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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-206366

Resumo

O período de reconhecimento materno da gestação em bovinos caracteriza-se por ser o processo pelo qual o concepto, através da produção de interferon-tau (IFNT) sinaliza sua presença no útero materno. O IFNT tem como principal função manter o corpo lúteo produzindo progesterona necessária para o estabelecimento e manutenção da gestação. O concepto secreta vesículas extracelulares que carreiam proteínas responsáveis pela sinalização entre o embrião e organismo materno no período de pré-implantação. Ainda, vesículas extracelulares secretadas pelo endométrio de bovinos entram no trofectoderma do concepto e estimulam a produção de IFNT. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar se o IFNT secretado por embriões produzidos in vitro (FIV) é capaz de mimetizar a sinalização endócrina em cultivo de células luteais e identificar se essa comunicação mediada pelo IFNT ocorre na forma de proteína livre ou via exossomo. No experimento 1 foi avaliada a capacidade do cultivo primário de células luteais de responder ao interferon tipo I. A expressão de ISG15 aumentou de uma maneira dose-dependente atingindo o platô quando as células luteais foram tratadas com 10ng/ml de interferon-alfa. No experimento 2, células luteais tratadas com meio condicionado por embriões ativados partenogeneticamente (paSOF) cultivados até os 12 dias de desenvolvimento, apresentaram um aumento na expressão de RNAm para ISG15 quando comparados com os grupos que receberam paSOFD7 e paSOFD9. No ensaio antiviral foi detectada uma maior atividade de interferon tipo I no paSOFD9 e 12 do que no grupo paSOFD7. No experimento 3, embriões produzidos por FIV foram cultivados até os dias 7, 9 e 12 de desenvolvimento e posteriormente foi coletado o meio condicionado. A expressão de RNAm para IFNT2 foi avaliada nestes embriões FIV com 7, 9 e 12 dias. Nos embriões do dia 9, a expressão de RNAm para IFNT2 foi maior que nos embriões do dia 7, e nenhuma diferença foi observada nos embriões do dia 12. O meio condicionado por embriões FIV com 7, 9 e 12 dias foi utilizado no tratamento do cultivo de células luteais e posteriormente foi avaliada a expressão de RNAm para ISG15. As células luteais tratadas com ivfSOF (SOF condicionado por embriões FIV até os dias 7, 9 e 12, antes da ultracentrifugação) e SN (SOF condicionado por embriões FIV até os dias 7, 9 e 12, após a ultracentrifugação, sem vesículas extracelulares) apresentaram um aumento na expressão de ISG15 quando comparadas com EVs (pellet enriquecido com exossomos obtidos após ultracentrifugação do SOF condicionado por embriões FIV). Vesículas extracelulares foram marcadas com PKH67 e observou-se sua presença dentro das células luteais. Desta forma, percebe-se que o cultivo de células luteais respondeu ao tratamento com interferon tipo I presente no meio condicionado por embriões PA e FIV já no dia 7 de desenvolvimento e esta comunicação ocorre usando interferons na forma de proteína livre.

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Maternal recognition of pregnancy period in bovine is characterized when the concept secrets IFNT and signals its presence inside maternal uterus. IFNT main function is to maintain corpus luteum producing progesterone to establishment and maintain pregnancy. Conceptus derived-extracellular vesicles transport proteins responsible for signaling to the maternal organism in the pre-attachment period. Also, extracellular vesicles secreted by bovine endometrium stimulate conceptus trophectoderm IFNT production. Therefore, the aim this study was to evaluate whether in vitro fertilized (IVF) embryo-derived IFNT is capable to stimulate ISG15 expression in luteal cells culture, and also to identify if IFNT signal occurs in free protein form or via exosome. In experiment 1, it was evaluated if primary luteal cells culture responds to type I interferon treatment. ISG15 mRNA expression increased in luteal cells culture in a dose dependent manner reaching a plateau at 10ng/ml of interferon-alpha. In experiment 2, luteal cells culture treated with Day 12 conditioned medium by parthenogenetic activated embryos (paSOF), increased ISG15 mRNA expression when compared to paSOF from Days 7 and 9. Antiviral assay detected a greater bioactivity of type I interferon on Days 9 and 12 paSOF when compared to paSOF from Day 7. In experiment 3, IVF produced embryos were cultured until Days 7, 9 and 12 of development and followed by conditioned medium collection. IFNT2 mRNA expression was assessed on embryos from Days 7, 9 and 12 of development. On Day 9, IFNT2 mRNA expression was greater than Day 7, and no difference was observed on Day 12. ISG15 expression was evaluated on luteal cells culture treated with conditioned medium from IVF produced embryos on Days 7, 9 and 12 of development. Luteal cells culture treated with ivfSOF (SOF from embryos before of ultracentrifugation) and SN (SOF from embryos after of ultracentrifugation, depleted of extracellular vesicles) increased ISG15 mRNA expression when compared to EVs (pellet enriched with exosome obtained after ultracentrifugation of SOF from IVF embryos). Extracellular vesicles were labeled with PHK67 and their presence was observed inside the luteal cells. It is concluded, luteal cells culture respond to Type I interferon treatment present in the conditioned medium from IVF embryos as early as Day 7 of development, and this communication using interferons occurs in the free protein form.

Biblioteca responsável: BR68.1