Uterine infusion of conceptus fragments changes the protein profile from cyclic mares

This experiment aimed to compare at day seven after ovulation, the protein profile of uterine fluid in cyclic mares with mares infused two days before with Day 13 conceptus fragments. Experimental animals were ten healthy cyclic mares, examined daily to detect ovulation (Day 0) as soon as estrus was confirmed. On day seven, after ovulation, uterine fluid was collected, constituting the Cyclic group (n = 10). The same mares were examined in the second cycle until ovulation was detected. On day five, after ovulation, fragments from a previously collected concepti were infused into each mare's uterus. Two days after infusion, uterine fluid was collected, constituting the Fragment group (n = 10). Two-dimensional electrophoresis technique processed uterine fluid samples. A total of 373 spots were detected. MALDI-TOF/TOF and NanoUHPLC-QTOF mass spectrometry identified twenty spots with differences in abundance between the Cyclic and Fragment group. Thirteen proteins were identified, with different abundance between groups. Identified proteins may be related to embryo-maternal communication, which involves adhesion, nutrition, endothelial cell proliferation, transport, and immunological tolerance. In conclusion, conceptus fragments signalized changes in the protein profile of uterine fluid seven days after ovulation in comparison to the observed at Day 7 in the same cyclic mares.

Uterine infusion of conceptus fragments changes the protein profile from cyclic mares

This experiment aimed to compare at day seven after ovulation, the protein profile of uterine fluid in cyclic mares with mares infused two days before with Day 13 conceptus fragments. Experimental animals were ten healthy cyclic mares, examined daily to detect ovulation (Day 0) as soon as estrus was confirmed. On day seven, after ovulation, uterine fluid was collected, constituting the Cyclic group (n = 10). The same mares were examined in the second cycle until ovulation was detected. On day five, after ovulation, fragments from a previously collected concepti were infused into each mare's uterus. Two days after infusion, uterine fluid was collected, constituting the Fragment group (n = 10). Two-dimensional electrophoresis technique processed uterine fluid samples. A total of 373 spots were detected. MALDI-TOF/TOF and NanoUHPLC-QTOF mass spectrometry identified twenty spots with differences in abundance between the Cyclic and Fragment group. Thirteen proteins were identified, with different abundance between groups. Identified proteins may be related to embryo-maternal communication, which involves adhesion, nutrition, endothelial cell proliferation, transport, and immunological tolerance. In conclusion, conceptus fragments signalized changes in the protein profile of uterine fluid seven days after ovulation in comparison to the observed at Day 7 in the same cyclic mares.(AU)

Aspects of embryo-maternal communication in establishment of pregnancy in cattle

Establishment of pregnancy in mammals requires reciprocal molecular communication between the conceptus and endometrium that modifies the endometrial transcriptome and uterine luminal milieu to support pregnancy. Due to the small size of the early embryo and elongating conceptus relative to the volume of the uterine lumen, collection of endometrium adjacent to the developing conceptus is difficult following conventional uterine flushing methods in cattle. Use of endometrial explants in culture can overcome this challenge and reveal information about the dialogue between the developing embryo and the uterus. The aim of this short review is to summarize some of our recent findings in relation to embryo maternal interaction during bovine pregnancy establishment and to put them in the wider context of fertility in cattle.

Aspects of embryo-maternal communication in establishment of pregnancy in cattle

Establishment of pregnancy in mammals requires reciprocal molecular communication between the conceptus and endometrium that modifies the endometrial transcriptome and uterine luminal milieu to support pregnancy. Due to the small size of the early embryo and elongating conceptus relative to the volume of the uterine lumen, collection of endometrium adjacent to the developing conceptus is difficult following conventional uterine flushing methods in cattle. Use of endometrial explants in culture can overcome this challenge and reveal information about the dialogue between the developing embryo and the uterus. The aim of this short review is to summarize some of our recent findings in relation to embryo maternal interaction during bovine pregnancy establishment and to put them in the wider context of fertility in cattle.(AU)

Understanding the uterine environment in early pregnancy in cattle: How have the omicsenhanced our knowledge?

Early pregnancy loss in cattle can be attributed to a myriad of sources. One key factor that can influence early pregnancy success or loss is the influence and interactions between the maternal environment and the developing embryo/conceptus. Recent advancesin high-throughput ‘omics' technologies coupled with improved bioinformatics capabilities represent a promising avenue for enhancing our understanding of fundamental developmental events– which would have direct agricultural, veterinary, and economic benefits. Thusly this review revolves around recent applications of advanced transcriptomic, proteomic, and metabolomic analyses within a bovine uterine secretomic and interactomic context, with an overriding aim to highlight the advantages of these emerging fields whilst identify ingareas for improvement, consideration, and further research and development.

Understanding the uterine environment in early pregnancy in cattle: How have the omicsenhanced our knowledge?

Early pregnancy loss in cattle can be attributed to a myriad of sources. One key factor that can influence early pregnancy success or loss is the influence and interactions between the maternal environment and the developing embryo/conceptus. Recent advancesin high-throughput ‘omics' technologies coupled with improved bioinformatics capabilities represent a promising avenue for enhancing our understanding of fundamental developmental eventswhich would have direct agricultural, veterinary, and economic benefits. Thusly this review revolves around recent applications of advanced transcriptomic, proteomic, and metabolomic analyses within a bovine uterine secretomic and interactomic context, with an overriding aim to highlight the advantages of these emerging fields whilst identify ingareas for improvement, consideration, and further research and development.(AU)

Extracellular vesicles secreted by bovine embryos produced in vivo and in vitro: miRNAs content and molecular effects in endometrial and luteal tissues

BRIDI, A. Vesículas extracelulares secretadas por embriões bovinos produzidos in vivo e in vitro: conteúdo de miRNAs e os efeitos moleculares sobre o endométrio e o corpo lúteo. 254 f. Tese (Doutorado) Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga-SP, 2021. Perfis metabólicos, padrões de expressão gênica, desenvolvimento embrionário, capacidade de estabelecer e manter gestações precoces são diferenças encontradas quando embriões bovinos produzidos in vivo e in vitro são comparados. Para que a gestação tenha sucesso é necessária uma perfeita comunicação entre o embrião e o organismo materno. Vesículas extracelulares pequenas (sEVs) fazem parte dessa comunicação e carregam moléculas bioativas, como miRNAs, que podem atuar em células-alvo dentro do sistema reprodutivo bovino. Com isso, nossa hipótese é que embriões bovinos produzidos in vivo e in vitro secretam sEVs contendo diferentes miRNAs que podem modular diferencialmente o padrão de expressão gênica endometrial e o perfil de miRNAs do corpo lúteo. Para isso, primeiramente, investigamos o conteúdo de miRNA em blastocistos eclodidos produzidos in vivo ou in vitro e, em sEVs secretadas por eles. Blastocistos eclodidos produzidos in vivo ou in vitro, no dia 9 de desenvolvimento, possuem diferentes perfis de miRNA. EVs pequenas secretadas por eles, do dia 7 até o dia 9 de desenvolvimento, contém miRNAs diferentes. Esses miRNAs diferentemente expressos são preditos por regularem vias envolvidas no desenvolvimento embrionário inicial e na receptividade endometrial. Por meio disso, as primeiras interações entre o embrião e o organismo materno podem ser modificadas, e isso pode afetar o sucesso da gestação. Em segundo lugar, investigamos as alterações no transcriptoma global do endométrio após o co-cultivo de explantes endometriais com um blastocisto produzido in vivo ou in vitro no dia 7 do desenvolvimento. Genes diferentemente expressos foram identificados no endométrio e estão associados com a presença e origem do embrião. Além disso, sEVs presentes nos meios condicionados (C.M.) por essas células embrionárias e endometriais contém diferentes miRNAs, que são preditos por modularem a via de sinalização da oxitocina. Finalmente, para compreender melhor se a comunicação entre o embrião, o endométrio e o corpo lúteo pode ser intermediada por sEVs, explantes luteais foram tratados com sEVs presentes nos C.M. por explantes endometriais cultivados sozinhos ou com um blastocisto bovino produzido in vivo ou in vitro no dia 7 do desenvolvimento. O perfil de miRNAs foi modificado nos explantes luteais tratados com essas sEVs e, nós podemos observar um efeito da presença e origem dos embriões nessas alterações. Juntos, esses resultados sugerem que sEVs intermedeiam a comunicação inicial entre o embrião, endométrio e o corpo lúteo, contribuindo para manter a viabilidade e funcionalidade luteal. Entretanto, futuros experimentos precisam ser realizados para avaliar efeitos biológicos específicos desses miRNAs carreados por essas sEVs no endométrio e no corpo lúteo. Além disso, a origem do embrião (in vivo ou in vitro) modifica as interações entre ele, o endométrio e o corpo lúteo, sugerindo fortemente que esses embriões tenham necessidades distintas para se desenvolverem.

BRIDI, A., Extracellular vesicles secreted by bovine embryos produced in vivo and in vitro: miRNAs content and molecular effects in endometrial and luteal tissues. 2021. 254 f. Tese (Doutorado) Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga-SP, 2021. Metabolic profiles, gene expression patterns, embryonic development, and the ability to establish and sustain early pregnancies are differences founded when in vivo- and in vitro- produced bovine embryos are compared. To the establishment of a successful pregnancy the perfect embryo- maternal communication is needed. Small extracellular vesicles (sEVs) are part of this crosstalk and carry bioactive molecules such as miRNAs that can act on target bovine cells within thereproductive system. Thereby, our hypothesis is that in vivo and in vitro bovine embryos secrete sEVs containing different miRNAs that can differentially modulate endometrial gene expression pattern and miRNAs profile in the corpus luteum (CL). To address this hypothesis, firstly, we investigated the miRNA content of in vivo and in vitro hatched blastocysts and in sEVs secreted by them. Day 9 in vivo or in vitro hatched blastocysts have distinct miRNA profiles. Small EVs secreted by them from day 7 up to day 9 of development contain different miRNAs. These miRNAs differently expressed are predicted to regulate pathways involved with early embryonic development and endometrial receptivity. Thereby, early embryo-maternal interactions can be modified and consequently can affect pregnancy success. Secondly, we investigated changes in the endometrial global transcriptome after the co-culture of endometrial explants with a day 7 in vivo or in vitro blastocysts. Differently expressed genes were identified in the endometrium and are associated with the embryo's presence or origin. Moreover, sEVs present in the conditioned media (C.M.) by these embryonic and endometrial cells contain different miRNAs, which are predicted to modulate the oxytocin signaling pathway. Finally, to understand if the communication among embryo, endometrium, and corpus luteum can be mediated by sEVs, luteal explants were treated with sEVs from C.M. by endometrial explants alone or cultured with a day 7 in vivo or in vitro blastocysts. MicroRNAs profile was modified in luteal explants treated with these sEVs, and we can observe an effect of the embryo presence and origin in these alterations. Together these results suggest that sEVs mediate early embryo-endometrium-corpus luteum communication, contributing to maintaining luteal viability and functionality. However, further experiments are needed to evaluate specific biological effects of these miRNAs carried by sEVs in the endometrium and in the corpus luteum. Moreover, the embryo origin (in vivo and in vitro) modify the interactions among embryo-endometrium-corpus luteum, suggesting strongly that these embryos have distinct needed to develop.

Netrophils Response In Dairy Cows During Early Pregnancy

Studies highlighted the role of the immune system during the establishment of pregnancy. Maternal immune response has to find a balance to avoid any damage to the conceptus and maintain its function in combating microbes. When pregnancy cannot achieve this balance, losses might occur. Intercommunication between mother and conceptus is fundamental during early pregnancy to dictate the outcome of pregnancy. During pregnancy, the embryo signals to the maternal system its presence mainly locally via interferon tau (IFNT), and any stress factor can disrupt the signaling. The maternal immune response can alter between anti- and pro-inflammatory type, but usually, in the first few days (e.g., day 7), anti-inflammatory responses are established. IFNT concentration begins to be detected in circulation around day 12 of pregnancy in low concentrations, suggesting that maternal immune modulation does not occur by the direct effect of IFNT during this time. However, its unclear how amplification of IFNT signal in circulation occurs. Based on that, the present study focuses on determining IFNT effects in polymorphonuclear (PMN) cells and if immune cells can amplify embryonic signals to other immune cells in vitro. And if the signaling in PMN can be disrupted by stressor factor, i.e., heat stress in vivo. The first study demonstrated that IFNT could generate anti-inflammatory responses and upregulation of ISGs expressions in PMNs, subsequently amplifying and transferring IFNT signals to a new cell population via a cell-to-cell communication mechanism possibly mediated by IFNA. The second study demonstrated that heat stress modulates PMN responses with greater anti- and pro-inflammatory cytokines expressions in different early pregnancy days. These findings might provide a better understanding of the modulation of innate immune responses during maternal recognition of pregnancy.

Studies highlighted the role of the immune system during the establishment of pregnancy. Maternal immune response has to find a balance to avoid any damage to the conceptus and maintain its function in combating microbes. When pregnancy cannot achieve this balance, losses might occur. Intercommunication between mother and conceptus is fundamental during early pregnancy to dictate the outcome of pregnancy. During pregnancy, the embryo signals to the maternal system its presence mainly locally via interferon tau (IFNT), and any stress factor can disrupt the signaling. The maternal immune response can alter between anti- and pro-inflammatory type, but usually, in the first few days (e.g., day 7), anti-inflammatory responses are established. IFNT concentration begins to be detected in circulation around day 12 of pregnancy in low concentrations, suggesting that maternal immune modulation does not occur by the direct effect of IFNT during this time. However, its unclear how amplification of IFNT signal in circulation occurs. Based on that, the present study focuses on determining IFNT effects in polymorphonuclear (PMN) cells and if immune cells can amplify embryonic signals to other immune cells in vitro. And if the signaling in PMN can be disrupted by stressor factor, i.e., heat stress in vivo. The first study demonstrated that IFNT could generate anti-inflammatory responses and upregulation of ISGs expressions in PMNs, subsequently amplifying and transferring IFNT signals to a new cell population via a cell-to-cell communication mechanism possibly mediated by IFNA. The second study demonstrated that heat stress modulates PMN responses with greater anti- and pro-inflammatory cytokines expressions in different early pregnancy days. These findings might provide a better understanding of the modulation of innate immune responses during maternal recognition of pregnancy.

Pregnancy effects in the bovine oviduct during early embryonic development in vivo: modulation of the microRNA profile in small extracellular vesicles of the oviductal fluid and oviductal epithelial cells

MAZZARELLA, R., Efeitos da prenhez no oviduto bovino durante o desenvolvimento embrionário inicial in vivo: modulação do perfil de micro NA em vesículas extracelulares pequena do fluido oviductal e em células epiteliais do oviduto. 2021. 117 f. Dissertação (Mestrado) Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2021. O oviduto fornece o microambiente ideal para desenvolvimento embrionário inicial. Este ambiente é formado por células epiteliais do oviduto (CEOs) e pelo fluido ovidutal (FO) produzido por essas células. O FO possui vesículas extracelulares (VEs) pequenas, que por meio de seu conteúdo de biomoléculas, incluindo microRNAs (miRNAs), podem promover o ambiente adequado para a fertilização e o desenvolvimento inicial do embrião. Entretanto, a modulação do perfil de miRNAs em VEs pequenas do FO e em CEOs em vacas prenhes ainda é desconhecida. Assim, o objetivo deste projeto foi caracterizar o perfil de 383 miRNAs em VEs pequenas provenientes do FO e de CEOs de vacas prenhes em comparação a não prenhes. Os resultados indicam que a passagem de gametas e a presença do embrião modulam os conteúdos de miRNAs tanto de VEs quanto de CEOs. Em VEs, 8 miRNAs (btamiR-126-5p, bta-miR-129, bta-miR-140, bta-miR-188, bta-miR-219, bta-miR-345-3p, bta- miR-4523 e bta-miR-760-3p) foram regulados positivamente em vacas prenhas e um (bta-miR-331-5p) foi regulado positivamente em vacas não prenhas. Enquanto em CEOs, 6 miRNAs (bta-miR-133b, bta-miR-205, bta-miR-584, bta-miR-551a, bta-miR1193 e bta-miR-1225-3p) estão elevados apenas no grupo não prenhe. Oenriquecimento funcional destes miRNAs destaca vias envolvidas em processos cruciais tanto para o trato reprodutivo quanto para o desenvolvimento embrionário, como inflamação, proliferação celular e resposta imune. Além disso, demonstramos a modulação dos níveis transcricionais de genes selecionados em CEOs de vacas prenhes. Estes resultados sugerem que a comunicação materna-embrionária potencialmente começa durante o desenvolvimento embrionário inicial no oviduto e através da modulação de miRNAs em CEOs e VEs, aumentando a receptividade oviductal, permitindo o desenvolvimento embrionário adequado e assim levando a uma prenhez de sucesso.

MAZZARELLA, R. Pregnancy effects in the bovine oviduct during early embryonic development in vivo: Modulation of the microRNA profile in small extracellular vesicles of the oviductal fluid and oviductal epithelial cells. 2021. 117 f. M.Sc. Dissertation Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2021. The oviduct provides the ideal microenvironment for early embryonic development. This environment is formed by the oviductal epithelial cells (OECs) and the oviductal fluid produced by these cells. Among the contents of OF are the small extracellular vesicles (sEVs), which through their content, including microRNAs (miRNAs), can ensure proper cell communication between the mother and the embryo. However, the miRNA profile modulation in sEVs of the oviductal fluid and OECs in pregnant cows is still unknown. Thus, this project aimed to characterize 383 miRNAs in sEVs from the oviductal flushing and OECs in pregnant (pregnant group) compared to non-pregnant cows (non-pregnant group). Our results indicate that the passage of gametes and the embryo presence modulate miRNAs contents of sEVs and OECs. In OF-sEVs, 8 miRNAs (bta-miR-126-5p, bta-miR-129, bta-miR-140, bta-miR-188, bta-miR 219, btamiR-345-3p, bta-miR-4523 and bta-miR-760-3p) were up-regulated in pregnant and one miRNA (bta-miR-331-5p) was up-regulated in non-pregnant cows. In OECs, 6 miRNAs (bta-miR-133b, bta-miR-205, bta-miR-584, bta-miR-551a, bta-miR-1193 and bta-miR-1225-3p) were up-regulated in non-pregnant and none was up-regulated in pregnant cows. The functional enrichment of miRNAs highlights pathways involved in physiological processes such as inflammation, cell proliferation, and immune response crucial for both the reproductive tract and embryo development. Additionally, we demonstrated the modulation of the transcriptional levels of selected genes in OECs in pregnant cows. These results suggest that embryonic-maternal crosstalk potentially begins during early embryonic development in the oviduct through the modulation of miRNAs in OECs and sEVs in pregnant cows, increasing oviductal receptivity, allowing proper embryo development leading to a successful pregnancy.

Snooping on a private conversation between the oviduct and gametes/embryos

After a long journey travelling up the maternal tract the spermatozoa will meet the oocyte. As a result, an early embryo will promptly commence its development while travelling down the oviduct. These short but vital journeys of gametes and embryos are accompanied by important changes in the maternal tract. In particular, from the oviduct, which provides an optimal environment for gamete maturation and transport, fertilization and early embryo development. In fact, to achieve a successful pregnancy the oviduct should keep a fruitful dialogue with the gametes followed by an appropriate communication with the embryo(s). In the present review, the transcriptomic and proteomic changes induced by gametes and embryos in the oviduct as a result of this early dialogue will be reported. A special mention of the differential conversation between the oviduct and X and Y-chromosome-bearing spermatozoa, which might be at the basis of gender selection, will be provided. Subsequently, the ability of the embryo to modulate its own oviductal environment thus avoiding its maternal rejection will be discussed. Ultimately, a third player Will be introduced in this dialogue, exosomes/microvesicles, which have been proposed as early mediators of these maternal-gamete/embryo interactions. Snooping on the private conversation between the oviduct and gametes/embryo may provide some molecular clues about the mechanisms that mediate these interactions. Moreover, knowing the genes and proteins that pilot the success of the early reproductive events will offer great opportunities for the improvement of assisted reproductive technologies and animal breeding efficiency.(AU)

Snooping on a private conversation between the oviduct and gametes/embryos

After a long journey travelling up the maternal tract the spermatozoa will meet the oocyte. As a result, an early embryo will promptly commence its development while travelling down the oviduct. These short but vital journeys of gametes and embryos are accompanied by important changes in the maternal tract. In particular, from the oviduct, which provides an optimal environment for gamete maturation and transport, fertilization and early embryo development. In fact, to achieve a successful pregnancy the oviduct should keep a fruitful dialogue with the gametes followed by an appropriate communication with the embryo(s). In the present review, the transcriptomic and proteomic changes induced by gametes and embryos in the oviduct as a result of this early dialogue will be reported. A special mention of the differential conversation between the oviduct and X and Y-chromosome-bearing spermatozoa, which might be at the basis of gender selection, will be provided. Subsequently, the ability of the embryo to modulate its own oviductal environment thus avoiding its maternal rejection will be discussed. Ultimately, a third player Will be introduced in this dialogue, exosomes/microvesicles, which have been proposed as early mediators of these maternal-gamete/embryo interactions. Snooping on the private conversation between the oviduct and gametes/embryo may provide some molecular clues about the mechanisms that mediate these interactions. Moreover, knowing the genes and proteins that pilot the success of the early reproductive events will offer great opportunities for the improvement of assisted reproductive technologies and animal breeding efficiency.

Deciphering the embryo-maternal interactome: Embryo-dependent programming of endometrial function during early pregnancy in cattle

Resumo: O sucesso gestacional depende do programa embrionário intrínseco, operando em conjunto com fatores extrínsecos que emanam do trato reprodutivo materno, bem como de uma coordenada interação entre as unidades materna e embrionária. Atualmente, o conhecimento sobre a programação do funcionamento do endométrio dependente do embrião pré-elongado é limitado. A hipótese central desta tese é que embriões bovinos são capazes de modular a função endometrial no dia 7 após o estro. No primeiro estudo, regiões espacialmente definidas do transcriptoma endometrial foram interrogadas quanto a respostas a um embrião no dia 7 in vivo. Amostras de endométrio foram coletadas da junção útero-tubárica, região anterior, medial e posterior do corno uterino ipsilateral ao corpo lúteo 7 dias após o estro de vacas Nelore artificialmente inseminadas e confirmadas gestantes, ou de vacas em que a inseminação foi mimetizada. A abundância de 12 dos 87 transcritos analisados foi modulada no endométrio de animais gestantes, incluindo genes estimulados por interferon (ISGs) e genes associados à biossíntese de eicosanoides. As alterações foram predominantemente nas porções mais craniais do corno uterino, onde o embrião estava localizado. Além disso, a abundância de 71 transcritos variou de acordo com a região do trato reprodutivo, independentemente da presença do embrião. Quantificação baseada em espectrometria de massa de 205 metabólitos no fluido luminal uterino (ULF) recuperado da porção mais cranial do corno uterino ipsilateral mostrou que a exposição ao embrião altera a composição do ULF no dia 7 in vivo. Modulações induzidas pelo embrião incluem aumento nas concentrações de metabólitos derivados da via das lipoxigenases e diminuição nas concentrações de aminoácidos, aminas biogênicas, acilcarnitinas e fosfolipídios. Alterações na composição do ULF podem ser devido à secreção ou depleção de moléculas específicas, executadas pelo embrião ou pelo endométrio, mas iniciadas por sinais provenientes do embrião. No segundo estudo, um modelo in vitro foi usado para estudar as alterações induzidas por embriões no transcriptoma de células epiteliais endometriais bovinas (BEEC) e investigar modos de comunicação molecular entre tecidos. Mórulas produzidas in vitro foram co-cultivadas em justaposição ou sem contato direto com BEECs. Grupos de BEECs ou embriões sozinhos foram cultivados como controles. Independentemente da justaposição à monocamada, o co-cultivo com BEECs melhorou as taxas de blastocistos no dia 7,5. A proximidade física entre embriões e a monocamada de células, no entanto, alterou a natureza e a intensidade das alterações induzidas pelos embriões no transcriptoma das células endometriais. Embriões justapostos modularam a transcrição de 1.797 versus 230 genes em BEECs não contactando diretamente os embriões, quando comparadas às células cultivadas na ausência de embriões. Vias moduladas pela presença de embriões incluíram resposta imune mediada por interferon, regulação do ciclo celular e apoptose, sinalização via prolactina e biossíntese de prostanoides. Coletivamente, a partir dos resultados obtidos nesta tese, concluímos que embriões bovinos pré-elongamento são capazes de modular a função endometrial. A presente tese fornece vias candidatas que parecem ser importantes para o condicionamento do ambiente uterino para o desenvolvimento do concepto. A sinalização embrionária precoce pode ser necessária para garantir o desenvolvimento ideal e o estabelecimento da gestação em bovinos.

Abstract: A successful pregnancy is dependent on the intrinsic embryonic program, operating in conjunction with extrinsic signals emanating from the maternal reproductive tract, as well as on a coordinated interaction between the embryonic and the maternal units. Current knowledge about the pre-elongation embryo-dependent programming of endometrial function in cattle is limited. Central hypothesis is that bovine embryos are able to modulate the endometrial function as early as day 7 after estrus. In the first study, spatially defined regions of the endometrium transcriptome were interrogated for responses to a day 7 embryo in vivo. Endometrial samples were collected from the uterotubal junction, anterior, medial and posterior regions of the uterine horn ipsilateral to the corpus luteum 7 days after estrus from sham-inseminated or artificially inseminated, confirmed pregnant Nellore cows. Abundance of 12 out of 87 transcripts analyzed was modulated in the pregnant endometrium, including classic interferon-induced genes and transcripts associated to eicosanoid biosynthesis. Changes were predominantly in the most cranial portion of the uterine horn, where the embryos were located. In addition, abundance of 71 transcripts varied according to region of the reproductive tract, irrespective to the pregnancy status. Targeted mass spectrometry-based quantification of 205 metabolites in the uterine luminal fluid (ULF) recovered from the most cranial portion of the ipsilateral uterine horn showed that exposure to a day-7 embryo changes ULF composition in vivo. Embryo-induced modulation included an increase in concentrations of lipoxygenase-derived metabolites and a decrease in concentrations of amino acids, biogenic amines, acylcarnitines and phospholipids. The changed composition of the ULF could be due to secretion or depletion of specific molecules, executed by either the embryo or the endometrium, but initiated by signals coming from the embryo. In the second study, an in vitro model was used to probe embryo-induced changes on bovine endometrial epithelial cells (BEECs) transcriptome and investigate modes of inter-tissues molecular communication. In vitro-produced morulae were co-cultured in juxtaposition or without a direct contact with a BEEC monolayer. Extra groups of BEECs or embryos alone were cultured as controls. Irrespective of juxtaposition to the cell monolayer, co-culture with BEECs improved blastocyst rates on day 7.5. Physical proximity between embryos and the BEEC monolayer, nevertheless, did alter nature and intensity of embryo-induced changes on BEEC transcriptome. Embryos juxtapositioned modulated transcription of 1,797 versus 230 genes in BEECs not contacting embryos directly, in relation to cells cultured in the absence of embryos. Pathways modulated by presence of embryos included interferon-mediated immune responses, cell cycle regulation and apoptosis, prolactin signaling, and prostanoid biosynthesis. Overall, from the results obtained in the course of this thesis, we conclude that peri-hatching bovine embryos modulate the endometrial function. Herein, we provide candidate systems that might be important for conditioning the uterine environment for conceptus development. Early embryonic signaling might be necessary to guarantee optimal development and successful establishment of pregnancy in cattle.

Molecular and endocrine determinants of oocyte competence

Mammalian female gametes are stored for many years in the ovaries in an inactive state until stimulated to grow. Activation of the resting follicle is initiated by the oocyte and requires a communication mechanism between the oocyte and the surrounding granulosa cells. Key molecular and morphological events that occur during oocyte and follicle growth and maturation include the establishment of a bi-directional communication system, granulosa cell proliferation and antrum formation, nucleolus activation and initiation of oocyte transcription, establishment of the maternal imprints and completion of the m eiotic maturation. Successful accomplishment of these events furnishes the oocyte with the competency to support fertilization and to sustain early embryo development and is reflected in the molecular signatures of the oocyte and the follicular granulosa cells. The current review will consider these events and highlight the molecular and endocrine factors associated with them.

Molecular and endocrine determinants of oocyte competence

Mammalian female gametes are stored for many years in the ovaries in an inactive state until stimulated to grow. Activation of the resting follicle is initiated by the oocyte and requires a communication mechanism between the oocyte and the surrounding granulosa cells. Key molecular and morphological events that occur during oocyte and follicle growth and maturation include the establishment of a bi-directional communication system, granulosa cell proliferation and antrum formation, nucleolus activation and initiation of oocyte transcription, establishment of the maternal imprints and completion of the m eiotic maturation. Successful accomplishment of these events furnishes the oocyte with the competency to support fertilization and to sustain early embryo development and is reflected in the molecular signatures of the oocyte and the follicular granulosa cells. The current review will consider these events and highlight the molecular and endocrine factors associated with them.(AU)

Efeitos do estresse oxidativo durante a produção in vitro de embriões bovinos sobre o miR-199a e genes alvo ERBB2 e ERBB3

A produção in vitro de embriões expõe o concepto a condições diferentes do ambiente intra-tubárico-uterino. A alta tensão de oxigênio durante o cultivo in vitro induz estresse oxidativo mediante aumento dos níveis das espécies reativas de oxigênio. A condição de estresse oxidativo altera a expressão de RNAm e miRNAs, podendo comprometer vias de interação materno-embrionária. Recentemente, os exossomos têm sido descritos como um mecanismo complementar de transporte de RNAm e miRNAs, que beneficiam a comunicação bidirecional materno-embrionária. Portanto, além do estudo dos próprios embriões, a análise dos exossomos isolados do meio de cultivo da PIVE também é relevante. Comumente são utilizados dois modelos de cultivo na PIVE, a alta tensão (20%) e a baixa tensão (5%) de oxigênio. A hipótese deste estudo é que a alta tensão de oxigênio no cultivo embrionário gera uma condição de estresse oxidativo que causa alterações de expressão de RNAm e miRNAs presentes nos embriões e nos exossomos. Além disso, o estresse oxidativo exerceria efeito sobre o padrão de secreção destes exossomos. Para testar essa hipótese este estudo produziu embriões bovinos in vitro cultivados em diferentes tensões de oxigênio. Os embriões foram coletados no dia 7 e os meios de cultivo, para isolamento os exossomos, foram coletados nos dias 3 e 7 do cultivo. Os blastocistos cultivados em alta tensão de oxigênio apresentaram um aumentou dos níveis de EROs através de análise de fluorescência. Este resultado validou o modelo de estresse oxidativo para embriões. Os resultados iniciais indicaram que apesar do miR-199a-5p, descrito como possível regulador dos genes alvos ERBB2 e ERBB3, ter apresentado maior expressão nos embriões cultivados em alta tensão, os transcritos ERBB2 e ERBB3 e a proteína ERBB2 não apresentaram diferença significativa entre os grupos. Uma vez que não se estabeleceu uma relação de regulação entre o miR-199a-5p e o gene alvo ERBB2 para os embriões bovinos, este estudo se voltou para a análise de outros 96 RNAm e 378 miRNAs, destes 40 RNAm e 8 miRNAs apresentaram alterações significativas entre os embriões cultivados em alta e baixa tensão de oxigênio. Entre as principais funções alteradas estão associadas à resposta ao estresse oxidativo, proliferação e diferenciação celular, remodelação epigenética, apoptose, metabolismo e reconhecimento materno-fetal. Por fim, com o objetivo de compreender um panorama maior dos efeitos do estresse oxidativo, este estudo se propôs a analisar o padrão de expressão e os miRNAs do conteúdo dos exossomos do meio de cultivo. O estresse oxidativo alterou tanto a concentração dos exossomos quanto a expressão dos mRNAs, em ambos os dias do desenvolvimento embrionário (D3 e D7). Dentre os miRNAs, destaca-se o miR-210 que foi considerado por este trabalho como biomarcador não invasivo da condição de normoxia no cultivo in vitro de embriões bovinos. Em conclusão, esse estudo não elucidou como o estresse oxidativo altera a interação materno-embrionária em embriões produzidos in vitro em diferentes condições de tensão de oxigênio, mas gerou conhecimentos adicionais sobre do desenvolvimento embrionário bovino e os efeitos da alta tensão de oxigênio.

The in vitro embryo production exposes the concept to conditions different from the intra-tubal-uterine environment. The high oxygen tension during in vitro production induces the oxidative stress by increasing the concentration of reactive oxygen species. The oxidative stress condition changes the mRNA and miRNAs expression, it can compromise pathways of maternal-embryonic interaction. Recently, the exosomes have been described as a complementary mechanism of mRNA and miRNAs transport, which improve the bidirectional maternal-embryonic communication. Therefore, the studies of the embryos and exosomes isolated from the IVP culture medium are relevant. Two cultivation models are usually used in IVP, the high tension (20%) and the low tension (5%) of oxygen. The hypothesis of this study is that the high oxygen tension in the embryonic culture generates an oxidative stress condition that causes changes in the mRNA and miRNAs expression. In addition, this oxidative stress is able to modulate the secretion pattern of the exosomes isolated from IVP embryos. To test this hypothesis, this study produced in vitro bovine embryos developed at different oxygen tensions. The embryos were sampled on day 7 and the culture media, for exosomes isolation, were collected on days 3 and 7 of the embryo development. Blastocysts cultured in high oxygen tension showed increased levels of ROS through fluorescence analysis. This result validated the oxidative stress model for embryos. In order to understand the effect of oxidative stress on the pathways of maternal-embryonic interaction, this study aimed to analyze the ERBB signaling pathway. Despite the fact that miR-199a-5p, described as a possible regulator of the ERBB2 and ERBB3 target genes, showed higher expression in embryos cultured under high tension, the ERBB2 and ERBB3 transcripts and the ERBB2 protein showed no significant difference between high and low oxygen tension groups. Since a regulatory relationship between miR-199a-5p and the ERBB2 target gene was not established for bovine embryos, this study turned to the analysis of other 96 mRNAs and 378 miRNAs, out of 40 mRNAs and 8 miRNAs showed significant changes among the groups. The main altered functions are the response to oxidative stress, cell proliferation and differentiation, epigenetic remodeling, apoptosis, metabolism and maternal-fetal recognition. Finally, in order to understand the bigger picture of oxidative stress effect we analyze the secretion pattern and the miRNA content of the exosomes from culture medium of IVP embryos. Oxidative stress change both, the exosome concentration and the miRNA expression (at D3 and D7). Among the miRNAs, we highlight the miR-210 that was considered by this work as a non-invasive biomarker of the normoxia condition in the in vitro culture of bovine embryos. In conclusion, this study did not elucidate how oxidative stress changes the maternal-embryonic interaction in IVP embryos, but it generated additional knowledge about bovine embryonic development and the high oxygen tension effects.

INTERFERON TIPO I PRODUZIDO POR EMBRIÕES IN VITRO NA SINALIZAÇÃO ENDÓCRINA ANTERIOR AO PERÍODO CLÁSSICO DE RECONHECIMENTO MATERNO DA GESTAÇÃO EM BOVINOS

O período de reconhecimento materno da gestação em bovinos caracteriza-se por ser o processo pelo qual o concepto, através da produção de interferon-tau (IFNT) sinaliza sua presença no útero materno. O IFNT tem como principal função manter o corpo lúteo produzindo progesterona necessária para o estabelecimento e manutenção da gestação. O concepto secreta vesículas extracelulares que carreiam proteínas responsáveis pela sinalização entre o embrião e organismo materno no período de pré-implantação. Ainda, vesículas extracelulares secretadas pelo endométrio de bovinos entram no trofectoderma do concepto e estimulam a produção de IFNT. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar se o IFNT secretado por embriões produzidos in vitro (FIV) é capaz de mimetizar a sinalização endócrina em cultivo de células luteais e identificar se essa comunicação mediada pelo IFNT ocorre na forma de proteína livre ou via exossomo. No experimento 1 foi avaliada a capacidade do cultivo primário de células luteais de responder ao interferon tipo I. A expressão de ISG15 aumentou de uma maneira dose-dependente atingindo o platô quando as células luteais foram tratadas com 10ng/ml de interferon-alfa. No experimento 2, células luteais tratadas com meio condicionado por embriões ativados partenogeneticamente (paSOF) cultivados até os 12 dias de desenvolvimento, apresentaram um aumento na expressão de RNAm para ISG15 quando comparados com os grupos que receberam paSOFD7 e paSOFD9. No ensaio antiviral foi detectada uma maior atividade de interferon tipo I no paSOFD9 e 12 do que no grupo paSOFD7. No experimento 3, embriões produzidos por FIV foram cultivados até os dias 7, 9 e 12 de desenvolvimento e posteriormente foi coletado o meio condicionado. A expressão de RNAm para IFNT2 foi avaliada nestes embriões FIV com 7, 9 e 12 dias. Nos embriões do dia 9, a expressão de RNAm para IFNT2 foi maior que nos embriões do dia 7, e nenhuma diferença foi observada nos embriões do dia 12. O meio condicionado por embriões FIV com 7, 9 e 12 dias foi utilizado no tratamento do cultivo de células luteais e posteriormente foi avaliada a expressão de RNAm para ISG15. As células luteais tratadas com ivfSOF (SOF condicionado por embriões FIV até os dias 7, 9 e 12, antes da ultracentrifugação) e SN (SOF condicionado por embriões FIV até os dias 7, 9 e 12, após a ultracentrifugação, sem vesículas extracelulares) apresentaram um aumento na expressão de ISG15 quando comparadas com EVs (pellet enriquecido com exossomos obtidos após ultracentrifugação do SOF condicionado por embriões FIV). Vesículas extracelulares foram marcadas com PKH67 e observou-se sua presença dentro das células luteais. Desta forma, percebe-se que o cultivo de células luteais respondeu ao tratamento com interferon tipo I presente no meio condicionado por embriões PA e FIV já no dia 7 de desenvolvimento e esta comunicação ocorre usando interferons na forma de proteína livre.

Maternal recognition of pregnancy period in bovine is characterized when the concept secrets IFNT and signals its presence inside maternal uterus. IFNT main function is to maintain corpus luteum producing progesterone to establishment and maintain pregnancy. Conceptus derived-extracellular vesicles transport proteins responsible for signaling to the maternal organism in the pre-attachment period. Also, extracellular vesicles secreted by bovine endometrium stimulate conceptus trophectoderm IFNT production. Therefore, the aim this study was to evaluate whether in vitro fertilized (IVF) embryo-derived IFNT is capable to stimulate ISG15 expression in luteal cells culture, and also to identify if IFNT signal occurs in free protein form or via exosome. In experiment 1, it was evaluated if primary luteal cells culture responds to type I interferon treatment. ISG15 mRNA expression increased in luteal cells culture in a dose dependent manner reaching a plateau at 10ng/ml of interferon-alpha. In experiment 2, luteal cells culture treated with Day 12 conditioned medium by parthenogenetic activated embryos (paSOF), increased ISG15 mRNA expression when compared to paSOF from Days 7 and 9. Antiviral assay detected a greater bioactivity of type I interferon on Days 9 and 12 paSOF when compared to paSOF from Day 7. In experiment 3, IVF produced embryos were cultured until Days 7, 9 and 12 of development and followed by conditioned medium collection. IFNT2 mRNA expression was assessed on embryos from Days 7, 9 and 12 of development. On Day 9, IFNT2 mRNA expression was greater than Day 7, and no difference was observed on Day 12. ISG15 expression was evaluated on luteal cells culture treated with conditioned medium from IVF produced embryos on Days 7, 9 and 12 of development. Luteal cells culture treated with ivfSOF (SOF from embryos before of ultracentrifugation) and SN (SOF from embryos after of ultracentrifugation, depleted of extracellular vesicles) increased ISG15 mRNA expression when compared to EVs (pellet enriched with exosome obtained after ultracentrifugation of SOF from IVF embryos). Extracellular vesicles were labeled with PHK67 and their presence was observed inside the luteal cells. It is concluded, luteal cells culture respond to Type I interferon treatment present in the conditioned medium from IVF embryos as early as Day 7 of development, and this communication using interferons occurs in the free protein form.

Vesículas secretadas por células, proteínas e miRNAs associados à competência oocitária em bovinos: um modelo retrospectivo no microambiente folicular

ANDRADE, G. M. Vesículas secretadas por células, proteínas e miRNAs associados à competência oocitária em bovinos: um modelo retrospectivo no microambiente folicular. 2018. 175f. Tese (Doutorado) Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2017. A produção in vitro de embriões é uma biotecnologia bastante difundida mundialmente. O Brasil, em 2015, foi responsável por aproximadamente 67% dos embriões bovinos produzidos in vitro no mundo (PERRY, 2014). Embora essa tecnologia seja bastante utilizada, é de grande interesse para o mercado desenvolver estratégias que levem ao maior aproveitamento dos oócitos obtidos e compreender os mecanismos, dentro do ambiente folicular, que determinam a competência oocitária. O microambiente folicular é fundamental para o crescimento e a aquisição da competência oocitária, tornando o oócito apto a desenvolver-se e manter o embrião até a transição materno embrionária. Para tanto, os componentes foliculares células da granulosa, células do cumulus, oócito e líquido folicular precisam trabalhar em unidade, visto que possuem uma relação de interdependência. Dentro dos mecanismos de comunicação existentes no ambiente folicular estão as vesículas secretadas por células, chamadas vesículas extracelulares, que foram descritas no líquido folicular, contendo material bioativo como proteínas, lipídios e RNAs, incluindo os microRNAs. Contudo, os componentes do ambiente folicular podem refletir na qualidade do oócito que será produzido e a hipótese geral deste trabalho é de que os miRNAs presentes no ambiente folicular regulam vias de sinalização importantes para o desenvolvimento oocitário e que os miRNAs e ou RNAs mensageiros presentes nas células foliculares podem ser explorados como importantes ferramentas para o diagnóstico da qualidade oocitária. O primeiro estudo determinou perfis transcricionais de miRNAs em células da granulosa, em complexos cumulus-oócito e em vesículas extracelulares derivadas destas células e também do fluido folicular. Além de conhecer a origem e o papel dos miRNAs no ambiente folicular, estes perfis de expressão indicaram a regulação no ambiente folicular da via de sinalização da PI3K-Akt. No segundo estudo, componentes desta via de sinalização foram então determinados em células foliculares associadas a oócitos de alta ou baixa competência ao desenvolvimento. Os resultados demonstram que a ativação da via PI3K-Akt em células foliculares correlaciona-se à maior competência oocitária; de modo oposto, a menor atividade desta via nas células foliculares está relacionada à reduzida competência oocitária. Nos estudos três e quatro, um conjunto de experimentos foram realizados para determinar o perfil de microRNAs e RNAs mensageiros em células do cumulus associadas a oócitos de alta ou baixa competência ao desenvolvimento. Buscou-se esclarecer alguns dos mecanismos responsáveis pela melhor qualidade oocitária e levar a identificação de biomarcadores de qualidade oocitária permitindo o avanço e o desenvolvimento de novas ferramentas para intensificar a produção in vitro de embriões bovinos. Por fim, estes resultados demonstram respostas integradas entre oócitos e células foliculares durante o desenvolvimento folicular e o processo de aquisição de competência oocitária e identificaram marcadores de qualidade oocitária.

ANDRADE, G. M. Cell secreted vesicles, proteins and miRNAs associated to oocyte competence in bovine: a retrospective model in the folicular microenvironment. 2018. 175p. Ph.D. Thesis Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2017. In vitro embryo production of is a widespread biotechnology worldwide. In 2015 Brazil was responsible for approximately 67% of bovine embryos produced in vitro in the world (PERRY, 2014). Although widely used, to develop strategies that lead to better use of oocytes and understand the mechanisms (in follicular microenvironment) that determine oocyte competence is of great interest to national market. The follicular microenvironment is fundamental for oocyte growth and acquisition of competence, making the oocyte able to develop and maintain the embryo until the embryonic maternal transition. For this end, the follicular components - granulosa cells, cumulus cells, oocytes and follicular fluid - need to work in unity, since they have arelation of interdependence. Within the mechanisms of communication existing within the follicular environment are vesicles secreted by cells, called extracellular vesicles, which were described in follicular fluid, containing bioactive material such as proteins, lipids and RNAs, including microRNAs. The components of follicular environment may reflect the quality of the oocyte that will be produced and the general hypothesis of this work is that the miRNAs present in the follicular environment regulate signaling pathways important for oocyte development and that the miRNAs and/or messenger RNAs present in the follicular cells can be explored as important tools for the diagnosis of oocyte quality. The first study determined profiles of miRNAs in granulosa cells, cumulus-oocyte complexes and extracellular vesicles derived from these cells and also in follicular fluid. In addition, by knowing the origin and role of miRNAs in the follicular environment, the expression profiles indicated the PI3K-Akt signaling pathway regulation in the follicular environment. In the second study, components of this signaling pathway were then determined in follicular cells associated with oocytes of high or low developmental competence. The results demonstrated that the activation of the PI3K-Akt pathway in follicular cells correlates with increased oocyte competence; conversely, the lower activity of this pathway in follicular cells is related to reduced oocyte competence. In studies three and four, experiments were performed to determine the profile of microRNAs and messenger RNAs in cumulus cells associated with oocytes of high or low developmental competence. Aiming to clarify some of the mechanisms responsible for the best oocyte quality that lead to the identification of oocyte quality biomarkers, allows the advancement and development of new tools to intensify the in vitro production of bovine embryos. Finally, results obtained demonstrate integrated responses between oocytes and follicular cells during follicular development and give new insights to the study of oocyte competence acquisition process and identified oocyte quality markers.

MODULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA CARUNCULAR PELO EMBRIÃO BOVINO DURANTE A PLACENTAÇÃO: INFLUÊNCIA SOBRE FATORES ANGIOGÊNICOS E VASOATIVOS

Em bovinos, perdas reprodutivas ocorrem principalmente no período embrionário (0 42 dias), sendo desencadeadas principalmente por falhas na sincronização da comunicação materno-embrionária. O concepto (embrião e membranas extraembrionárias) desempenha um papel chave no controle do ambiente intrauterino, desencadeando a liberação de fatores parácrinos para sinalização gestacional e modulando a expressão de genes no endométrio materno que atuam na preparação da implantação e posterior início do desenvolvimento placentário. Apesar da produção in vitro de embriões se mostrar como uma ferramenta útil no aumento da produtividade de rebanhos, este método ainda apresenta lacunas no sucesso da eficiência reprodutiva. Este estudo objetivou analisar a expressão de genes envolvidos com a função vascular placentária em cornos uterinos gestantes e não gestantes de vacas primíparas submetidas à inseminação artificial (IA) e fertilização in vitro (FIV), buscando identificar o papel regulatório do embrião na expressão gênica endometrial e a influência da manipulação embrionária in vitro neste mecanismo. Para realização do estudo, amostras carunculares do corno gestante foram coletadas após a separação dos cotilédones fetais, ocorrendo nos dias 30 (n = 3), 35 (n = 8) e 40 (n = 3) de IA e 35 (n = 3) e 40 dias (n = 3) de FIV. Concomitantemente, carúnculas do corno uterino contralateral também foram coletadas. Todos os tecidos foram congelados em nitrogênio líquido e armazenados a 80° C, até o momento de extração do RNA. A partir de um microarranjo previamente realizado, quatro genes (eNOS, GUCY1B3, EDNRB, ANGPT2) envolvidos com a função vascular placentária foram selecionados para o estudo. Todas as amostras foram processadas pela técnica de PCR Quantitativo em Tempo Real (qPCR), onde a análise dos resultados mostrou um aumento significativo (p<0,05) em cornos gestantes de IA entre os 30 e 35 dias para os genes EDNRB e ANGPT2, e 30 dias para GUCY1B3. Nenhuma alteração nos níveis de expressão de eNOS para IA foi observado. Uma resposta de transcrição tardia ocorreu aos 40 dias em cornos gestantes de FIV para os genes eNOS, EDNRB e ANGPT2, e nenhuma alteração significativa (p<0,05) foi observada para GUCY1B3. Tendo em vista os aspectos observados, conclui-se que a expressão diferencial de genes em cornos gestantes possui relação direta com a presença do embrião, estando os mesmos genes sujeitos a modificações no padrão transcricional em virtude das adversidades impostas pela manipulação e cultura in vitro de embriões.

In cattle, reproductive loss occurs mainly embryonic period (0-42 days), and one of the major cause of this issue are failures in synchronization of maternal and embryonic communication. The conceptus (embryo and extraembryonic membranes) plays a key role in controlling intrauterine environment, leading to the release of paracrine factors for gestational signaling and modulating the expression of genes in maternal endometrium, leading up to implantation and subsequent early placental development. Despite of in vitro production of embryos proves to be a useful tool in increasing productivity of cattle, this method still has gaps in successful of reproductive efficiency. This study aimed to analyze the expression of genes involved with placental vascular function in gravid and non-gravid uterine horns of primiparous cows submitted to artificial insemination (AI) and in vitro fertilization (IVF), in order to identify the regulatory role of embryo on endometrial gene expression and the influence of in vitro embryonic manipulation on this mechanism. In this study, caruncular samples of the gravid horn were collected after the separation of fetal cotyledons, occurring on days 30 (n = 3), 35 (n = 8) and 40 (n = 3) AI and 35 (n = 3) and 40 (n = 3) days IVF. Caruncles of contralateral uterine horns were collected concomitantly. All tissues were frozen in liquid nitrogen and stored at - 80°C until RNA extraction. Four genes (eNOS, GUCY1B3, EDNRB, ANGPT2) involved with placental vascular function were chosen for this study. All samples were processed by Quantitative Real Time PCR (qPCR), at where the analysis of results showed a significant increase (p<0.05) in AI gravid horns between 30 to 35 days for both EDNRB and ANGPT2 genes, while GUCY1B3 was upregulated on gravid horns only at 30 days AI. Expression levels of eNOS did not changed in AI uterine tissues. Late transcription response occurred at 40 days IVF on gravid horns for eNOS, EDNRB and ANGPT2, and no significant alterations (p <0.05) was observed for GUCY1B3. Considering the observed aspects, we conclude that the differential expression of genes on gravid horns has a direct relation with the presence of embryo, being these genes themselves liable to modifications in transcriptional pattern due to adversities imposed by manipulation and culture of in vitro embryos.

Ocorrência e mecanismos do microquimerismo fetal em gestações bovinas / Occurrence and mechanisms of fetal microchimerism in bovines pregnancies

O sucesso da gestação depende da adequada comunicação materno-fetal, que em algumas espécies têm um contato mais íntimo devido à capacidade migratória de populações de células trofoblásticas. Nos bovinos esse mecanismo é realizado pelas células trofoblásticas gigantes (CTGs), com invasão limitada até a lâmina basal do epitélio materno. Apesar dessa leve invasão das CTGs, é possível encontrar células fetais circulantes no sangue periférico da vaca gestante, levando ao microquimerismo fetal. Além de toda uma sinalização local e sistêmica e mudanças conformacionais, a migração das CTGs também é dependente da tolerância imunológica do epitélio materno que possui uma baixa expressão de MHC de classe I. Em contrapartida, o trofoblasto expressa MHC de classe Ib para impedir a ativação das células natural killers uterinas (uNK) contra ele mesmo. Neste contexto, o objetivo desse trabalho foi estudar a ocorrência e contribuir para o entendimento dos mecanismos da migração celular na placenta bovina, com marcadores exclusivos do cromossomo Y e de um modelo de clone transgênico expressando a proteína GFP. A hipótese testada foi que o microquimerismo fetal observado mediante a detecção do gene TSPY no sangue periférico da vaca gestante de embrião macho, e de GFP nos tecidos placentários maternos, associado à expressão de MHC classe 1b (Qa2) na interface materno-fetal. Para tanto, 153 embriões produzidos por fertilização in vitro (FIV) foram transferidos, resultando em 34 embriões machos e 31 fêmeas no dia 62 de gestação, quando foi realizada a coleta de sangue periférico da receptora. Dentre estas gestações, foram selecionadas de 25 machos, 4 fêmeas e 5 perdas gestacionais (confirmadas no D39 por ultrassonografia) para detecção de TSPY. Também foram produzidas gestações de clones transgênicos, expressando GFP com 30, 60 e 90 dias que foram utilizadas para a detecção de mRNA e a proteína GFP. Nas gestações de FIV 60% dos embriões machos, 50% das fêmeas e 40% das perdas gestacionais foram positivos para TSPY. A detecção de TSPY nas gestações de fêmeas possivelmente é resultante da persistência do microquimerismo de gestações anteriores. Nas gestações de clones transgênicos, observou-se a presença de mRNA e proteína GFP no endométrio, também indicando migração nesta região ou o transporte da GFP, e outros conteúdos do trofoblasto, para o epitélio materno. Nos placentônios, usando anticorpo anti-GFP pode-se ver a marcação positiva tanto no trofoblasto como no epitélio materno, possivelmente decorrente de liberação das CTGs no estroma endometrial após a fusão. As CTGs, quando em formação sincicial, têm a sua expressão de GFP diminuída, o que também foi observado, utilizando-se anticorpo anti-Qa2 (antígeno murino para MHC classe Ib). O epitélio materno e o trofoblástico também foram marcados para Qa2. Mediante as técnicas utilizadas, observamos que o microquimerismo pôde ser identificado nas gestações analisadas com o uso dos marcadores TSPY no sangue e o GFP nos tecidos placentários maternos. Este estudo mostra que na placenta bovina ocorre uma migração de células fetais além do epitélio materno e abre novas perspectivas para estudos das características da interação materno-fetal ainda pouco explorada nos bovinos

The pregnancy success depends of adequate materno-fetal communication, that in some species are have a more intimate contact due migratory capacity of trophoblastic cells populations. In bovines, this mechanism is realized by trophoblast giant cells (TGC) with limited invasion until basal lamina of maternal epithelium. Besides this light invasion of TGCs, is possible to encounter circulate fetal cells in peripheral blood of pregnant cow, leading to fetal microchimerism. Beyond local and systemic sinalization and conformational changes, TGC migration is also dependent of immunologic tolerance of maternal epithelium that possess a downregulation of classe I MHC. In complement, the trophoblast express classe Ib MHC to inhibit natural killers cells activation. In this context, the objective of this work was to study the occurrence and contribute for knowledge cellular migration mechanisms in bovine palcenta, with Y-specific markers and a model of transgenic clone expressing GFP. The tested hypothesis was that fetal microchimerism observed by detection od TSPY gene in peripheral blood of cow pregnant of male embryo, and of GFP in maternal placental tissues associated by expression of class Ib MHC (Qa2) in materno-fetal interface. For this, 153 embryos produced by in vitro fertilization (IVF) were trasnfered, resulting in 34 male embryos and 31 female in day 62 of pregnancy, when recipient peripheral blood was collected. Among these pregnancies, 25 males, 4 females and 5 pregnancy losses (confirmed at 39 days of pregnancy by ultrassonography) was selected for TSPY detection. Also were produced pregnancies of transgenic cloned, embryos expressing GFP, with 30, 60 and 90 days of pregnancy that utilized for GFP mRNA and protein detection. In IVF pregnancies, 60% of male embryos, 50% of females and 40% of pregnancy losses were positive for TSPY. The detection of TSPY in female pregnancies possible is resultant of persistence of microchimerism of anterior pregnancies. In transgenic cloned pregnancies, was observed presence of GFP mRNA and protein in endometrium, also indicating migration in this region or GFP transport, and another trophoblast content, to maternal epithelium. In placentomes, using anti-GFP antibody, could be observed positive immunolabeling in trophoblast and maternal epithelium, possible due CTGs liberation in endometrial stroma after fusion. The CTGs, in syncytium formation, have a downregulation of GFP, that also be observed, utilizing anti-Qa2 antibody (murine antigen of classe Ib MHC). The maternal and trophoblastic epithelium also was Qa2 immunolabed. By utilized techniques, microchimerism could be indentified in analyzed pregnancies with use of markers for TSPY in maternal blood and GFP in maternal placental tissues. This study show that in bovine placenta occurs fetal cell migration further maternal epithelium and show new perspectives for studies of materno-fetal interaction characteristics until under explored in bovines