16S rRNA gene fragment/µL) was 20.8637.89 and 1.64×1016.64×107, respectively. One can conclude that M. suis infection have high occurrence (76,19%) in non-technified swine-rearing systems in Mossoró in the state of Rio Grande do Norte, Brazil.(AU)

Resumo Mycoplasma suis, agente etiológico da hemoplasmose suína, tem sido negligenciado nas criações de suínos ao redor do mundo. A hemoplasmose suína é frequentemente associada à anemia hemolítica, disgalactia, infertilidade e imunossupressão, acarretando em perdas econômicas. O objetivo do presente trabalho foi investigar, por meio da PCR quantitativa (qPCR) baseada no gene rRNA 16S, a ocorrência de M. suis em amostras de sangue de suínos de criações não tecnificadas na cidade de Mossoró, Estado do Rio Grande do Norte. Entre março a agosto de 2013, foram colhidas amostras de sangue de 147 suínos de criações não tecnificadas da referida região. Cento e doze amostras (76,19%) amostras mostraram-se positivas na qPCR para M. suis. A média dos Cqs e da quantificação (número de cópias do gene 16S rRNA de M. suis por microlitro) foi de 20,86 37,89 e 1,64 x 101 a 6,64 x 107, respectivamente. Conclui-se que a infecção por M. suis apresenta alta ocorrência (76,19%) em criações de suínos não tecnificadas na cidade de Mossoró, estado do Rio Grande do Norte.(AU)

APLICAÇÃO DO ENSAIO DE SEQUENCIAMENTO GENÉTICO "NEMABIOMA" COMO TESTE DE DIAGNÓSTICO PARA NEMATÓDEOS PARASITOS DE BOVINOS

As perdas potenciais pelas infecções por nematódeos em bovinos no Brasil foram estimadas em $7,1 bilhões por ano. Indiscutivelmente, deve-se fazer o uso criterioso das drogas disponíveis, assim como o desenvolvimento de novas formulações, para enfrentar a problemática da resistência anti-helmíntica. O método atualmente empregado para o teste de medicamentos é invasivo e, portanto, enfrenta dificuldades em se adequar aos novos modelos em bem-estar animal. Outras técnicas utilizadas são as contagens de ovos de nematódeos por grama de fezes (OPGs) pré e pós-tratamento, que apresentam resultados não confiáveis para este propósito. Com fins científicos, emprega-se a PCR convencional ou a PCR em tempo real, técnicasquali e semi-quantitativa, respectivamente. O objetivo deste estudo foi avaliar a relação entre a comunidade parasitária das larvas em terceiro estádio após coproculturas e a composição do bioma de nematódeos adultos presentes no trato gastrointestinal. As proporções das larvas foram avaliadas por meio da tradicional morfologia e o novo método de sequenciamento Nemabioma, enquanto as contagens e classificações dos vermes adultos foram realizadas pelos clássicos métodos morfológicos. Neste experimento, utilizaram-se sete bovinos mestiços, naturalmente infectados, entre oito e 12 meses de idade. Contagens de OPG foram realizadas a cada dois dias, do 14 ao 28 dia do estudo. As culturas de larvas foram realizadas utilizando-se as amostras de fezes colhidas nos dias 14, 16, 20, 24 e 28 do estudo. As larvas L3 foram sempre extraídas após 10 dias de cultura. Os animais foram experimentalmente eutanasiados no dia 28 para a subsequente colheita e classificação de helmintos adultos. Este é o primeiro estudo que relaciona as comunidades parasitárias de nematódeos em amostras de larvas e helmintos adultos utilizando o Nemabioma. Os resultados deste estudo indicam queas espécies Haemonchus placei e Oesophagostomum radiatum são superestimados na comunidade das L3 avaliadas pelo Nemabioma. Por outro lado, Cooperia punctata e Trichostrongylus axei aparecem sub-representados.Tal fato explica-se, principalmente, pela diferença de fecundidade entre as fêmeas das várias espécies de nematódeos adultos que parasitam um mesmo animal.

The potential detrimental effects of cattle nematode infections in Brazil have been estimated at USD7.1 billion a year. It is undeniable, the necessity of appropriate drug use and the development of new formulations, to face the problematic of anthelmintic drug resistance. The current method for testing new drugs is both invasive and represents threats against recent animal welfare models. Other approaches currently used are Fecal Egg Counts (FECs) pre and post treatment, which are not reliable. Occasionally, conventional and real-time PCR are employed, which are non-quantitative and semi-quantitative techniques respectively. The objective of this study was to evaluate the relationship between the parasite community present in cultured fecal samples, and the composition of adult worms present in the gastrointestinal tract. Species proportions in larvae were assessed with the traditional morphological analysis and a recently developed Nemabiome sequencing assay, while the adult species proportions were assessed with classical morphological approaches. To this end, an experiment using natural infected bovines was designed. Seven crossbred calves were selected from eight to 12 months of age. FECs were done every 2 days, from the 14thto the 28th day of the study. Cultures of larvae were performed using fecal samples extracted on days +14, +16, +20, +24 and +28. The L3s were always extracted after 10 days of culture. The animals were necropsied on day +28 for collection and subsequent classification and counting of adult worms. This was the first time the comparison among the community of nematodes species present in larvae samples, and adult worms, has been described in the literature using these techniques. Differences in fecundity between nematode species can influence the apparent composition of larvae in the feces, how this relates to the actual adult worm burden is crucial to understanding the actual nematode infection, and the resulting implications.

Cultura de células embrionárias de carrapatos do gênero Rhipicephalus para cultivo de Ehrlichia canis e Anaplasma marginale

No Brasil, carrapatos do gênero Rhipicephalus são representados pelas espécies Rhipicephalus sanguineuss.l. (Latreille) e Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini), sendo que a primeira espécie possui especificidade com cães domésticos e a segunda com bovinos. Para o cão, R. sanguineus s.l. é o principal vetor de agentes causadores da babesiose canina e da erliquiose, enquanto que nos bovinos, R. microplus é responsável, principalmente, pela transmissão de agentes causadores da babesiose e anaplasmose. Alguns dos patógenos causadores dessas doenças são difíceis de serem cultivados in vitro, e não crescem em meios artificiais, especialmente Anaplasma spp. Assim, muitas linhagens celulares de carrapatos foram desenvolvidas nos últimos 40 anos e têm sido amplamente utilizadas para isolamento e propagação de microrganismos patogênicos. Cultivos celulares obtidos de células embrionárias de carrapatos oferecem um sistema de vetor in vitro, que é útil principalmente para estudos de agentes intracelulares. Dessa forma, a obtenção de culturas de células embrionárias de R. sanguineus (origens tropical e temperada) e de R. (B.) microplus, bem como, sua infecção com Ehrlichia canis e Anaplasma marginale, respectivamente, são objetivos do presente estudo. Os cultivos celulares dessas espécies de carrapatos foram preparados com massas de ovos de diferentes idades e mantidos à 30 °C em meio de cultura L15-B, suplementado com 10% de Triptose Fosfato e 20% de Soro Fetal Bovino. Subcultivos foram realizados após a formação da monocamada celular confluente. As identidades celulares foram confirmadas pela PCR e sequenciamento, utilizando um fragmento do gene mitocondrial 16S rDNA. As sequências das culturas de células de R. sanguineus (tropical e temperada) e de R. microplus foram depositadas no GenBank. Essas culturas de células foram infectadas com E. canis e A. marginale (cepas Jaboticabal), respectivamente, e mantidas em meio L-15B (Vitrocell) suplementado com Soro Fetal Bovino enriquecido com ferro (Hyclone) nas concentrações de 2% e 5%. As células infectadas foram mantidas em propagações sucessivas até a terceira passagem, para novas culturas de células não infectadas, sendo então criopreservadas. O DNA extraído das células infectadas e não infectadas de R. sanguineus (de ambas as origens) e de R. microplus, foi analisado pela PCR quantitativa em tempo real (qPCR), utilizando os genes E. canis-dsb e msp1, respectivamente. Propagações de células de carrapatos infectadas para as novas culturas de R. sanguineus (origem tropical) e R. (B) microplus, foram bem sucedidas. Por outro lado, as células de R. sanguineus (origem temperada) não se tornaram infectadas no presente estudo.

In Brazil, ticks of the genus Rhipicephalus are represented by the species Rhipicephalus sanguineuss.l. (Latreille) and Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini), being that the first one has specificity with domestic dogs and the second with cattle. For dogs, R. sanguineus s.l. is the main vector of causative agents of canine babesiosis and ehrlichiosis, whereas in cattle, R. microplus is responsible, mainly, for the transmission of agents that cause babesiosis and anaplasmosis. Some of the pathogens that cause these diseases are difficult to grow in vitro, and do not grow on artificial media, especially Anaplasma spp. Therefore, many tick cell lines were developed in the last 40 years and have been used for the isolation and propagation of pathogenic microorganisms. Cell cultures obtained from embryonic tick cells offer an in vitro vector system, which is mainly useful for studies of intracellular agents. The aim of the present study was to obtain cultures of R. sanguineus (tropical and temperate lineages) and R. microplus embryonic cells and their infection with Ehrlichia canis and Anaplasma marginale. Cell cultures from the tick species were prepared with egg masses of different ages and kept at 30 ° C in L15-B culture medium supplemented with 10% Tryptose Broth and 20% Fetal Bovine Serum. Subcultures were done after confluent cell monolayer formation. Cellular identities were confirmed by PCR and sequencing using a 16S rDNA mitochondrial gene fragment. Sequences of R. sanguineus (tropical and temperate) and R. microplus cell cultures were deposited on GenBank. These cell cultures were infected with E. canis and A. marginale (Jaboticabal strains), respectively, and maintained in L-15B medium and Fetal Bovine Serum with iron (Hyclone) supplemented at 2% and 5% concentrations. The infected cells were maintained in successive propagations until the third passage, to new cultures of uninfected cells, and then were cryopreserved. DNA extracted from infected and uninfected R. sanguineus (both origin) and R. microplus cells was analyzed by quantitative real-time PCR (qPCR) using the E. canis-dsb and msp1 genes, respectively. Propagations of infected tick cells to the new cultures of R. sanguineus (tropical origin) and R. microplus, were successful. On the other hand, the R. sanguineus cells (temperate origin) did become infected in the present study.

Detection and dynamics of porcine circovirus 2 shedding in semen using conventional and real-time PCR / Deteccão e dinâmica de excreção do circo vírus porcino tipo 2 no semen pelo PCR convencional e PCR em tempo real

The dynamics of porcine circovirus type 2 (PCV2) shedding in semen of naturally infected boars was studied. Semen was collected serially each 15 or 20 days during 62 days from 5 boars from a herd and from 11 boars from an artificial insemination center. All boars were positive for PCV2 DNA by nested polymerase chain reaction of raw semen in at least two sampling dates, and most of them had detectable shedding in all sampling dates. Real-time quantitative PCR was performed in 23 samples. All samples showed low amounts of PCV2 DNA, ranging from 98 to 652 PCV2 copies/mL. No differences between the frequencies of PCV2 DNA shed in semen were found considering herds and age of boars. PCV2 shedding in the semen can occur continuously or intermittently up to 60 days in naturally infected boars at 12 to 42 months old in absence of PCV2 clinical signs. These results demonstrate sporadic and long-term shedding patterns of low amounts of PCV2 DNA in semen from naturally infected boars.(AU)

A dinâmica da excreção do circovírus suíno tipo 2 (CVS2) em sêmen de machos naturalmente infectados foi estudada. Amostras de sêmen de cinco machos de um plantel e de 11 machos de um centro de inseminação artificial foram coletadas a cada 15 ou 20 dias durante 62 dias. Todos os machos testados foram positivos para a presença do DNA viral no sêmen em pelo menos duas coletas, sendo que a maioria deles eliminou o CVS2 em todas as coletas. O teste de PCR quantitativa em tempo real foi aplicado em 23 amostras. Todas as amostras tinham baixa quantidade de DNA viral, variando de 98 a 652 cópias de CVS2/ml. Não houve diferença na freqüência de eliminação do DNA viral levando em conta os plantéis e idade dos machos. A excreção do CVS2 no sêmen pode ocorrer de forma contínua ou intermitente por mais de 60 dias em machos de 12 a 42 meses de idade naturalmente infectados na ausência de sinais clínicos de CVS2. Estes resultados demonstram padrões esporádico e de longa duração de excreção viral em pequenas quantidades no sêmen de varrões naturalmente infectados.(AU)

ANÁLISE DO PERFIL DA EXPRESSÃO DE GENES CANDIDATOS COM A EFICIÊNCIA ALIMENTAR DE ANIMAIS DA RAÇA NELORE

O Brasil se consolidou como um dos principais produtores e exportadores mundiais de carne. Entretanto, diversas culturas (animal/vegetal) têm competido com a bovinocultura por espaço e importância na balança comercial brasileira. Assim, o melhoramento genético animal tem tido, no Brasil, papel fundamental na pecuária de corte de forma a manter crescentes os níveis de produção ocupando o mesmo espaço e a baixo custo. A eficiência alimentar é uma característica produtiva de extrema importância, porém não está sendo considerada nos programas de avaliação genética no país, devido ao fato de a mensuração ser onerosa e tardia. Nesse cenário a genética molecular pode contribuir para a implementação da seleção dessa característica em programas de melhoramento por meio da identificação de genes importantes para eficiência alimentar. O presente estudo objetivou comprovar o padrão de expressão de genes diferencialmente expressos previamente identificados por sequenciamento de RNA (RNA-seq) em animais extremos para eficiência alimentar. Nesse contexto foi adotada a metodologia de PCR quantitativo em tempo real (qPCR) a fim de estabelecer uma relação quantitativa entre nível de expressão gênica e a eficiência alimentar em uma população experimental de 83 animais da raça Nelore avaliados para diferentes medidas de eficiência alimentar. Um subgrupo composto por 20 animais extremos para o consumo alimentar residual (CAR) foi avaliado quanto ao padrão de expressão global pela tecnologia de RNA-seq para identificação de genes diferencialmente expressos (DE). A partir dos genes DE identificados foram selecionados seis genes candidatos (PPP1R26, FABP1, FADS2, RGS2, SLC2A5 e UCP2) com base nos valores de Fold Change e sua função metabólica para a característica em estudo. As qPCR foram realizadas para identificar associações entre o nível de expressão dos seis genes alvo com as medidas de eficiência alimentar. Observou-se associação (P <0,05) entre o gene FABP1 com consumo alimentar residual e ingestão de matéria seca. Além disso, o gene SLC2A5 foi associado (P <0,05) com as medidas índice de Kleiber e taxa relativa de crescimento. Em ambos os casos um aumento do nível de expressão foi associado com diminuições nos valores das medidas fenotípicas. Assim, FABP1 e SLC2A5 podem ser potenciais candidatos para estar envolvido com a eficiência alimentar. Os resultados obtidos aqui são um grande avanço no estudo desta complexa característica além de contribuir para melhor compreensão dos mecanismos biológicos envolvidos.

Brazil is one of the leading producer and exporter of meat. However, different livestock and plant production have been competing with cattle for space and importance in Brazilian trade balance. Thus, the animal breeding has played a key role in beef cattle to increase production levels occupying the same spaceatlower costs. Feed efficiency is a productive trait of extreme importance, but it has not been considered in genetic evaluation programs in our country. This is probably due to the fact that the measurement is costly and late. In this scenario molecular genetics may contribute to the implementation of this trait in breeding programs by identifying candidate genes for feed efficiency. The present study aimed to confirm the differential gene expression levels of candidate genes previously identified by RNA sequencing (RNA-seq) in extreme groups of animals evaluated for feed efficiency. We adopted the real time quantitative PCR methodology (qPCR) to verify a quantitative relationship between the level of gene expression and feed efficiency in an experimental population of 83 Nelorecattle evaluated for different feed efficiency traits. A subgroup composed of 20 animals extreme for Residual Feed Intake (RFI) was evaluated for overall standard of expression by RNA-seq technology to identify genes differentially expressed (DE). From the identified DE genes six candidate genes were selected (PPP1R26, FABP1, FADS2, RGS2, SLC2A5 and UCP2) based on fold change values and its metabolic function related to feed efficiency.The qPCR analyses were performed to confirm association between the expression levelof the six target genes with measures of feed efficiency. It was observedassociation between the FABP1 gene with residual feed intake and dry matter intake (P <0.05).Also, the SLC2A5 gene was associated with Kleiber index measurements and relative growth rate (P <0.05).In both cases an increase in the expression level was associated with decreases in the values of phenotypic measurements. Thus, FABP1 and SLC2A5 may be potential candidates for being involved with feed efficiency. The results obtained here are a breakthrough in the study of this complex trait and can help to a better understanding of the molecular mechanisms of this trait.

Avaliação de diferentes métodos para a detecção e contagem de campylobacter spp. isolado de carcaças de frango no estado do Paraná e determinação da prevalência e resistência antimicrobiana dos isolados

Os produtos de origem animal são reconhecidos como fontes primárias de contaminação por vários enteropatógenos. Entre eles, nas últimas décadas, o gênero Campylobacter vem se destacando como o maior causador de surtos de gastrenterites humanas nos países desenvolvidos. Devido à sua importância na saúde pública e na economia mundial, estudos vêm sendo realizados para aprimorar as técnicas de isolamento, contagem e identificação de Campylobacter spp. em alimentos e também para verificar a prevalência e a resistência antimicrobiana das cepas de Campylobacter em fontes do patógeno como a carne de frango. O presente trabalho teve como objetivo avaliar 3 técnicas de cultivo e 3 meios sólidos para a detecção e enumeração de Campylobacter spp. e verificar a prevalência e a resistência antimicrobiana das cepas isoladas em carcaças de frango. Neste estudo, foram analisadas 60 carcaças de 12 diferentes marcas comerciais de frango produzidas no Estado do Paraná, Brasil. A determinação de Campylobacter foi realizada na enxaguadura das carcaças pelos métodos qualitativos ISO 10272-1:2006 e Mini VIDAS® e quantitativo ISO 10272-2:2006. Para o isolamento final das colônias foram testados três diferentes meios sólidos: ágar Bolton modificado (AMB), ágar carvão cefoperazona desoxicolato modificado (mCCDA) e ágar tripticase soja (TSA) Campy. As colônias típicas foram confirmadas por prova bioquímica pelo método API Campy e molecular por PCR em tempo real e submetidas à avaliação da resistência antimicrobiana pelas técnicas de disco difusão e concentração mínima inibitória (Etest®). Os antibióticos testados foram ciprofloxacina, cloranfenicol, eritromicina, gentamicina, meropenem e tetraciclina por ambas as metodologias e ainda, clindamicina somente por Etest® e ácido nalidíxico, amoxicilina+ácido clavulônico, ampicilina, cefotoxima, cefalotina e tobramicina, somente por disco difusão. Obteve-se presença de Campylobacter em 40,00% (24) das amostras avaliadas e prevalência em 83,33% (10) das 12 marcas comerciais de frango. A metodologia de isolamento direto em placa (ISO quantitativa) mostrou a maior freqüência de isolamento de Campylobacter (36,70%) em comparação às metodologias ISO qualitativa (11,70%) e Mini VIDAS (28,40%), havendo diferença significativa entre elas pelo teste kappa. A metodologia ISO quantitativa também apresentou menor custo, curto tempo de análise e possibilitou a contagem das colônias em comparação às metodologias de enriquecimento prévio em caldo. Os meios sólidos testados foram igualmente eficientes para o crescimento de Campylobacter pelo teste kappa, contudo o ágar Bolton modificado proporcionou melhor distinção das colônias típicas e apresentou menor custo, podendo ser satisfatoriamente empregado para o isolamento e enumeração de Campylobacter em carcaças de frango. Das cepas isoladas, 18 (75,00%) mostraram multirresistência antimicrobiana, com resistência a 4 ou mais antibióticos testados. As maiores frequências de resistência foram verificadas para cefalotina (95,80%), ciprofloxacina (91,60%), tetraciclina e ácido nalidíxico (ambos com 75,00%). A despeito da multirresistência antimicrobiana verificou-se alta taxa de sensibilidade das cepas à eritromicina (95,80%), considerada o fármaco de eleição no tratamento da campilobacteriose. Todas as 16 (100%) cepas de C. jejuni jejuni foram resistentes à cefalotina, 93,75% à ciprofloxacina, 68,7% ao ácido nalidíxico e à tetraciclina, 18,7% à ampicilina, 12,50% à clindamicina e 6,20% à c

Sexagem de espermatozóides bovinos por centrifugação em gradiente de densidade contínuo de Percoll e OptiPrep

Os objetivos deste trabalho foram de facilitar os procedimentos de formação de gradientes de- densidade de Percoll e OptiPrep para separação de espermatozóides X; avaliar a eficiência da sexagem de espermatozóides X, a viabilidade espermática e integridade do acrossoma e do DNA após a centrifugação nestes gradientes e avaliar taxa de clivagem e blastocisto durante a produção in vitro de embriões. Para isso, doses de sêmen de touros foram descongeladas e cerca de 40 milhões de espermatozóides foram colocados sobre cada gradiente de densidade compostos por Percoll ou OptiPrep com três camadas que variaram entre 1.11 Og/mL a 1.123g/mL em tubos de poliestireno de 15mL. Centrifugou-se o gradiente a 500xg por 15 min a 22°C. Os sobrenadantes foram aspirados e recuperados para verificação da viabilidade espermática e integridade do acrossoma, fragmentação do DNA, produção in vitro de embriões, avaliação da eficiência da sexagem pela reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) e sexagem dos embriões pela PCR. A porcentagem de espermatozóides vivos com acrossoma intacto diminuiu (P<0,05) após a centrifugação nos gradientes de densidade, mas não influenciou, de modo geral, a produção in vitro de embriões (taxa de clivagem e blastocistos) utilizando estes espermatozóides centrifugados. Não foi detectada fragmentação do DNA dos espermatozóides nas amostras centrifugadas. Os resultados demonstraram que o Percoll enriqueceu as amostras com espermatozóides X (62% de fêmeas, P<0,05). No OptiPrep e grupo Controle a porcentagem de fêmeas foi de 47,1 e 48,7%, respectivamente. Estes resultados foram confirmados pela qPCR do DNA dos espermatozóides, com uma subestimação apenas no Percoll. Foi possível realizar a sexagem, por uma metodologia mais simples, facilitando o procedimento de centrifugação em gradiente de densidade e sem provocar danos aos espermatozóides

The objectives of this work were to facilitate the procedures of formation of density gradients of Percoll and OptíPrep for separation of X-bearing bovine spermatozoa; to evaluate the efficiency of sexing and viability of acrosome integrity and DNA after centrifugation in these gradients and to assess the cleavage and blastocyst rate during in vitro production of embryos. For this, frozen-thawed spermatozoa (20 to 40 millions) were deposited on each density gradient composed of Percoll or OptiPrep with three layers that varied between 1.110g/mL to 1.123g/mL, in 15mL polystyrene tubes. The tubes were centrifuged at 500xg for 15 min at 22oC. Supernatants were carefully aspirated and sediments recovered for verification of sperm quality, DNA fragmentation, in vitro fertilization of embryos, evaluation of the efficiency of sexing by real time polymerase chain reaction (qPCR) and sexing of embryos by PCR. Percentage of live spermatozoa with intact acrosome decreased (P<0.05) after centrifugation in density gradients, however, it not influence, in general, the production of embryos in vitro (cleavage and blastocyst rates) using these centrifuged sperm. No sperm DNA fragmentation was detected in centrifuged samples. The results of embryo sexing by PCR showed deviation to female in the Percoll group (62%, P<0.05). In the OptiPrep and Control group the percentage of females was 47.1 and 48.7%, respectively. These results were confirmed by qPCR of DNA of spermatozoa, with an underestimation only in the Percoll group. It was possible the sexing, by a simple approach, facilitating the process of the centrifugation in density gradient and without damage to sperm