Utilização de leite com diferentes concentrações de gordura como diluentes para sêmen equino refrigerado / Use of milk with different fat concentrations as extenders for equine cooled semen

Dois experimentos foram realizados para verificar a viabilidade de diluentes para sêmen equino refrigerado. O objetivo do primeiro experimento foi verificar a eficiência do leite UHT integral e semidesnatado, comparado ao leite desnatado. Amostras foram analisadas a fresco e posteriormente diluídas em leite UHT integral, semidesnatado e desnatado. Foram realizados exames de motilidade espermática e vigor, CFDA/PI e HOST pós-diluição (0h), e no sêmen refrigerado a 5 ºC após 24 e 48 horas. Não houve diferença entre os três diluentes, quanto à motilidade espermática (p=0,9880), vigor (p=0,7249), CFDA/PI (p=0,3382) e HOST (p > 0,01). Houve uma diminuição na qualidade do sêmen, no decorrer do tempo (p < 0,01), independente do diluente utilizado. Pode-se afirmar que, na falta de leite UHT desnatado, o semidesnatado e o integral podem ser usados, uma vez que eles não provocam prejuízo na qualidade do sêmen refrigerado armazenado por até 48 horas. No segundo experimento, o objetivo foi verificar a eficácia do leite desnatado em comparação com diluentes comerciais (Botusemen® (BS) e Botusemen Special® (BSS)). Logo após a coleta do sêmen, as amostras foram diluídas com leite UHT desnatado (LD), Botusemen® (BS) e Botusemen Special®(BSS). A análise de sêmen seguiu o mesmo protocolo do primeiro experimento. As amostras de sêmen refrigeradas com BSS apresentaram HOST e CFDA/PI (p< 0,001) maiores nas 24h e 48 h o que indica que o diluente BSS promove aumento da longevidade dos espermatozoides em comparação com os outros analisados.

Two trials were performed to verify the viability of extenders equine cooled semen. The objective of the first trial was to verify the efficacy of whole and semi-skimmed UHT milk compared to skim milk. Fresh semen samples were analyzed and later diluted in UHT whole milk, semi skimmed and skimmed milk. Sperm motility and vigor, CFDA / PI and HOST tests were performed post-dilution (0h), and in semen cooled at 5oC after 24 and 48h. There was no difference between the 3 extenders, for sperm motility (p = 0.9880), vigor (p = 0.7249), CFDA / PI (p = 0.3882) and HOST (p> 0.01). There was a decrease in semen quality over time (p <0.01), regardless of the extender used. It can be stated that in the absence of skimmed UHT milk, semi-skimmed and whole milk can be used since they do not impair the quality of refrigerated semen stored for up to 48 hours. In the second trial the objective was to verify the efficacy of the skim milk compared to commercial extenders (Botusemen® (BS) and Botusemen Special® (BSS)). Soon after semen collection, the samples were diluted with UHT skim milk (LD), Botusemen® (BS) and Botusemen Special® (BSS). Semen analysis followed the same protocol as the first experiment. BSS-cooled semen showed higher HOST and CFDA / PI (p <0.001) in 24h and 48h indicating that BSS diluent promotes increased sperm longevity compared to the others analyzed.

Utilização de leite com diferentes concentrações de gordura como diluentes para sêmen equino refrigerado / Use of milk with different fat concentrations as extenders for equine cooled semen

Dois experimentos foram realizados para verificar a viabilidade de diluentes para sêmen equino refrigerado. O objetivo do primeiro experimento foi verificar a eficiência do leite UHT integral e semidesnatado, comparado ao leite desnatado. Amostras foram analisadas a fresco e posteriormente diluídas em leite UHT integral, semidesnatado e desnatado. Foram realizados exames de motilidade espermática e vigor, CFDA/PI e HOST pós-diluição (0h), e no sêmen refrigerado a 5 ºC após 24 e 48 horas. Não houve diferença entre os três diluentes, quanto à motilidade espermática (p=0,9880), vigor (p=0,7249), CFDA/PI (p=0,3382) e HOST (p > 0,01). Houve uma diminuição na qualidade do sêmen, no decorrer do tempo (p < 0,01), independente do diluente utilizado. Pode-se afirmar que, na falta de leite UHT desnatado, o semidesnatado e o integral podem ser usados, uma vez que eles não provocam prejuízo na qualidade do sêmen refrigerado armazenado por até 48 horas. No segundo experimento, o objetivo foi verificar a eficácia do leite desnatado em comparação com diluentes comerciais (Botusemen® (BS) e Botusemen Special® (BSS)). Logo após a coleta do sêmen, as amostras foram diluídas com leite UHT desnatado (LD), Botusemen® (BS) e Botusemen Special®(BSS). A análise de sêmen seguiu o mesmo protocolo do primeiro experimento. As amostras de sêmen refrigeradas com BSS apresentaram HOST e CFDA/PI (p< 0,001) maiores nas 24h e 48 h o que indica que o diluente BSS promove aumento da longevidade dos espermatozoides em comparação com os outros analisados.(AU)

Two trials were performed to verify the viability of extenders equine cooled semen. The objective of the first trial was to verify the efficacy of whole and semi-skimmed UHT milk compared to skim milk. Fresh semen samples were analyzed and later diluted in UHT whole milk, semi skimmed and skimmed milk. Sperm motility and vigor, CFDA / PI and HOST tests were performed post-dilution (0h), and in semen cooled at 5oC after 24 and 48h. There was no difference between the 3 extenders, for sperm motility (p = 0.9880), vigor (p = 0.7249), CFDA / PI (p = 0.3882) and HOST (p> 0.01). There was a decrease in semen quality over time (p <0.01), regardless of the extender used. It can be stated that in the absence of skimmed UHT milk, semi-skimmed and whole milk can be used since they do not impair the quality of refrigerated semen stored for up to 48 hours. In the second trial the objective was to verify the efficacy of the skim milk compared to commercial extenders (Botusemen® (BS) and Botusemen Special® (BSS)). Soon after semen collection, the samples were diluted with UHT skim milk (LD), Botusemen® (BS) and Botusemen Special® (BSS). Semen analysis followed the same protocol as the first experiment. BSS-cooled semen showed higher HOST and CFDA / PI (p <0.001) in 24h and 48h indicating that BSS diluent promotes increased sperm longevity compared to the others analyzed.(AU)

Effect of plasma separation techniques and sperm selection on sperm recovery and viability of cooled pony stallion semen for 48h at 5°C / [Efeito das técnicas de separação de plasma e de seleção de esperma na recuperação e viabilidade do sêmen de garanhão pônei resfriado por 48h a 5°C]

Separation techniques of seminal plasma [centrifugation (SC) and Sperm Filter® (SF)] and sperm selection [Androcoll-E (SCA) and filtration glass wool (GW)] were used in 24 ejaculates from 6 stallions. In experiment 1, the ejaculates were allocated into control (no spin), centrifugation at 600 g x 10min, SF and GW. In experiment 2, semen was submitted to SC, SGA and filtered through GW. Following the treatments in both experiments, samples were kept chilled at 5°C to 50 x 106 sperm/ml for 48h. The variables measured on fresh and cooling semen were pH, motility, membrane viability function by 6-carboxyfluorescein diacetate and propidium iodide (CFDA / PI), viability or vitality (eosin / nigrosine) and mitochondrial activity. In experiment 1, centrifugation to remove seminal plasma resulted in greater damage to sperm than separation by sperm filter, and selection by glass wool was more efficient in separating viable cells and maintaining viability during cooling. In experiment 2 Androcoll-E and glass wool treatments resulted in higher (P <0.0001) motility, membrane function, mitochondrial activity, and viability than centrifuged semen. Both selection by Androcoll- E and glass wool improved the quality of semen pony stallions for preservation for up to 48h to 5ºC.(AU)

As técnicas de separação do plasma seminal (centrifugação, SpermFilter) e de seleção espermática (Androcoll-E e filtração por lã de vidro) foram aplicadas em 24 ejaculados de seis garanhões da raça Pônei Brasileiro. Após coleta e separação da fração gel, os ejaculados foram diluídos 1:1 com diluente à base de leite em pó. No experimento 1, os ejaculados foram distribuídos em controle (sem centrifugação), centrifugação a 600g x 10min, SpermFilter e filtração por lã de vidro. No experimento 2, o sêmen foi submetido aos procedimentos: centrifugado (SC), centrifugado com Androcoll-E e filtrado por lã de vidro. Após os procedimentos de ambos os experimentos, as amostras foram mantidas refrigeradas a 5ºC, com 50 x 106 espermatozoides/mL, por 48h. As variáveis mensuradas a fresco, 24h e 48h foram: pH, motilidade, funcionalidade de membrana, viabilidade por diacetato de carboxifluoresceína e iodeto de propídio (CFDA/PI, vitalidade (eosina/nigrosina) e atividade mitocondrial. Já osmolaridade e morfologia espermática foram avaliadas somente imediatamente após a coleta. No experimento 1, a centrifugação para retirada do plasma seminal resultou em maiores danos aos espermatozoides do que a separação por SpermFilter. A filtração por lã de vidro mostrou-se mais eficiente em separar células viáveis e manter a viabilidade durante o resfriamento. No experimento 2, os tratamentos com Androcoll-E e filtrado por lã de vidro foram superiores (P<0,0001) ao sêmen centrifugado quanto à motilidade, à funcionalidade de membrana, à atividade mitocondrial e à viabilidade, tanto nas amostras de sêmen fresco como de sêmen refrigerado. O Androcoll-E e a lã de vidro permitiram manter por 48h, a 5ºC, o sêmen de garanhões pôneis utilizando-se diluente à base de leite.(AU)

Effect of intramuscular injection of butafosfan and cobalamin on the quality of fresh and cooled stallion semen / Efeito da administração intramuscular de butafosfan e cobalamina na qualidade do sêmen fresco e resfriado de garanhões

The use of butafosfan in combination with cobalamin modulates many cellular metabolic functions in several species. Its use enhances productive and reproductive performance and reduces stress responses in animals. Despite all these attributes, so far there have been no controlled studies to evaluate the effects of butafosfan and cobalamin on the quality of stallion semen. The purpose of this study was to evaluate the action of butafosfan in combination with cobalamin on the quality of fresh and cooled stallion semen. Four healthy stallions were kept in the same place and under the same management conditions during the entire experiment. Stallions were randomly assigned to two treatment groups in a 2x2 crossover design. Group A stallions were treated with an intramuscular injection of butafosfan twice a week for 80 days, while group B did not receive any treatment. After that, both groups were not treated for another 80 days allowing a washout period for the treated group. Then, the groups were reversed, and group B was treated with butafosfan and group A acted as the control for another 80 days. Semen was collected twice a week, diluted in skim milk and evaluated for total sperm count, total and progressive sperm motility, membrane integrity (CFDA/PI staining) and membrane functionality (HOS test) at 0 and 24 hours after preservation at 5ºC. Data were analyzed by comparing the...(AU)

A utilização de Butafosfan em combinação com cobalamina modula uma série de funções metabólicas celulares em várias espécies. Seu uso melhora o desempenho produtivo e reprodutivo e reduz as respostas ao estresse em animais. Apesar de todos esses atributos, até agora não houve estudos controlados para avaliar os efeitos da substância Butafosfan e cobalamina sobre a qualidade do sêmen de garanhões. O objetivo deste estudo foi avaliar a ação do Butafosfan em combinação com cobalamina sobre a qualidade do sêmen fresco e resfriado de garanhões. Quatro garanhões saudáveis foram mantidos no mesmo lugar e sob as mesmas condições de manejo durante todo o experimento. Garanhões foram divididos aleatoriamente em dois grupos de tratamento em um desenho cruzado 2x2. Garanhões do grupo A foram tratados com uma injeção intramuscular de Butafosfan duas vezes por semana durante 80 dias, enquanto o grupo B não recebeu qualquer tratamento. Depois disso, ambos os grupos não foram tratados durante mais 80 dias, permitindo um período de washout para o grupo tratado. Em seguida, os grupos foram invertidos, o grupo B foi tratado com Butafosfan enquanto o grupo A agiu como controle por mais 80 dias. O sêmen foi coletado duas vezes por semana, diluído em leite desnatado e avaliado para a contagem total de espermatozoides, motilidade progressiva e total, integridade da membrana (coloração CFDA/PI) e...(AU)

Low density lipoproteins added to an extender frozen or lyophilized are evenly efficient in cryoprotecting ovine sperm cells than when 16% whole egg yolk was added / Lipoproteínas de baixa densidade em meio diluidor congelado ou liofilizado exerce o mesmo efeito crioprotetor aos espermatozoides ovinos que meio contendo 16% de gema de ovo

The aim of this study was to test different concentrations of low density lipoprotein (LDL) in replacement of whole egg yolk in extenders preserved in the aqueous or lyophilized form, for ram sperm cryopreservation using two cooling curves (-40C/min from 5 to 140C and nitrogen vapor). One ejaculate from six Santa Inês rams was collected. Each ejaculate was divided into nine different diluents as follows: Tris-16% yolk (control), and Tris with 2, 4, 6 and 8% fresh LDL, and criopreserved in the aqueous or lyophilized form. The samples were diluted to a final concentration of 100 x 106 sperm/mL and filled into 0.25 ml straws. After thaw, sperm cells were evaluated for motility and sperm kinetics (CASA), and submitted to the hypoosmotic swelling test and the evaluation of the structural integrity of sperm membranes using fluorescent dyes (CFDA: PI), as well as sperm morphology and longevity. The experimental design was randomized blocks, and results were submitted to ANOVA and the averages were compared using the Scott-Knott test. There were no differences in progressive motility and functional and structural integrity of the membrane evaluated when different concentrations of aqueous or lyophilized low density lipoproteins or egg yolk were added to the extender (P>0.05). As for the velocity of sperm movement, the control medium had some kinetic scores similar to the extender containing LDL, both aqueous and lyophilized (P> 0.05). Results were similar between cooling curves. Therefore, we conclude that the media containing all concentrations of LDL, aqueous or lyophilized, were able to protect the ram sperm cells during the cryopreservation process, as whole egg yolk did.(AU)

O objetivo deste trabalho foi testar para criopreservação de sêmen ovino diferentes concentrações de lipoproteína de baixa densidade (LBD) em substituição à gema de ovo em meios diluidores, armazenados na forma aquosa e liofilizada, utilizando-se duas curvas de congelação (-40C/min de 5 à 140C ou vapor de nitrogênio). Os ejaculados de seis carneiros da raça Santa Inês foram fracionados e distribuídos em nove tratamentos, sendo o primeiro o meio controle (Tris-gema 16%) e os demais meios Tris contendo lipoproteínas de baixa densidade nas concentrações de 2, 4, 6 e 8% (v/v), criopreservados tanto na forma aquosa quanto liofilizada. As amostras foram diluídas para a concentração final de 100 x 106 espermatozoides/mL e envasadas em palhetas de 0,25 mL. Após a descongelação foram avaliadas a motilidade e cinética espermática (CASA), morfologia e longevidade espermáticas, além da integridade funcional (HOST) e estrutural (CFDA/IP) das membranas. O delineamento experimental foi blocos ao acaso e os resultados foram submetidos a ANOVA, sendo as médias comparadas pelo teste de Scott-Knott. Quanto aos parâmetros de motilidade progressiva e integridade funcional e estrutural da membrana, todos os tratamentos testados foram similares (P>0,05). Quanto às velocidades do movimento espermático, o meio controle obteve alguns valores similares aos meios contendo LBD, tanto na forma aquosa quanto liofilizada (P>0,05). Não houve diferenças entre curvas de congelação. Dessa forma, é possível concluir que os meios contendo todas as concentrações de LBD, aquosa ou liofilizada, foram igualmente capazes de proteger as células espermáticas de ovinos, durante o processo de criopreservação, tanto quanto o meio contendo gema de ovo total.(AU)

Ejaculados individuais e pools de sêmen: diferenças em condições experimentais / Individual ejaculates and pooled semen: differences under experimental conditions

Avaliaram-se ejaculados caninos individuais e pools de sêmen submetidos a dois tratamentos de renovação do meio diluidor. Sêmen de seis cães foi coletado, na forma de ejaculados individuais e pools de sêmen, diluído na proporção de 1:1 em meio Tris-Gema, centrifugado a 500g/10min, e o pellet ressuspendido até concentração final de 50x10(6) espermatozoides/mL. O sêmen foi resfriado a 0,26ºC/min, entre 37 e 16ºC, e 0,08ºC/min, entre 16 a 8ºC, e mantido em geladeira a 5ºC por 14 dias. No Tratamento 1, o meio diluidor foi renovado a cada seis dias, e no Tratamento 2 aos 12 dias. O sêmen foi avaliado, a cada 48 horas, quanto à motilidade espermática, utilizando-se o Sperm Class Analyser® (SCA), e quanto à integridade de membranas pelo teste hiposmótico e coloração com PI/CFDA. A formação de pools de sêmen simplificou sua manipulação, principalmente com relação ao aumento do volume da amostra disponível; no entanto, resultados obtidos a partir de ejaculados individuais mostraram diferenças entre tratamentos, não identificadas nos pools de sêmen.(AU)

Individual ejaculates and pooled dog semen submitted to two treatments of medium exchange were evaluated. Semen was collected from six dogs, as individual ejaculates and pooled semen, diluted in a 1:1 ratio in Tris-Yolk medium, centrifuged at 500g/10min and ressuspended to the final concentration of 50x10(6) sptz/mL. The samples were cooled at rates of 0.26 o C/min between 37 and 16 o C, and 0.08ºC/min from 16 to 8ºC, and then kept in a refrigerator for 14 days. In Treatement 1 medium was exchanged every six days and in Treatment 2 after twelve days. The cooled samples were evaluated every 48 hours for sperm motility using the Sperm Calss Analyser® (SCA), and membrane integrity with hiposmotic swelling test and PI/CFDA stain. Pooled semen was easier to handle, mainly considering the decreased work due to volume. When submitted to medium exchange, pooled semen behaved similarly to individual ejaculates; however, results obtained from individual ejaculates showed differences between treatments, which were not apparent in pooled semen results.(AU)

Cryoprotection effectiveness of low concentrations of natural and lyophilized LDL (low density lipoproteins) on canine spermatozoa / Eficiência de baixas concentrações de lipoproteínas de baixa densidade natural e liofilizada na crioproteto de espermatozoides caninos

The aim of this study was to evaluate the use of low concentrations of natural and lyophilized low density lipoprotein (LDL) from hen's egg yolk for cryopreservation of canine semen. Different ammonium sulphate concentrations were tested to extract LDL from egg yolk. The yolk was centrifuged, and LDL was isolated using 10, 20, 40, 45, or 50 percent ammonium sulphate solution (ASS). The LDL-rich floating fraction was collected for chemical characterization. Dry matter content was lowest (P<0.05) in the LDL extracted with the 50 percent ASS. The purification of LDL increased in association with increasing ammonium sulphate concentrations. SDS-PAGE showed that the 50 percent ASS solution yielded a purer fraction of LDL from egg yolk. For semen cryopreservation, TRIS extender was used replacing 20 percent egg yolk (control) by natural or lyophilized LDL using 1, 2, and 3 percent (w/v). Semen was centrifuged (755Xg for 7 min), diluted with one of the extenders, packed into 0.5mL straws (100x106 sperm/mL), and placed in a programmable cryopreservation machine. Thawed semen (37°C/ 30s) was analyzed for sperm motility, morphology, and by the hypoosmotic and epifluorescence tests (CFDA/ PI). Natural LDL extracted with 50 percent ASS was as effective as whole egg yolk to preserve canine frozen sperm when using low concentrations. The lyophilized LDL, mainly in the two higher concentrations tested (2 and 3 percent), was unsuitable to maintain the effectiveness of the LDL cryoprotective effect on dog sperm.(AU)

O objetivo deste estudo foi avaliar o uso de baixas concentrações da lipoproteína de baixa densidade (LBD) extraída da gema do ovo de galinha, nas formas natural e liofilizada, na criopreservado do sêmen canino. Diferentes concentrações de sulfato de amônio também foram testadas na extrato da LBD da gema do ovo. A gema foi centrifugada, sendo a LBD isolada usando-se soluto saturada de sulfato de amônio (SSA) nas concentrações de 10, 20, 40, 45 e 50 por cento. A frado rica em LBD foi coletada para caracterizado química. O conteœdo de matéria seca foi menor (P<0,05) na LBD extraída com SSA 50 por cento. A pureza da LBD melhorou medida que se aumentou a concentrado de SSA utilizada. SDS-PAGE mostrou que a SSA 50 por cento produziu uma frado mais pura de LBD oriunda da gema do ovo. Para o congelamento de sêmen, o meio diluidor TRIS teve a gema do ovo a 20 por cento (controle) substituída pela LBD a 1, 2 e 3 por cento (p/v), nas formas natural e liofilizada. O sêmen foi centrifugado (755xg por 7min), diluído em um dos meios diluidores em teste e envasado em palhetas de 0,5mL (100x106 sptz/mL), sendo congelado em máquina de congelamento programável. O sêmen descongelado (37°C/30s) foi analisado quanto motilidade e morfologia espermática e nos testes hiposm-tico e de epifluorescência (DACF/IP). A LBD natural extraída com SSA 50 por cento foi tão eficiente quanto a gema do ovo na preservado do espermatozoide canino congelado nas baixas concentrações testadas. A LBD liofilizada, principalmente as duas maiores concentrações (2 e 3 por cento), não foi adequada para manter o efeito crioprotetor da LBD sobre o espermatozoide canino.(AU)

TAMPÕES E ANTIOXIDANTES NA QUALIDADE DO SÊMEN DE PÔNEIS

A inseminação artificial é utilizada como uma importante ferramenta para o melhoramento reprodutivo, tanto com sêmen resfriado ou congelado. O primeiro experimento teve como objetivo identificar um tampão de pH para resfriamento de sêmen de pôneis por 48 horas a 5°C e 15°C. O efeito de cinco tampões (TES (ácido N-tris (hidroximetil) metil-2-aminoetanosulfônico), PIPES (ácido piperaxín-N,N'-bis(2-etanosulfônico)), BES (ácido N,N-Bis(2-18hidroxietil)-2-aminoetanosulfônico), MES (ácido 4-morfolinoetanosulfônico) e HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etanosulfônico)) foi avaliado em um diluente composto de leite em pó desnatado e glicose. Os testes do diluente com os tampões BES, MES e TES foram conduzidos com o sêmen fresco de oito pôneis e no sêmen resfriado por 48 h a 15°C. Uma amostra de cada grupo foi utilizada para análise da motilidade, pH, osmolaridade, teste hiposmótico, atividade mitocondrial (MTT) e integridade de membrana através das sondas fluorescentes. O pH e a osmolaridade dos diluentes sem o sêmen também foram avaliados. Os dados foram analisados por análise de variância e pelo teste de Tukey, quando P < 0.05 foi significante. A osmolaridade do sêmen diluído não variou entre diluentes e foi para o BES 350.91 ± 11.24 mOsm, MES 350.41 ± 11.76 mOsm e TES 350 ± 12.96 mOsm. O pH do sêmen após diluição nos respectivos diluentes variou entre as horas avaliadas (P < 0.05) e não variou com o passar do tempo o que evidencia o efeito tamponante dos diluentes. A osmolaridade dos dilue ntes foi similar entre os tampões BES (366 ± 5.47 mOsm), MES (370 ± 6.12 mOsm) ou TES (371 ± 5.47 mOsm) a fresco e sem adição de sêmen. Já o pH variou (P < 0.05) de acordo com o tampão. No experimento a 5°C ocorreu decréscimo na porcentagem de motilidade t otal, progressiva e local do sêmen resfriado após 24 h e 48 h comparado a avaliação a fresco em todos os grupos. No entanto, a porcentagem de espermatozoides móveis a fresco, 24 h e 48 h a 5°C entre tratamentos foi similar. A porcentagem de espermatozoides reativos ao teste hiposmótico, e com atividade mitocondrial não diferiu entre tratamentos. No experimento a 15°C o vigor e motilidade total, progressiva e local foram similares entre os tampões BES, MES e TES em cada período avaliado. A osmolaridade do sêmen diluído não variou entre diluentes e foi para o BES 360.93 ± 10.52 mOsm, MES 361.47 ± 6.79 mOsm e TES 361.56 ± 7.68 mOsm. Devido as características individuais de cada tampão o pH do sêmen diluído variou entre os diluentes com os tampões utilizados. A porcentagem de espermatozoides reativos ao teste hiposmótico, com atividade mitocondrial e membrana intacta observada com CFDA e PI não diferiu entre tratamentos. Evidenciou-se que tanto BES, MES ou TES podem ser utilizados no armazenamento e transporte do sêmen de pôneis durante 48 h a 5°C ou 15°C. O segundo experimento teve como objetivo foi avaliar a influência da suplementação de ácidos graxos poli-insaturados sobre a qualidade de sêmen de pôneis da raça Brasileira a fresco e após congelamento. Oito pôneis receberam sua dieta convencional não suplementada (grupo controle) ou dieta convencional e 70 g de farinha de alga Schizochytrium sp rica em DHA (grupo PUFA). O efeito da Vitamina E (1 mM, DL--tocoferol ), adicionada ao diluente de congelamento para sêmen também foi avaliado sobre a qualidade seminal, antes e após o congelamento do sêmen. O sêmen foi coletado a cada 15 dias durante 60 dias. Os garanhões tratados passaram a controle e vice-versa após um intervalo de sessenta dias. O sêmen foi avaliado a fresco e após o congelamento. Motilidade e vigor foram avaliados a fresco. Após o descongelamento motilidade, funcionalidade de membrana, integridade de membrana e análise computadorizada da motilidade foram avaliados. Os valores médios para os parâmetros avaliados a fresco no grupo PUFA e controle foram similares. Os valores médios da motilidade total, progressiva e local, hiposmótico, CFDA/PI e análise computadorizada de sêmen suplementados com DHA e o grupo controle pós-descongelamento não diferiram. A associação da suplementação de DHA e Vitamina E adicionada ao diluente não potencializou a capacidade antioxidante do diluente durante o congelamento. A associação da suplementação de DHA e Vitamina E adicionada ao diluente resultou em diminuição da motilidade total e progressiva comparada ao grupo não suplementado (controle). A suplementação de 70 g de farinha de alga Schizochytrium sp rica em DHA e ou a inclusão de 1 mM de vitamina E ao diluente de congelamento de sêmen em pôneis da raça Brasileira não foi eficiente para promover melhoria na viabilidade seminal após a coleta ou mesmo após o congelamento.

Artificial insemination with cooled and frozen semen is an important tool for breeding industry. The first experiment aimed to identify a pH buffer for cooling semen of ponies for 48 h at 5°C and 15°C. The effect of five buffers (TES (N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid), PIPES (piperaxin-N, N'-bis (2-ethanesulfonic acid)), BES (N, N-Bis (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid)) was evaluated in a extender composed of skimm milk powder and glucose. Analysis with the BES, MES and TES buffers were performed in fresh semen of eight ponies and in cooled semen for 48 h at 15°C. A sample from each group was used for analysis of motility, pH, osmolarity, hyposmotic test, mitochondrial activity (MTT) and membrane integrity through fluorescent probes. The pH and osmolarity of the extenders without semen were also evaluated. Data were assessed by analysis of variance and Tukey's test, when P <0.05 was considered significant. Osmolarity of the diluted semen did not differ between extenders and was for BES 350.91 ± 11.24 mOsm, MES 350.41 ± 11.76 mOsm and TES 350 ± 12.96 mOsm. The pH of the semen after dilution in the respective extenders varied between the hours (P <0.05) and did not change over time as evidenced by the buffering effect of the extenders. Extender osmolarity was similar between BES (366 ± 5.47 mOsm), MES (370 ± 6.12 mOsm) or TES (371 ± 5.47 mOsm) buffers after dilut ion and without addition of semen. The pH varied (P <0.05) according to the buffer. In the experiment at 5°C all treatments showed a decrease in the percentage of total, progressive and local motility of the cooled semen after 24 h and 48 h compared to the fresh. However, in the percentage of mot ile sperm to fresh, 24 h and 48 h at 5°C between treatments was similar. Percentage of spermatozoa reactive to the hyposmotic test, and with mitochondrial activity did not differ between treatments. In the experiment at 15°C total, progressive and local vigor and motility were similar between BES, MES and TES buffers in each period. Osmolarity of the diluted semen did not differ between extenders and was for BES 360.93 ± 10.52 mOsm, MES 361.47 ± 6.79 mOsm and TES 361.56 ± 7.68 mOsm. Due to the individual characteristics of each buffer , diluted semen pH varied between the extenders with the buffers used. Percentage of spermatozoa reactive to the hyposmotic test, with mitochondrial activity and intact membrane observed with CFDA and PI did not differ between treatments. We concluded that BES, MES or TES can be used in the storage and transport of ponies semen for 48 h at 5°C or 15°C. The second experiment aimed to evaluate the influence of polyunsatura ted fatty acid supplementation in the fresh and after freezing semen of Brazilian ponies. Eight ponies received their conventional diet (control group) or conventional diet and 70 g of DHA -rich Schizochytrium sp algae meal (PUFA group). The effect of Vitamin E (1 mM, DL--tocopherol) added to the freezing diluent for semen was also evaluated on seminal quality, before and after freezing. Semen was collected every 15 days during 60 days. Stallions were reversed in treatments after an interval of sixty days. Semen was evaluated fresh and after freezing. Motility and vigor were estimated in the fresh semen. After thawing motility, membrane functionality, membrane integrity and computed motility analysis were evaluated. Mean values for fresh parameters evaluated in the PUFA and control groups were similar. Mean values of total, progressive and local motility, hyposmotic, CFDA/PI and computerized analysis of semen supplemented with DHA and post -thaw control group did not differ. The combination of DHA and Vitamin E supplementation added to the diluent did not potentiate the antioxidant capacity of the diluent during freezing and resulted in decreased total and progressive motility compared to the non-supplemented group. Supplementation of 70 g of DHA-rich microalgae Schizochytrium sp and the addition of 1 mM vitamin E to the semen freezing diluent in Brazilian ponies was not efficient to promote improvement in seminal viability after collection or even after freezing.

Influence of Caffeine and Chondroitin Sulfate on Swine Sperm Capacitation and In Vitro Embryo Production

Background: The establishment of an in vitro production (IVP) of embryo in swine allows the generation of embryos with the same quality as in vivo produced embryos with less costs and time. In order to achieve successful fertilization under normal circumstances in vivo, mammalian spermatozoa must first undergo capacitation and then acrosome reaction. The purpose of this study was compared the efficacious of IP/CFDA fluorescence and Coomassie Blue G (CB) staining to detect capacitated sperm cells in refrigerated and fresh semen. Morever, it was investigated the efficacious of caffeine and chondroitin sulphate to promote in vitro sperm capacitation and in vitro embryo produced (IVP) of swine embryos. Materials, Methods & Results: A sperm-rich fraction from ejaculate was obtained using the gloved-hand method and the gel- free fraction was separated using sterile gauze. The semen was diluted in BTS at a final concentration of 1.5 x 10 8 cells/mL. The sperm suspension was incubated for 2 h at 25°C, refrigerated and maintained for 1 h at 15-18°C (refrigerated group) or used immediately (fresh group). Sperm capacitation was assessed by IP/CFDA fluorescence and CB staining for both fresh and refrigerated semen. For PI/CFDA evaluation, a final solution containing 1.7 mM formaldehyde, 7.3 mM PI and 20 mM CFDA in 950 μL saline was prepared. In the dark, 40 μL PI/CFDA final solution was added to 10 μL semen and after 8 min, slides were analyze d on epifluorescence microscopy. For CB evaluation, sperm cells were fixed in 4% paraformaldehyde for 10 min and centrifuged twice at 320 x g in ammonium acetate pH 9 for 8 min. A smear was made and stained with 2.75 mg/mL CB in solution containing 12.5% methanol, 25% glacial acetic acid and 62.5% water, for 2 min. The smear was washed in running water, air dried and sealed with Permount ® , diluted 2:1 in xilol to avoid staining oxidation. (...)

Influence of Caffeine and Chondroitin Sulfate on Swine Sperm Capacitation and In Vitro Embryo Production

Background: The establishment of an in vitro production (IVP) of embryo in swine allows the generation of embryos with the same quality as in vivo produced embryos with less costs and time. In order to achieve successful fertilization under normal circumstances in vivo, mammalian spermatozoa must first undergo capacitation and then acrosome reaction. The purpose of this study was compared the efficacious of IP/CFDA fluorescence and Coomassie Blue G (CB) staining to detect capacitated sperm cells in refrigerated and fresh semen. Morever, it was investigated the efficacious of caffeine and chondroitin sulphate to promote in vitro sperm capacitation and in vitro embryo produced (IVP) of swine embryos. Materials, Methods & Results: A sperm-rich fraction from ejaculate was obtained using the gloved-hand method and the gel- free fraction was separated using sterile gauze. The semen was diluted in BTS at a final concentration of 1.5 x 10 8 cells/mL. The sperm suspension was incubated for 2 h at 25°C, refrigerated and maintained for 1 h at 15-18°C (refrigerated group) or used immediately (fresh group). Sperm capacitation was assessed by IP/CFDA fluorescence and CB staining for both fresh and refrigerated semen. For PI/CFDA evaluation, a final solution containing 1.7 mM formaldehyde, 7.3 mM PI and 20 mM CFDA in 950 μL saline was prepared. In the dark, 40 μL PI/CFDA final solution was added to 10 μL semen and after 8 min, slides were analyze d on epifluorescence microscopy. For CB evaluation, sperm cells were fixed in 4% paraformaldehyde for 10 min and centrifuged twice at 320 x g in ammonium acetate pH 9 for 8 min. A smear was made and stained with 2.75 mg/mL CB in solution containing 12.5% methanol, 25% glacial acetic acid and 62.5% water, for 2 min. The smear was washed in running water, air dried and sealed with Permount ® , diluted 2:1 in xilol to avoid staining oxidation. (...)(AU)

Comparison of CapriPure® and Percoll® density gradients for sperm separation of frozen-thawed goat spermatozoa

Frozen - thawed semen from six Boer bucks was pooled and used to compare the recently available commercial product CapriPure ® with Percoll ® for sperm quality . Sperm quality parameters such as sperm motility, concentration, membrane integrity (PI/CFDA), acrosome integrity (FITC - PNA) and mitochondrial activity (JC - 1) were evaluated before and after sperm processing using CapriPure ® and Percoll ® density gradient s . There was a significant r eduction (P < 0.05) in the percentage of spermatozoa with intact acrosomes following Percoll ® gradient centrifugation. However , t here was a significant increase in the percentage of spermatozoa with high mitochondrial membrane potential in both CapriPure ® (P < 0.01) and Percoll ® (P < 0.05) density gradient centrifugation methods . The samples selected using the CapriPure ® gradient achieved higher numerical values of membrane integrity, acrosome integrity as well as high mitochondrial membrane potential and s howed a tendency for improvement of sperm parameters compared with the Percoll ® gradient, suggesting that CapriPure ® is a good alternative to Percoll ® for goat sperm separation . However, further studies are needed to assess the fertilizing capacity of sper matozoa following the use of the CapriPure ® gradient.

Comparison of CapriPure® and Percoll® density gradients for sperm separation of frozen-thawed goat spermatozoa

Frozen - thawed semen from six Boer bucks was pooled and used to compare the recently available commercial product CapriPure ® with Percoll ® for sperm quality . Sperm quality parameters such as sperm motility, concentration, membrane integrity (PI/CFDA), acrosome integrity (FITC - PNA) and mitochondrial activity (JC - 1) were evaluated before and after sperm processing using CapriPure ® and Percoll ® density gradient s . There was a significant r eduction (P < 0.05) in the percentage of spermatozoa with intact acrosomes following Percoll ® gradient centrifugation. However , t here was a significant increase in the percentage of spermatozoa with high mitochondrial membrane potential in both CapriPure ® (P < 0.01) and Percoll ® (P < 0.05) density gradient centrifugation methods . The samples selected using the CapriPure ® gradient achieved higher numerical values of membrane integrity, acrosome integrity as well as high mitochondrial membrane potential and s howed a tendency for improvement of sperm parameters compared with the Percoll ® gradient, suggesting that CapriPure ® is a good alternative to Percoll ® for goat sperm separation . However, further studies are needed to assess the fertilizing capacity of sper matozoa following the use of the CapriPure ® gradient.(AU)

SEPARAÇÃO ESPERMÁTICA PRÉ REFRIGERAÇÃO DO SÊMEN EQUINO

As biotécnicas da reprodução na espécie equina avançaram na última década, tanto em conhecimento agregado por pesquisas como também pela demanda do mercado. No entanto, na espécie equina machos com subfertilidade são diagnosticados frequentemente com elevado número de espermatozoides com alterações morfológica e/ou imóveis. A utilização apenas de células viáveis para realizar o processo de resfriamento busca evitar perda de material (diluente) e produção de metabólitos tóxicos aos espermatozoides viáveis. O objetivo deste estudo foi utilizar a separação espermática (lã de vidro e centrifugação com Androcoll®) pré-resfriamento para incrementar a viabilidade do sêmen de garanhões pôneis refrigerados a 5ºC durante 48h. Os parâmetros motilidade, funcionalidade de membrana (HOST), viabilidade espermática (CFDA/PI), atividade mitocondrial e morfologia espermática foram avaliados no sêmen fresco e refrigerado (24 e 48h). A utilização da filtração por lã de vidro ou Androcoll® préresfriamento do sêmen equino selecionou espermatozoides com maior motilidade, funcionalidade de membrana, viabilidade espermática e atividade mitocondrial. Adicionalmente, a filtração por lã de vidro proporcionou refrigerar sêmen com elevado número de células morfologicamente normais sem perdas significativas de espermatozoides pelo processo de filtração. Tanto a técnica de lã de vidro como a centrifugação com Androcoll® mostraram-se eficientes em separar ejaculados com maior viabilidade para o resfriamento. Já a técnica de lã de vidro apresenta-se como uma técnica de baixo custo e de fácil execução para ser aplicada tanto para pequenos, ou grandes volumes de sêmen.

The reproduction biotechnologies in equine species have advanced in the last decade both in aggregate knowledge by research as well as the market demand. However, it in the equine species often with male subfertility where the ejaculate has a high number of sperm with morphological and / or property changes. The use of only viable cells to perform the cooling process seeks to avoid loss of material (diluent) and production of toxic metabolites to viable sperm. The aim of this study was to use the sperm separation (glass and spin wool with Androcoll®) pre-cooling to increase the viability of semen chilled ponies stallions at 5 ° C for 48 hours. We evaluated the motility parameters, membrane functionality (HOST), sperm viability (CFDA / PI), mitochondrial activity and morphology in fresh and chilled semen (24 and 48h). The use of filtration glass wool or Androcoll® pre-cooling of equine semen selected sperm with higher motility, functionality membrane, sperm viability and mitochondrial activity. In addition to filtration through glass wool afforded cooling semen with a high number of morphologically normal cells without significant losses of spermatozoids the filtration process. Both glass wool technique as centrifugation with Androcoll® were efficient in separating ejaculated more viability for cooling. Already glass wool technique presents itself as a low cost and simple technique to be applied to both small or large volumes of semen

Criopreservação de espermatozóides equinos comparando duas curvas de congelamento combinadas com diluentes comerciais: uma análise laboratorial

Durante o processo de criopreservação de sêmen, os espermatozóides sofrem alguns danos que resultam na diminuição da fertilidade deste. O presente estudo foi realizado a fim de avaliar o efeito da utilização, combinada de duas curvas de congelamento com dois diluentes comerciais sobre a criopreservação de sêmen equino. Foram analisados 20 ejaculados. As amostras foram avaliadas pela motilidade progressiva e total do sêmen pós-descongelamento e pela integridade e funcionalidade da membrana dos espermatozóides. A combinação entre curva automatizada e Botu-Crio ® apresentou as maiores médias, nas análises de motilidade total (55,53%) e progressiva (17,25%), após o descongelamento. O diluente Botu-Crio®, isoladamente, apresentou também os melhores resultados quando foram realizadas as análises de integridade (CFDA/PI) e funcionalidade de membrana pelo teste hiposmótico.

Criopreservação do sêmen equino: comparação da gema de ovo de ema (Rhea americana ) com a gema de ovo de galinha

O objetivo deste trabalho foi comparar a utilização de diluentes comerciais à base de gema de ovo de galinha com os mesmos diluentes, nos quais se substituiu a gema de galinha pela de ovo de ema (Rhea americana). Foram utilizados Seis garanhões da raça Crioula, comprovadamente férteis e no período fora da estação de monta e utilizados seis ejaculados de cada garanhão. O sêmen foi avaliado macroscopicamente quanto ao volume, aspecto e coloração, a seguir avaliou-se a motilidade progressiva e total. Posteriormente o sêmen foi dividido em quatro alíquotas e diluído na proporção 1:1 com o diluente, Equimix (Nutricell Nutrientes Celulares) para centrifugação. Para adição do diluente de congelamento foram utilizados: diluente A (FR-5, Nutricell Nutrientes Celulares) e diluente B (Botu-crio, Biotech Botucatu S.A.) adicionados de 20 % de gema de ovo de ema, ou de 20 % de gema de ovo de galinha. As amostras foram envasadas, identificadas e submetidas a congelamento conforme o protocolo. As palhetas foram descongeladas, após um período mínimo de 7 dias e examinadas para os seguintes quesitos: motilidade total e progressiva, e integridade física e funcional da membrana plasmática do espermatozoide. Os diluentes comerciais com ou sem adição de gema de ovo de ema não apresentaram diferenças em relação à motilidade total e progressiva, porém observou-se diferença nos parâmetros quando comparados os diluentes comerciais. Houve diferença na funcionalidade da membrana apenas quando comparado diluente A e B com gema de ovo de ema. No quesito integridade de membrana não foi observado diferença estatística. Estes resultados demonstram que a gema de ovo de ema (Rhea americana) pode ser uma alternativa para produção de diluentes para congelamento de sêmen de equinos

The aim of this study was to compare the use of two commercial extenders using chicken egg yolk with the same extenders, to which ema (Rhea americana) egg yolk was added. Six Criollo breed stallions were used during the off-breeding season period. Six collections per stallion were used. The ejaculate aspect, total and progressive motility were evaluated with a microscope; concentration was determined with a Neubauer counting chamber. After evaluation, semen samples were divided in two aliquots and diluted 1:1 in each of the centrifugation extender Equimix (Nutricell Nutrientes Celulares). For freeze that semen we used two commercial extenders: A (extender with glycerol) or B (extender with methylformamide) and was added 20% rhea egg yolk or 20% chicken egg yolk . Semen samples were examined at least 1 week after freezing, for total and progressive motility, physical and functional membrane integrity (HOST test and CFDA-PI fluorescence) (Lagares et al. 1998; Harrison & Vickers, 1990). The extenders of a given brand with or without rhea egg yolk had no significant difference according to total and progressive motility, although there was difference (p = 0,05) between extenders when different brands were compared, no matter if they were added Rhea egg yolk or not. Membrane functionality showed difference only when compared Extender A and B with Rhea egg yolk. Membrane integrity had no significant difference between all the treatments. These results show that Rhea egg yolk might be an alternative to making an equine semen extender

Criopreservação de espermatozóides equinos comparando duas curvas de congelamento combinadas com diluentes comerciais: uma análise laboratorial

Durante o processo de criopreservação de sêmen, os espermatozóides sofrem alguns danos que resultam na diminuição da fertilidade deste. O presente estudo foi realizado a fim de avaliar o efeito da utilização, combinada de duas curvas de congelamento com dois diluentes comerciais sobre a criopreservação de sêmen equino. Foram analisados 20 ejaculados. As amostras foram avaliadas pela motilidade progressiva e total do sêmen pós-descongelamento e pela integridade e funcionalidade da membrana dos espermatozóides. A combinação entre curva automatizada e Botu-Crio ® apresentou as maiores médias, nas análises de motilidade total (55,53%) e progressiva (17,25%), após o descongelamento. O diluente Botu-Crio®, isoladamente, apresentou também os melhores resultados quando foram realizadas as análises de integridade (CFDA/PI) e funcionalidade de membrana pelo teste hiposmótico.

Criopreservação de espermatozóides equinos comparando duas curvas de congelamento combinadas com diluentes comerciais: uma análise laboratorial

Durante o processo de criopreservação de sêmen, os espermatozóides sofrem alguns danos que resultam na diminuição da fertilidade deste. O presente estudo foi realizado a fim de avaliar o efeito da utilização, combinada de duas curvas de congelamento com dois diluentes comerciais sobre a criopreservação de sêmen equino. Foram analisados 20 ejaculados. As amostras foram avaliadas pela motilidade progressiva e total do sêmen pós-descongelamento e pela integridade e funcionalidade da membrana dos espermatozóides. A combinação entre curva automatizada e Botu-Crio ® apresentou as maiores médias, nas análises de motilidade total (55,53%) e progressiva (17,25%), após o descongelamento. O diluente Botu-Crio®, isoladamente, apresentou também os melhores resultados quando foram realizadas as análises de integridade (CFDA/PI) e funcionalidade de membrana pelo teste hiposmótico.

Criopreservação de espermatozóides equinos comparando duas curvas de congelamento combinadas com diluentes comerciais: uma análise laboratorial

Durante o processo de criopreservação de sêmen, os espermatozóides sofrem alguns danos que resultam na diminuição da fertilidade deste. O presente estudo foi realizado a fim de avaliar o efeito da utilização, combinada de duas curvas de congelamento com dois diluentes comerciais sobre a criopreservação de sêmen equino. Foram analisados 20 ejaculados. As amostras foram avaliadas pela motilidade progressiva e total do sêmen pós-descongelamento e pela integridade e funcionalidade da membrana dos espermatozóides. A combinação entre curva automatizada e Botu-Crio ® apresentou as maiores médias, nas análises de motilidade total (55,53%) e progressiva (17,25%), após o descongelamento. O diluente Botu-Crio®, isoladamente, apresentou também os melhores resultados quando foram realizadas as análises de integridade (CFDA/PI) e funcionalidade de membrana pelo teste hiposmótico.

Criopreservação de espermatozóides equinos comparando duas curvas de congelamento combinadas com diluentes comerciais: uma análise laboratorial

Durante o processo de criopreservação de sêmen, os espermatozóides sofrem alguns danos que resultam na diminuição da fertilidade deste. O presente estudo foi realizado a fim de avaliar o efeito da utilização, combinada de duas curvas de congelamento com dois diluentes comerciais sobre a criopreservação de sêmen equino. Foram analisados 20 ejaculados. As amostras foram avaliadas pela motilidade progressiva e total do sêmen pós-descongelamento e pela integridade e funcionalidade da membrana dos espermatozóides. A combinação entre curva automatizada e Botu-Crio ® apresentou as maiores médias, nas análises de motilidade total (55,53%) e progressiva (17,25%), após o descongelamento. O diluente Botu-Crio®, isoladamente, apresentou também os melhores resultados quando foram realizadas as análises de integridade (CFDA/PI) e funcionalidade de membrana pelo teste hiposmótico.

Criopreservação de espermatozóides equinos comparando duas curvas de congelamento combinadas com diluentes comerciais: uma análise laboratorial

Durante o processo de criopreservação de sêmen, os espermatozóides sofrem alguns danos que resultam na diminuição da fertilidade deste. O presente estudo foi realizado a fim de avaliar o efeito da utilização, combinada de duas curvas de congelamento com dois diluentes comerciais sobre a criopreservação de sêmen equino. Foram analisados 20 ejaculados. As amostras foram avaliadas pela motilidade progressiva e total do sêmen pós-descongelamento e pela integridade e funcionalidade da membrana dos espermatozóides. A combinação entre curva automatizada e Botu-Crio ® apresentou as maiores médias, nas análises de motilidade total (55,53%) e progressiva (17,25%), após o descongelamento. O diluente Botu-Crio®, isoladamente, apresentou também os melhores resultados quando foram realizadas as análises de integridade (CFDA/PI) e funcionalidade de membrana pelo teste hiposmótico.