Supering Apis mellifera (Hymenoptera, Apidae) beehives impairs honey production and biomarker genes

For honey production, beekeepers add one or more supers to the hives to allow honeybees to store their products. However, the increase in hive space can affect the social and health organization in the colony, promoting stress. This study assessed the management of honey production, physicochemical honey properties, population development, and forages immune system gene expression patterns to be used as biomarker for monitoring beekeeping welfare. The treatments comprised 40 beehives divided in four treatments. Treatment 1 - control, supers added according to storage necessity. Treatments 2, 3, and 4 presented two, three, and four supers at the beginning of the experiment, respectively. T1 presented greater honey production (39.4 % increased). No difference in open brood area in the colonies was observed and honey properties and only T2 showed closed brood area higher than the other treatments. Foragers from T4 showed higher catalase and defensin gene expression at the middle-end experiment. Thus, the increasing internal space at the beginning of honey season can affect honey production and immune system of foragers. Catalase and defensin can be used as biomarkers for monitoring honey production welfare.

Comparative toxicity of fipronil, malathion, and thiamethoxam on the stingless bee Tetragonisca fiebrigi (Schwarz, 1938)

Stingless bees are important pollinators for various plant crops. We investigated the susceptibility of Tetragonisca fiebrigito sublethal concentrations of insecticides fipronil, malathion, and thiamethoxam (administered through contact and ingestion) by determining the LC50values after 24hoursof exposure and analyzing changes in the activity of esterase isoenzymes and the chromatin in brain cells. The LC50values showed that all three insecticides were highly toxic through contact and ingestion. Electrophoretic analysis revealed that the relative EST-4 (carboxylesterase) activity in T. fiebrigi was partially inhibited by malathion and fipronil ingestion. Moreover, the EST-4 band intensity was increased following high-concentration thiamethoxam (contact) exposure, indicating the increased relative activity of this isoenzyme to detoxify the compound. In the cytochemical analysis of brain cells, the critical electrolyte concentration (CEC) points for the control stingless bees and malathion ingestion-exposed and thiamethoxam-exposed (contact and ingestion) stingless bees were in the range of 0.20-0.30 M MgCl2, whereas that for malathion contact-exposed bees was 0.15 M MgCl2, indicating chromatin relaxation and suggesting an increase in gene expression. In conclusion, T. fiebrigistingless bees are susceptible to the insecticides tested, and the parameters analyzed may be used as biomarkers to detect the presence of these compounds.(AU)

Era-like GTP protein gene expression in rice / Expressão do gene da proteína GTP semelhante à era no arroz

The mutations are genetic changes in the genome sequences and have a significant role in biotechnology, genetics, and molecular biology even to find out the genome sequences of a cell DNA along with the viral RNA sequencing. The mutations are the alterations in DNA that may be natural or spontaneous and induced due to biochemical reactions or radiations which damage cell DNA. There is another cause of mutations which is known as transposons or jumping genes which can change their position in the genome during meiosis or DNA replication. The transposable elements can induce by self in the genome due to cellular and molecular mechanisms including hypermutation which caused the localization of transposable elements to move within the genome. The use of induced mutations for studying the mutagenesis in crop plants is very common as well as a promising method for screening crop plants with new and enhanced traits for the improvement of yield and production. The utilization of insertional mutations through transposons or jumping genes usually generates stable mutant alleles which are mostly tagged for the presence or absence of jumping genes or transposable elements. The transposable elements may be used for the identification of mutated genes in crop plants and even for the stable insertion of transposable elements in mutated crop plants. The guanine nucleotide-binding (GTP) proteins have an important role in inducing tolerance in rice plants to combat abiotic stress conditions.

Mutações são alterações genéticas nas sequências do genoma e têm papel significativo na biotecnologia, genética e biologia molecular, até mesmo para descobrir as sequências do genoma de um DNA celular junto com o sequenciamento do RNA viral. As mutações são alterações no DNA que podem ser naturais ou espontâneas e induzidas devido a reações bioquímicas ou radiações que danificam o DNA celular. Há outra causa de mutações, conhecida como transposons ou genes saltadores, que podem mudar sua posição no genoma durante a meiose ou a replicação do DNA. Os elementos transponíveis podem induzir por si próprios no genoma devido a mecanismos celulares e moleculares, incluindo hipermutação que causou a localização dos elementos transponíveis para se moverem dentro do genoma. O uso de mutações induzidas para estudar a mutagênese em plantas cultivadas é muito comum, bem como um método promissor para a triagem de plantas cultivadas com características novas e aprimoradas para a melhoria da produtividade e da produção. A utilização de mutações de inserção por meio de transposons ou genes saltadores geralmente gera alelos mutantes estáveis que são marcados quanto à presença ou ausência de genes saltadores ou elementos transponíveis. Os elementos transponíveis podem ser usados para a identificação de genes mutados em plantas de cultivo e até mesmo para a inserção estável de elementos transponíveis em plantas de cultivo mutadas. As proteínas de ligação ao nucleotídeo guanina (GTP) têm papel importante na indução de tolerância em plantas de arroz para combater as condições de estresse abiótico.

Biomarcadores da fisiologia reprodutiva em equinos / Biomarkers of reproductive physiology in equine

Vários estudos encontraram biomarcadores gênicos associados à fertilidade tanto na fêmea como no macho. Este trabalho tem o objetivo de revisar os marcadores gênicos que estão envolvidos na fisiologia da reprodução equina. Diferentes genes foram associados na égua com a fisiologia ovariana e uterina, já no garanhão a presença de genes silenciados na especializada célula espermática vem sendo tema de pesquisas, demonstrando a importância desses genes após a fecundação. Diferente de outras espécies domésticas de interesse zootécnico, os equinos são valorizados como indivíduo, animais de alto padrão genético atingem valores elevados de comércio e reprodução. Os reprodutores equinos, como os homens, recebem tratamento médico para a infertilidade. Assim a identificação de marcadores positivos e negativos referentes à fertilidade, pode ser uma ferramenta para auxiliar a detecção de alterações que comprometam a vida reprodutiva da fêmea e do macho equino.(AU)

Several studies demonstrated genetic biomarkers associated with fertility in both the female and the male. The current study aims to review the genetic markers that are involved in the physiology of equine reproduction. In the mare, different genes have been associated to ovarian and uterine physiology, whereas in the stallion the presence of silenced genes in the specialized sperm cell has been the subject of research, demonstrating the importance of these genes after fertilization. Unlike other domestic species of zootechnical interest, horses are valued as individuals and animals of superior genetic standard reach high values of trade and reproduction. Equine, like men, receive medical treatment for infertility. Thus, the identification of positive and negative markers referring to fertility, can be a tool to assist in the detection of changes that compromise the reproductive life of the female and the male horse.(AU)

Biomarcadores da fisiologia reprodutiva em equinos / Biomarkers of reproductive physiology in equine

Vários estudos encontraram biomarcadores gênicos associados à fertilidade tanto na fêmea como no macho. Este trabalho tem o objetivo de revisar os marcadores gênicos que estão envolvidos na fisiologia da reprodução equina. Diferentes genes foram associados na égua com a fisiologia ovariana e uterina, já no garanhão a presença de genes silenciados na especializada célula espermática vem sendo tema de pesquisas, demonstrando a importância desses genes após a fecundação. Diferente de outras espécies domésticas de interesse zootécnico, os equinos são valorizados como indivíduo, animais de alto padrão genético atingem valores elevados de comércio e reprodução. Os reprodutores equinos, como os homens, recebem tratamento médico para a infertilidade. Assim a identificação de marcadores positivos e negativos referentes à fertilidade, pode ser uma ferramenta para auxiliar a detecção de alterações que comprometam a vida reprodutiva da fêmea e do macho equino.

Several studies demonstrated genetic biomarkers associated with fertility in both the female and the male. The current study aims to review the genetic markers that are involved in the physiology of equine reproduction. In the mare, different genes have been associated to ovarian and uterine physiology, whereas in the stallion the presence of silenced genes in the specialized sperm cell has been the subject of research, demonstrating the importance of these genes after fertilization. Unlike other domestic species of zootechnical interest, horses are valued as individuals and animals of superior genetic standard reach high values of trade and reproduction. Equine, like men, receive medical treatment for infertility. Thus, the identification of positive and negative markers referring to fertility, can be a tool to assist in the detection of changes that compromise the reproductive life of the female and the male horse.

Spatiotemporal expression pattern of alpha, beta, and gamma genes during BoHV-5 infection / Expressão temporal de genes alfa, beta e gama durante ainfecção pelo BoHV-5

Bovine herpesvirus 5 is an alphaherpesvirus that causes nonsuppurative meningoencephalitis in cattle. This disease occurs naturally in either outbreaks or isolated cases, and exhibits low morbidity and high lethality. Although previous studies elucidated crucial aspects involved in the pathogenesis of the disease, there is a paucity of information regarding the molecular events contributing to infection and replication of BoHV-5. The objective of the present study was to determine the in vitro gene expression pattern of BoHV-5 (e.g., alpha, beta, and gamma genes) and host cells genes (GAPDH and 18S) over time utilizing different quantities of inoculated virus. Three BoHV-5 genes (bICP0, UL9, US4) and one structural bovine cell gene had their expression accessed by real-time PCR. While the expression of BoHV-5 genes increased during the course of infection, GAPDH gene expression decreased in the host cells, evidencing the effect of viral infection on the expression of bovine cell genes. The 18S ribosomal RNA (rRNA) gene was constitutively expressed throughout BoHV-5 infection. Our data clearly demonstrates that GAPDH gene should not be used as a reference gene in studies of BoHV-5 infection because it was influenced by viral infection. However, 18S rRNA was constitutively expressed and, therefore, is recommended for normalization of BoHV-5 infection studies in bovine cells. The expression of viral genes transcripts was not altered by increasing number of viral particles added to the culture. All viral genes included here demonstrated the same expression pattern over time and there was no difference in the expression of viral genes among the various time points. Our data show important differences comparing to classical studies regarding herpesvirus alpha, beta, and gamma genes expression. More research is necessary to improve our understanding about the BoHV-5 biology during infection. Studies employing next-generation sequencing (i.e., RNA-seq), using both in vitro and in vivo models, would be the next logical step to grasp the virus and host cell's transcriptome changes over the course of infection.(AU)

Herpesvirus bovino 5 é um alfaherpesvírus causador de meningoencefalite não supurativa em bovinos. Esta doença possui ocorrência natural em surtos ou casos isolados, associadas a baixa morbidade e alta letalidade. Embora estudos anteriores tenham elucidado aspectos relacionados a patogenia da doença, há uma lacuna de conhecimento relacionado aos eventos moleculares que contribuem para a infecção e replicação do BoHV-5. O objetivo do presente estudo foi determinar a expressão gênica in vitro de genes virais (i.e., alfa, beta e gama) e das células hospedeiras (GAPDH e 18S) durante a infecção considerando diferentes momentos de infecção e quantidade de vírus utilizado. Três genes do BoHV-5 (bICP0, UL9, US4), um gene estrutural (GAPDH) e um gene constitutivo (18S) da célula bovina tiveram suas expressões avaliadas por PCR quantitativa (qPCR). Enquanto os genes virais tiveram sua expressão aumentada ao longo do tempo de infecção, o gene hospedeiro teve sua expressão diminuída, demonstrando a ação do vírus na expressão gênica de células bovinas in vitro. O gene constitutivo 18S teve sua expressão mantida durante todos os momentos do experimento. Nossos resultados claramente demonstraram que o GAPDH não deve ser usado como gene de referência em estudos com infecção por BoHV-5 pois é influenciado pela infecção viral. Entretanto, o 18S rRNA foi constitutivamente expresso e pode ser recomendado para normalização em células bovinas infectadas pelo vírus. A expressão de mRNA viral não foi alterada pela quantidade de vírus usada. Todos os genes virais demonstraram o mesmo padrão de expressão ao longo do tempo de infecção. Nossos resultados trazem importantes diferenças comparando aos estudos clássicos que avaliaram a expressão de genes alfa, beta e gama. Mais estudos são necessários para aumentar o conhecimento da biologia molecular do BoHV-5. Estudo utilizando sequenciamento de última geração (i.e., RNA-seq), usando modelos in vitro e in vivo, aparentam ser o próximo passo lógico para acessar as alterações do transcriptoma do hospedeiro e viral ao longo do curso da infecção.(AU)

Spatiotemporal expression pattern of alpha, beta, and gamma genes during BoHV-5 infection / Expressão temporal de genes alfa, beta e gama durante ainfecção pelo BoHV-5

Bovine herpesvirus 5 is an alphaherpesvirus that causes nonsuppurative meningoencephalitis in cattle. This disease occurs naturally in either outbreaks or isolated cases, and exhibits low morbidity and high lethality. Although previous studies elucidated crucial aspects involved in the pathogenesis of the disease, there is a paucity of information regarding the molecular events contributing to infection and replication of BoHV-5. The objective of the present study was to determine the in vitro gene expression pattern of BoHV-5 (e.g., alpha, beta, and gamma genes) and host cells genes (GAPDH and 18S) over time utilizing different quantities of inoculated virus. Three BoHV-5 genes (bICP0, UL9, US4) and one structural bovine cell gene had their expression accessed by real-time PCR. While the expression of BoHV-5 genes increased during the course of infection, GAPDH gene expression decreased in the host cells, evidencing the effect of viral infection on the expression of bovine cell genes. The 18S ribosomal RNA (rRNA) gene was constitutively expressed throughout BoHV-5 infection. Our data clearly demonstrates that GAPDH gene should not be used as a reference gene in studies of BoHV-5 infection because it was influenced by viral infection. However, 18S rRNA was constitutively expressed and, therefore, is recommended for normalization of BoHV-5 infection studies in bovine cells. The expression of viral genes transcripts was not altered by increasing number of viral particles added to the culture. All viral genes included here demonstrated the same expression pattern over time and there was no difference in the expression of viral genes among the various time points. Our data show important differences comparing to classical studies regarding herpesvirus alpha, beta, and gamma genes expression. More research is necessary to improve our understanding about the BoHV-5 biology during infection. Studies employing next-generation sequencing (i.e., RNA-seq), using both in vitro and in vivo models, would be the next logical step to grasp the virus and host cell's transcriptome changes over the course of infection.(AU)

Herpesvirus bovino 5 é um alfaherpesvírus causador de meningoencefalite não supurativa em bovinos. Esta doença possui ocorrência natural em surtos ou casos isolados, associadas a baixa morbidade e alta letalidade. Embora estudos anteriores tenham elucidado aspectos relacionados a patogenia da doença, há uma lacuna de conhecimento relacionado aos eventos moleculares que contribuem para a infecção e replicação do BoHV-5. O objetivo do presente estudo foi determinar a expressão gênica in vitro de genes virais (i.e., alfa, beta e gama) e das células hospedeiras (GAPDH e 18S) durante a infecção considerando diferentes momentos de infecção e quantidade de vírus utilizado. Três genes do BoHV-5 (bICP0, UL9, US4), um gene estrutural (GAPDH) e um gene constitutivo (18S) da célula bovina tiveram suas expressões avaliadas por PCR quantitativa (qPCR). Enquanto os genes virais tiveram sua expressão aumentada ao longo do tempo de infecção, o gene hospedeiro teve sua expressão diminuída, demonstrando a ação do vírus na expressão gênica de células bovinas in vitro. O gene constitutivo 18S teve sua expressão mantida durante todos os momentos do experimento. Nossos resultados claramente demonstraram que o GAPDH não deve ser usado como gene de referência em estudos com infecção por BoHV-5 pois é influenciado pela infecção viral. Entretanto, o 18S rRNA foi constitutivamente expresso e pode ser recomendado para normalização em células bovinas infectadas pelo vírus. A expressão de mRNA viral não foi alterada pela quantidade de vírus usada. Todos os genes virais demonstraram o mesmo padrão de expressão ao longo do tempo de infecção. Nossos resultados trazem importantes diferenças comparando aos estudos clássicos que avaliaram a expressão de genes alfa, beta e gama. Mais estudos são necessários para aumentar o conhecimento da biologia molecular do BoHV-5. Estudo utilizando sequenciamento de última geração (i.e., RNA-seq), usando modelos in vitro e in vivo, aparentam ser o próximo passo lógico para acessar as alterações do transcriptoma do hospedeiro e viral ao longo do curso da infecção.(AU)

Transcriptomic analysis of differential gene expression reveals an increase in COX2 levels during in vitro canine herpesvirus infection / Análise transcriptômica da expressão gênica diferencial revela um aumento nos níveis de COX2 durante a infecção in vitro por herpesvirus canino

Canine herpesvirus (CaHV-1) affects canids worldwide, causing death in neonates and immunosuppressed hosts. Acute infection by CaHV-1 can cause reproductive, respiratory, and neurological problems in adult animals. Viral pathogenesis and host genes expressions during of CaHV-1infection are not clearly understood. In the present study, the transcriptome of canine kidney cell Mardin-Darby (MDCK) infected in vitro with canine herpesvirus was explored. For this, RNA sequencing (RNA-seq) of the samples in different moments during infection was carried out. Subsequently, the transcriptomic analysis genes related to cell activities and process involved to viral cycle infection were evaluated until 32h post-inoculation (pi). Among evaluated genes, was verified a significant and gradative increase of the prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2) or cyclooxygenase 2 (COX2) gene expression, throughout of infection, though differential gene expression analysis and validated by quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR). High COX2 expression is usually induced in response to inflammation, pathogens or activation of the immune system but can be a viral mechanism to favor viral replication. Thus, COX2 level increase can be a favorable factor for viral infection with Cahv-1 virus and the use of selective COX2 inhibitors may be beneficial for limiting the infection or clinical signs by causing interruption of the viral replication cycle during active infection. Additionally, the regulation genes expression differential verified in this study can contribute to determining important targets for inhibiting canine herpesvirus infection either by cellular or viral mechanisms.(AU)

O herpesvírus canino (CaHV-1) afeta os canídeos em todo o mundo, causando morte em neonatos e hospedeiros imunossuprimidos. A infecção aguda por CaHV-1 pode causar problemas reprodutivos, respiratórios e neurológicos em animais adultos. A patogênese viral e expressão de genes hospedeiros durante a infecção por CaHV-1 ainda não são bem compreendidos. No presente estudo, o transcriptoma de células de rim canino Madin-Darby (MDCK) infectadas in vitro com herpesvirus canino foi explorado. Para isso, foi realizado o sequenciamento de RNA (RNA-seq) de amostras coletadas em diferentes momentos durante a infecção. Subsequentemente, a análise transcriptômica dos genes relacionados à atividade celular e aos processos envolvidos no ciclo de infecção do vírus foram avaliadas até 32 horas após a inoculação (pi). Dentre os genes avaliados, constatamos uma elevação significativa e gradativa da expressão da Prostaglandina-endoperoxide sintase 2 (PTGS2) ou ciclooxigenase 2 (COX2), ao longo da infecção viral, foi verificada por análise de expressão gênica diferencial e validada por resultados de transcrição reversa por PCR quantitativo (RT-qPCR). O aumento da expressão de COX2 geralmente é induzida em resposta a inflamação, patógenos ou ativação do sistema imune, mas também pode ser um mecanismo para favorecer a replicação viral. Assim, o aumento do nível de COX2 pode ser um fator favorável à infecção viral pelo vírus CaHV-1 e o uso de inibidores seletivos da COX2 pode ser benéfico para limitar a infecção ou os sinais clínicos, causando a interrupção do ciclo de replicação viral durante a infecção ativa. Além disso, a regulação diferencial da expressão dos genes verificados neste estudo podem contribuir para determinar alvos importantes para inibir a infecção por herpesvírus canino, seja por mecanismos celulares ou virais.(AU)

Lack of association among TNF-α gene expression, -308 polymorphism (G > A) and virulence markers of Helicobacter pylori

Background Tumor necrosis factor plays a critical role in the pathogenesis of gastric diseases such as gastric cancer, and an abnormal inflammatory response has frequently been observed in dyspeptic patients. Helicobacter pylori infection can induce a gastric mucosal inflammatory response that may be influenced by -308 (G > A) polymorphisms and gene expression of theTNF-α gene. Methods One hundred and thirty-four gastric biopsy samples were collected from patients of both genders (61♂ and 73♀, mean age 40.3 ± 24.2 years) with gastric symptoms. The -308 (G > A) polymorphism of TNF-α; was characterized using polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP). The expression level was measured using real-time PCR, and relative quantification (RQ) was calculated using the comparative CT method (2-ΔΔCT). Results The analysis revealed an increase in TNF-α gene expression in patients with gastritis; on the other hand, no statistical differences were observed in patients with gastric cancer. In addition, no association was found among -308 polymorphism genotypes, virulence markers, or TNF-α gene expression. Conclusions Helicobacter pylori induces a large increase in TNF-α expression in patients with gastritis, regardless of tissue inflammation, but after the tissue becomes neoplastic, the presence of bacteria did not influence expression. These results suggest that the TNF-α; pathway may play an important role in the progression from gastritis to gastric cancer(AU)

Characteristics of dr1790 disruptant and its functional analysis in Deinococcus radiodurans

Deinococcus radiodurans (DR) is an extremophile that is well known for its resistance to radiation, oxidants and desiccation. The gene dr1790 of D. radiodurans was predicted to encode a yellow-related protein. The primary objective of the present study was to characterize the biological function of the DR1790 protein, which is a member of the ancient yellow/major royal jelly (MRJ) protein family, in prokaryotes. Fluorescence labeling demonstrated that the yellow-related protein encoded by dr1790 is a membrane protein. The deletion of the dr1790 gene decreased the cell growth rate and sensitivity to hydrogen peroxide and radiation and increased the membrane permeability of D. radiodurans. Transcript profiling by microarray and RT-PCR analyses of the dr1790 deletion mutant suggested that some genes that are involved in protein secretion and transport were strongly suppressed, while other genes that are involved in protein quality control, such as chaperones and proteases, were induced. In addition, the expression of genes with predicted functions that are involved in antioxidant systems, electron transport, and energy metabolism was significantly altered through the disruption of dr1790. Moreover, the results of proteomic analyses using 2-DE and MS also demonstrated that DR1790 contributed to D. radiodurans survival. Taken together, these results indicate that the DR1790 protein from the ancient yellow protein family plays a pleiotropic role in the survival of prokaryotic cells and contributes to the extraordinary resistance of D. radiodurans against oxidative and radiation stresses.(AU)

Clonal profile, virulence and resistance of Staphylococcus aureus isolated from sheep milk

The objective of this study was to characterize the clonal profile, virulence factors and antimicrobial resistance, particularly oxacillin resistance, of Staphylococcus aureus isolated from sheep milk. Milk samples were collected from all teats for the California Mastitis Test (CMT), somatic cell count, identification of S. aureus, investigation in these strains of genes encoding toxins (sea, seb, sec, sed, tst), biofilm (icaA, icaC, icaD, bap), leukocidin (luk-PV) oxacillin resistance by mecA gene detection and susceptibility testing (12 antibiotics). Messenger RNA expression was evaluated by RT-PCR in isolates carrying toxin and biofilm genes. Biofilm formation was also evaluated phenotypically by adherence to polystyrene plates. The clonal profile of S. aureus was investigated by pulsed-field gel electrophoresis. A total of 473 milk samples were collected from 242 animals on three farms and 20 S. aureus strains were isolated and none carried the mecA gene. The two sec gene-positive isolates and the isolates carrying the tst and luk-PV genes were positive by RT-PCR. Staphylococcus aureus isolated from the three flocks studied showed high susceptibility to the drugs tested and none was biofilm producer, indicating that biofilm formation was not a virulence factor causing infection by these strains. The typing of 17 S. aureus isolates revealed the presence of a common clone on the three farms studied, and the presence and expression of the sec and tst genes in one strain of this clone suggest the possible acquisition of virulence genes by this clone, a fact that is important for animal health and food hygiene.(AU)

Proteômica de células ASK-2 ( Atlantic Salmon Kidney 2 ) infectadas pelo vírus da anemia infecciosa do salmão.

A anemia infecciosa do salmão (AIS) é uma doença do salmão do Atlântico cultivado causada pelo vírus da anemia infecciosa do salmão (ISAV), pertencente à família Orthomyxoviridae. Embora vários estudos moleculares tenham objetivado compreender a interação salmão-ISAV, nenhum deles concentrou sua atenção na dinâmica do proteoma da célula hospedeira na infecção pelo ISAV. O presente estudo avaliou a dinâmica do proteoma e as alterações ultraestruturais de células de rim de salmão do Atlântico (ASK-2) infectadas pelo ISAV em 12, 36, 60 e 84 horas pós-infecção por proteômica quantitativa baseada em espectrometria de massas e microscopia eletrônica de transmissão. Um total de 1.726 proteínas foram identificadas. Destas, 390 proteínas foram diferencialmente produzidas em relação ao grupo controle e 434 foram identificadas exclusivamente em culturas de células infectadas pelo ISAV. Os resultados revelaram que as alterações nos níveis de expressão das proteínas celulares aumentam durante a infecção viral, onde a maioria das proteínas foi regulada negativamente. A análise de bioinformática mostrou que proteínas diferencialmente produzidas estão envolvidas em vários processos biológicos, como regulação da expressão gênica e da resposta imune, denotando que as atividades intracelulares foram alteradas pela infecção viral. Diversas proteínas identificadas já foram estudadas como fatores celulares relevantes para a replicação viral, atuando desde a entrada do vírus na célula até o seu brotamento, especialmente para o vírus influenza, outro membro da família Orthomyxoviridae. Os achados por microscopia eletrônica confirmaram algumas alterações descritas em estudos anteriores e também descrevem novas alterações na célula. O proteoma da célula ASK-2 se mostrou distinto para cada tempo de coleta, altamente dinâmico e com tendência de redução progressiva das proteínas celulares (host shutoff). Os resultados permitiram inferir novos aspectos da biologia do ISAV

Infectious salmon anemia (ISA) is a disease of farmed Atlantic salmon caused by the aquatic orthomyxovirus infectious salmon anemia virus (ISAV). Although several molecular studies have aimed to understand salmon-ISAV interaction, none of them has focused their attention upon the viral and host cell proteomes dynamics. We studied the dynamics of the proteome and ultrastructural changes of Atlantic salmon kidney (ASK-2) cells infected with ISAV up to 12, 36, 60 and 84 hours post infection by mass spectrometry based quantitative proteomics and transmission electron microscopy. A total of 1.726 proteins were identified. From these, 390 proteins were differentially expressed in relation of control group and 434 were identified exclusively in ISAV-infected cell cultures. Our data revealed that changes in salmon protein expression levels increase during viral infection, where, most proteins were significantly down-regulated. Bioinformatics analysis showed that differentially expressed proteins are involved in several biological processes, such as gene expression and immune response, suggesting that intracellular activities were changed upon viral infection. Through literature review, many of the proteins identified here have already been studied as host factors relevant for viral replication, acting from the entrance of the virus in the cell until its budding, especially for influenza virus. Our findings by electron microscopy confirmed some changes described in previous studies and also brought new changes in the cell. For the first time we are able to describe changes of the cellular proteome of the ASK-2 cells overtime, revealing dynamic regulation processes and provides evidence that ISAV infection has impact on the cell status at protein level.

THE ROLE OF THE CD46 RECEPTOR IN THE PATHOGENICITY OF THE BOVINE VIRAL DIARRHEA VIRUS INFECTION IN BOVINE CULTURED CELLS

O vírus da Diarreia Viral Bovina (BVDV) é um dos principais patógenos virais que causam importantes doenças clínicas em bovinos. A presença deste vírus em rebanhos representa um grande risco para a produtividade por perdas econômicas significativas. O uso da tecnologia de edição gênica, como o sistema CRISPR/Cas9, em animais de produção pode contribuir para o desenvolvimento de modelos de resistência a doenças, como a BVD. Mesmo que os mecanismos de infecção, entrada e liberação do BVDV não sejam totalmente compreendidos, a molécula CD46 é considerada o principal receptor celular para o BVDV em bovinos. O mapeamento do local de adesão ao BVDV demonstrou que dois peptídeos, localizados no módulo mais distal da proteína 1 de controle do complemento (CCP1), fornecem a plataforma de adesão ao BVDV. Os objetivos deste estudo foram (i) caracterizar o CD46 em linhagens celulares bovinas; (ii) modificar a plataforma de adesão do receptor por edição gênica; e (iii) investigar a permissibilidade do BVDV à infecção celular em células editadas geneticamente para o gene CD46. Para caracterizar o receptor, foi sequenciado o DNA complementar do gene CD46 em amostras de fibroblastos bovinos e em linhagens celulares de rim bovino Madin-Darby suscetíveis (MDBK) ou resistentes (CRIB) ao BVDV. Posteriormente, por edição gênica pelo sistema CRISPR/Cas9, criaram-se indels no éxon 1 do gene CD46, removendo oligopeptídeos que conformam a plataforma de adesão do receptor CD46 ao BVDV. Para realizar a edição genômica, duas sequências de RNA-guia (gRNA) foram selecionadas para a deleção do éxon 1 do CD46 em células MDBK. Posteriormente, dois plasmídeos px458, específicos para cada umas das gRNAs, e com expressão da proteína fluorescente verde (GFP), foram co-transfectados em células MDBK. O isolamento de populações de células clonais com modificações específicas das células transfectadas foi realizado por citometria de fluxo, seguido de um período de expansão para estabelecer sub-populações de células clonais. O DNA genômico foi isolado e amplificado por PCR. O produto do PCR foi ligado em plasmídeos pCR-TOPO, transformado em células TOP10 E. coli e sequenciado. Como resultados, identificou-se que as células CRIB codificam uma proteína CD46 semelhante às MDBK e aos fibroblastos, sem nenhuma mutação na região de interesse, com o receptor CD46 não apresentando aparente importância na resistência destas células à infecção por BVDV. Além disso, obtivemos três linhagens celulares MDBK com deleção em segmentos específicos na região codificante para o CCP1 referente a plataforma de adesão ao BVDV. Uma das linhagens apresentou a deleção bialélica, com a edição gênica sendo diferente em cada alelo; outra linhagem apresentou uma edição bialélica, com um dos alelos não apresentando a deleção da plataforma de adesão; e a última linhagem apresentou uma deleção bialélica homozigota. O estudo da susceptibilidade destas células mutantes à infecção pelo BVDV encontra-se em andamento. Com as três linhagens celulares bovinas modificadas geneticamente para a plataforma de adesão do receptor CD46 ao BVDV, tem-se a expectativa que estas modificações genéticas possivelmente levarão a uma diminuição na infecção pelo BVDV, o que permitirá obtermos mais informações sobre o mecanismo de entrada e infecção do vírus em células bovinas. Tal estratégia mostra-se viável para a futura geração de bovinos resistentes ao BVDV por biotécnicas avançadas da reprodução, como pela clonagem por transferência nuclear de células somáticas (TNCS).

The Bovine Viral Diarrhea virus (BVDV) is one of the major viral pathogens that cause important clinical diseases in cattle. The presence of the virus in herds represents a major risk for productivity due to significant economic losses. The use of gene-editing technology, such as the CRISPR/Cas9 system, in livestock animals can contribute to the development of disease resistance models, such as BVD. Even though the mechanisms of infection, entry and release of BVDV are not yet fully understood, the CD46 molecule is considered the major cellular receptor for BVDV in cattle. The mapping of the adhesion site to the BVDV revealed that two peptides, located in the most distal domain of the complement control protein 1 (CCP1), provide the adhesion platform for the virus. The aims of this study were (i) to characterize CD46 in bovine cell lines; (ii) to modify the platform of adhesion of the CD46 receptor by gene edition; and (iii) to investigate the permissibility of BVDV to cellular infection in CD46 gene-edited cells. To characterize the receptor, the complementary DNAof the gene CD46 was sequenced on samples of fibroblast cells and in Madin-Darby bovine kidney cell lines (MDBK) or MDBK susceptible cells and on cells resistant to BVDV infection (CRIB cells). Afterwards, by gene editing using the CRISPR/Cas9 system, indels were created in the exon 1 of the CD46 gene, removing oligopeptides that form the CD46 receptor adhesion platform to BVDV. To achieve the genomic edition, two sequences of guiding RNA (gRNAs) were selected for exon 1 deletion of CD46 in MDBK cells. Subsequently, two px458 plasmids, each encoding one of the gRNAs, and expressing the green fluorescent protein (GFP), were co-transfected into MDBK cells. Isolation of clonal cell populations with specific modifications of the transfected cells was done through Fluorescence Activated Cell Sorting, followed by an expansion period to establish new clonal cell lines. Genomic DNA was isolated and amplified by PCR. The PCR amplified products were ligated into pCR-TOPO plasmid and transformed into TOP10 E. coli cells, and DNA-sequenced. Our results indicated that CRIB cells express a CD46 protein similar to MDBK and fibroblast cells, without any mutation in the region of interest, with the CD46 receptor in CRIB cells showing an apparent no importance in the resistance to BVDV infection. Furthermore, we obtained three MDBK cell lines with deletion in specific segments in the coding region for CCP1 referring to the BVDV adhesion platform. One of the lines presented a biallelic deletion of the adhesion platform, with gene edition being different in each allele; another line presented a biallelic edition, with one of the alleles not containing the adhesion platform deletion; and the last line presented a biallelic homozygous deletion. However, the study of the susceptibility of such mutant cells to BVDV infection is still ongoing. With the three genetically modified bovine cell lines to the CD46 receptor adhesion platform on BVDV, such genetic modification will possibly lead to a decrease in BVDV infection, which may allow us to obtain more pieces of information regarding mechanisms of virus entry and infection in bovine cells. Such a strategy proves to be feasible for the future generation of BVDV resistant animals by the use of advanced reproductive technologies, such as cloning by somatic cell nuclear transfer (SCNT).

Biomarkers to evaluate the effects of temperature and methanol on recombinant Pichia pastoris

Pichia pastoris is methylotrophic yeast used as an efficient expression system for heterologous protein production. In order to evaluate the effects of temperature (10 and 30 °C) and methanol (1 and 3% (v/v)) on genetically-modified Pichia pastoris, different biomarkers were evaluated: Heat stress (HSF-1 and Hsp70), oxidative stress (OGG1 and TBARS) and antioxidant (GLR). Three yeast cultures were performed: 3X = 3% methanol-10 °C, 4X = 3% methanol-30 °C, and 5X = 1% methanol-10°C. The expression level of HIF-1α, HSF-1, HSP-70 and HSP-90 biomarkers were measured by Western blot and in situ detection was performed by immunocytochemistry. Ours results show that at 3% methanol -30 °C there is an increase of mitochondrial OGG1 (mtOGG1), Glutathione Reductase (GLR) and TBARS. In addition, there was a cytosolic expression of HSF-1 and HSP-70, which indicates a deprotection against nucleolar fragmentation (apoptosis). On the other hand, at 3% methanol -10 °C and 1% and at methanol -10 °C conditions there was nuclear expression of OGG1, lower levels of TBARS and lower expression of GLR, cytosolic expression of HSF-1 and nuclear expression HSP-70. In conclusion, our results suggest that 3% methanol-30 °C is a condition that induces a strong oxidative stress and risk factors of apoptosis in modified-genetically P. pastoris.

Expressão gênica de mediadores associados a neuropatogênese causada pelo BVH5

O herpes vírus bovino 5 (HVB-5) é um agente infeccioso pertencente a família Herpesviridae, sub-família Alphaherpesvirinae e gênero Varicellovirus. É um vírus neurotrópico que causa doenças neurológicas principalmente em animais jovens em todo mundo, especialmente nos países Sul-americanos, resultado em significantes perdas econômicas. A infecção pelo herpes vírus bovino 5 em gado jovemestá associado a doença neurológica que é, usualmente, fatal, sendo um ótimo modelo para estudar a patogênese da meningoencefalite induzida por vírus. O HVB5 replica na mucosa nasal, e invadesistema nervoso central (SNC), principalmente por meio do sistema olfatório. A resposta imune inata desencadeada pelo hospedeiro frente à replicação do vírus por meio da via olfativa não é totalmente entendida. Estudos verificaram as variações nos níveis de expressão de receptores Toll-Like (TLRs) em diferentes regiões do sistema nervoso central bovino durante a infecção aguda e reativação de bovinos infectados por HVB-1 e HVB-5-.Uma nova perspectiva para entender a relação do patógeno e o hospedeirorelacionando os microRNAs(miRNAs) que interagem com a resposta imune inatadurante infecções virais neurotrópicas.

Bovine herpes virus 5 (BHV-5) is an infectious agent belonging to the family Herpesviridae, subfamily Alphaherpesvirinae and genus Varicellovirus. It is a neurotropic virus that causes neurological diseases mainly in young animals worldwide, especially in the South American countries, resulting in significant economic losses. Bovine herpesvirus 5 infection in young cattle is associated with neurological disease, which is usually fatal and is a good model for studying the pathogenesis of virus-induced meningoencephalitis. The BHV5 replicates in the nasal mucosa, and invades the central nervous system (CNS), mainly through the olfactory system. The innate immune response triggered by the host against virus replication via the olfactory route is not fully understood. Studies have found variations in the levels of Toll-Like receptor (TLR) expression in different regions of the bovine central nervous system during acute infection and reactivation of BoHV-1 and BoHV-5 infected bovines. A new perspective to understand the relationship of the pathogen and the host relating the microRNAs (miRNAs) that interact with the innate immune response during neurotropic viral infections.

Biomarcadores celulares e moleculares envolvidos na resposta imune-inflamatória modulada por ácidos graxos insaturados / Cellular and molecular biomarkers involved in immune-inflammatory response modulated by unsaturated fatty acids

A resposta imunológica é um processo complexo que envolve a interação e sinalização de diferentes tipos celulares e moleculares, conhecidos como biomarcadores, os quais atuam de modo coordenado para promover a defesa do organismo. Essa resposta inicia-se com a instalação do processo inflamatório, que culmina com eliminação de agentes microbianos e cicatrização do tecido afetado, podendo evoluir para uma resposta mais específica. Muitos mediadores produzidos durante essas reações, sobretudo aqueles de natureza lipídica e peptídica, podem ser originados da imunomodulação promovida por ácidos graxos insaturados fornecidos pela dieta ou sintetizados endogenamente. Ácidos graxos insaturados são constituintes das membranas celulares e reguladores da expressão gênica, atuando nas vias de sinalização, transdução de sinais e proliferação celular e gerando produtos que regulam os mecanismos da imunidade humoral e celular. Esses lipídios apresentam várias propriedades biológicas, incluindo importantes efeitos imunomoduladores sobre a inflamação e a cicatrização. Ácidos graxos insaturados regulam a ativação de diversas células envolvidas nesses processos, tais como macrófagos, neutrófilos, linfócitos, queratinócitos e células dendríticas, bem como a secreção de seus produtos, exercem efeitos sobre enzimas e fatores de transcrição gênica, estimulando ou inibindo a produção de eicosanóides, como as prostaglandinas e leucotrienos, citocinas, moléculas de adesão, fatores de crescimento e outras moléculas específicas envolvidas nas diferentes fases do reparo tecidual, além de modular o estresse oxidativo. Neste contexto, esse artigo tem como objetivo revisar o papel dos principais biomarcadores celulares e moleculares envolvidos na resposta imune-inflamatória modulada por ácidos graxos insaturados.

Immune response is a complex process that involves interaction and signaling of different cell and molecular types, known as biomarkers, which are organized to promote the defense of organism. This response begins with installation of the inflammatory process and culminates with elimination of the microbial agents, damage tissue and repair. The inflammatory response can progress to a more specific process. Many mediators are produced during inflammation, especially lipid and peptide mediators. These substances can be generated from immunomodulation promoted by unsaturated fatty acids provided by dietary or endogenously synthesized. Unsaturated fatty acids are constituents of cell membranes and regulators of gene expression and act on signaling pathways, signal transduction and cell proliferation, generating products that regulate the mechanisms of humoral and cellular immunity. These lipids have multiple biological properties, including important immunomodulatory effects on inflammation and wound healing. Unsaturated fatty acids regulate the activation of various cells involved in these processes, such as macrophages, neutrophils, lymphocytes, keratinocytes and dendritic cells, as well as secretion of their products, exert effects on enzymes and gene transcription factors by stimulating or inhibiting the production of eicosanoids as prostaglandins and leukotrienes, cytokines, adhesion molecules, growth factors and other specific molecules involved in different phases of tissue repair, and modulate oxidative stress. In this context, the aim of this paper is to review the role of main cellular and molecular biomarkers involved in immune-inflammatory response modulated by unsaturated fatty acids.

Biomarcadores celulares e moleculares envolvidos na resposta imune-inflamatória modulada por ácidos graxos insaturados / Cellular and molecular biomarkers involved in immune-inflammatory response modulated by unsaturated fatty acids

A resposta imunológica é um processo complexo que envolve a interação e sinalização de diferentes tipos celulares e moleculares, conhecidos como biomarcadores, os quais atuam de modo coordenado para promover a defesa do organismo. Essa resposta inicia-se com a instalação do processo inflamatório, que culmina com eliminação de agentes microbianos e cicatrização do tecido afetado, podendo evoluir para uma resposta mais específica. Muitos mediadores produzidos durante essas reações, sobretudo aqueles de natureza lipídica e peptídica, podem ser originados da imunomodulação promovida por ácidos graxos insaturados fornecidos pela dieta ou sintetizados endogenamente. Ácidos graxos insaturados são constituintes das membranas celulares e reguladores da expressão gênica, atuando nas vias de sinalização, transdução de sinais e proliferação celular e gerando produtos que regulam os mecanismos da imunidade humoral e celular. Esses lipídios apresentam várias propriedades biológicas, incluindo importantes efeitos imunomoduladores sobre a inflamação e a cicatrização. Ácidos graxos insaturados regulam a ativação de diversas células envolvidas nesses processos, tais como macrófagos, neutrófilos, linfócitos, queratinócitos e células dendríticas, bem como a secreção de seus produtos, exercem efeitos sobre enzimas e fatores de transcrição gênica, estimulando ou inibindo a produção de eicosanóides, como as prostaglandinas e leucotrienos, citocinas, moléculas de adesão, fatores de crescimento e outras moléculas específicas envolvidas nas diferentes fases do reparo tecidual, além de modular o estresse oxidativo. Neste contexto, esse artigo tem como objetivo revisar o papel dos principais biomarcadores celulares e moleculares envolvidos na resposta imune-inflamatória modulada por ácidos graxos insaturados.(AU)

Immune response is a complex process that involves interaction and signaling of different cell and molecular types, known as biomarkers, which are organized to promote the defense of organism. This response begins with installation of the inflammatory process and culminates with elimination of the microbial agents, damage tissue and repair. The inflammatory response can progress to a more specific process. Many mediators are produced during inflammation, especially lipid and peptide mediators. These substances can be generated from immunomodulation promoted by unsaturated fatty acids provided by dietary or endogenously synthesized. Unsaturated fatty acids are constituents of cell membranes and regulators of gene expression and act on signaling pathways, signal transduction and cell proliferation, generating products that regulate the mechanisms of humoral and cellular immunity. These lipids have multiple biological properties, including important immunomodulatory effects on inflammation and wound healing. Unsaturated fatty acids regulate the activation of various cells involved in these processes, such as macrophages, neutrophils, lymphocytes, keratinocytes and dendritic cells, as well as secretion of their products, exert effects on enzymes and gene transcription factors by stimulating or inhibiting the production of eicosanoids as prostaglandins and leukotrienes, cytokines, adhesion molecules, growth factors and other specific molecules involved in different phases of tissue repair, and modulate oxidative stress. In this context, the aim of this paper is to review the role of main cellular and molecular biomarkers involved in immune-inflammatory response modulated by unsaturated fatty acids.(AU)

ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA CELULAR E VIRAL DURANTE A INFECÇÃO IN VITRO PELO HERPESVÍRUS CANINO 1

A análise de transcriptoma é essencial para determinar a relação entre as informações codificadas num genoma, a sua expressão e variação fenotípica. O transcriptoma é o conjunto completo de transcritos e a quantidade gerada, relacionado a um estágio de desenvolvimento específico ou condição fisiológica da célula. Estes transcritos podem ser mapeados utilizando genomas como referência, para investigação de expressão do genes. Para isso, exige procedimentos de mineração de grandes volumes de dados de RNA-Seq para extrair conhecimentos biológicos. As ferramentas de bioinformática foram desenvolvidas para facilitar e agilizar essas análises, transformando dados em informações. Assim, alguns desses recursos foram empregados na análise de dados gerados pelo RNAseq, a partir de RNAm de cultura celular MDCK infectada por herpesvírus canino tipo 1 (1CaHV-1 - Canid alphaherpesvirus type 1) em diferentes momentos pós infecção. Dessa forma, foi realizado um dual RNAseq, em que foi avaliado tanto a expressão gênica celular do hospedeiro como do patógeno viral, no curso da infecção. Para isso, foram analisados o transcriptoma das atividades celulares e os processos envolvidos no ciclo de infecção viral, até o momento 32h-pi. Assim, foram identificados as atividades de respostas celulares à infecção viral, mecanismos regulatórios induzidos pelo vírus, transcrição de genes virais imediatos, iniciais e tardios. Dentre eles, foi verificado a elevação da expressão do gene COX-2 induzido pela replicação viral, sendo relacionado à hipóxia e apoptose. Tal fato levanta a possibilidade do uso de inibidores seletivos de COX-2 para interrupção do ciclo de replicação viral e no tratamento da infecções por CaHV-1. Também se verificou a quebra de paradigma quanto o ativação da expressão de genes do ciclo de infecção em cascata. No qual foi verificado a expressão de genes tardios precocemente, e genes imediatos e iniciais permanecendo a expressão tardiamente. Até o momento foi primeiro trabalho realizado de dual RNAseq para análise de expressão gênica celular e viral para CaHV-1.

Transcriptome analysis is essential to determine the relationship between the information encoded in a genome, its expression and phenotypic variation. The transcriptome is the complete set of transcripts and the amount generated, related to a specific developmental stage or physiological condition of the cell. These transcripts can be mapped using genomes as reference for investigation of gene expression. Therefore, were required procedures to mine large volumes of RNA-Seq data to extract biological knowledge. Bioinformatics tools have been developed to facilitate and streamline these analyzes, transforming data into information. Thus, some of these features were employed in the analysis of data generated by RNAseq from canine herpesvirus type 1 (1CaHV-1 - Canid alphaherpesvirus type 1) MDCK cell culture mRNA at different post-infection stages. Thereby, a double RNAseq was performed, in which both the host cell and the viral pathogen gene expression were evaluated in the course of infection. For this, was analyzed the transcriptome of the cellular activities and the processes involved in the cycle of viral infection, until the moment 32h-pi. Thus, the activities of cellular responses to viral infection, regulatory mechanisms induced by the virus, and transcription of early, early and late viral genes were identified. Among them, was verified the elevation of COX-2 gene expression induced by viral replication, unleashing the hypoxia and apoptosis mecanisms. This fact would suggest the possibility of the use of selective COX-2 inhibitors to interrupt the viral replication cycle and in the treatment of CaHV-1 infections. We also observed the paradigm break of activation of the expression of genes from the cascade infection cycle, in which the expression of late genes was verified early, and earlyimmediate and early genes remaining expression tardily. To date, it was the first work of dual RNAseq of cellular and viral gene expression analysis for CaHV-1.

Características da cinomose em cães naturalmente infectados em Belo Horizonte (2012-2014): aspectos clínico-neurológicos e sua correlação com a carga viral e apoptose encefálicas

A cinomose canina é uma das principais doenças infecciosas que resulta em altas taxas de morbidade e mortalidade em cães vacinados e não vacinados. Neste estudo, foram realizados dois experimentos com objetivo de avaliar as características da infecção pelo vírus da cinomose canina, a quantificação e correlação da carga viral e da expressão gênica de proteínas apoptóticas no sistema nervoso central e suas relações com as manifestações neurológicas em cães naturalmente infectados na região de Belo Horizonte, MG, Brasil entre 2012 a 2014. No primeiro, realizou-se um estudo clínico e epizootiológico com 90 cães naturalmente infectados pelo vírus da cinomose canina em Belo Horizonte atendidos no Hospital Veterinário da Escola de Veterinária da UFMG. Observou-se que a doença foi mais frequente em animais adultos (1-6 anos de idade) e não vacinados, não ocorrendo diferença nas categorias sexo e época do ano entre os animais infectados. Os sinais extraneurais e neurais foram variados, com predomínio de manifestações gastrentérica e respiratória e mioclonia e déficit motor, respectivamente. Os valores hematológicos de 44 cães revelaram predomínio de anemia arregenerativa e linfopenia e baixa ocorrência de corpúsculos de Sinegaglia-Lentz. Amostras do fluido cérebro-espinhal de 16 cães revelaram predomínio de proteinorraquia associada à pleocitose linfocítica. Além disso, 100% dos animais com sinais neurológicos foram positivos para o teste de imunocromatografia para pesquisa de antígenos com amostras do fluido cérebro-espinhal. O contrário ocorreu com amostras de swab conjuntival, em que apenas 67% dos animais com sinais neurológicos foram positivos, contraindicando, por isso, sua utilização nessa fase da doença. No segundo experimento realizou-se a quantificação e correlação da apoptose neural e da carga viral no lobo frontal, hipocampo e cerebelo pela PCR em tempo real de 21 cães naturalmente infectados pelo vírus e se estes relacionavam-se aos sinais neurológicos manifestados. A avaliação da expressão gênica dos fatores pró (Bax, caspase-3, caspase-8) e anti-apoptóticos (Bcl-2) demonstrou que o vírus da cinomose canina induziu a morte celular por apoptose no hipocampo, tanto pela via intrínseca como extrínseca, e no cerebelo, pela via intrínseca (p<0,05). A carga viral no cerebelo foi maior comparado ao lobo frontal e hipocampo. No entanto, não houve diferença estatística entre as cargas virais das três regiões encefálicas acometidas (p>0,05). Não houve correlação significativa entre a expressão gênica dos fatores apoptóticos e a carga viral entre as regiões encefálicas (p>0,05), sequer associação aos sinais neurológicos manifestados. Conclui-se que não existe correlação, positiva ou negativa, entre a quantidade de vírus, a expressão gênica dos fatores da apoptose no encéfalo e os sinais neurológicos de cães naturalmente infectados pelo vírus da cinomose canina.

Canine distemper is one of the most important infectious diseases in vaccinated and non vaccinated dogs with high rates of morbidity and mortality. Is this study, two experiments were performed to evaluate canine distemper virus infection characteristics, genetic apoptotic proteins expression and virus load quantification and correlation and the relation with neurological signs in Belo Horizonte, MG, Brasil, between 2012-2014. The first evaluated the epizootiological pattern of dogs naturally infected with canine distemper in the Veterinary Hospital of UFMG. It was observed that the disease is more frequent in adult (1-6 years old) and in non-vaccinated dogs, without statistic difference in sex or season of the year between infected animals. The extraneural and neural signs were varied, with a predominance of gastroenteric and respiratory manifestations and myoclonus and motor deficit, respectively. Haematological indices of 44 dogs revealed, in most cases, nonregenerative anemia, lymphopenia e low counts of Sinegaglia-Lentz corpuscles. Analysis of cerebrospinal fluid in 16 dogs showed that, in most cases, protein levels increasead associated with lymphocytic pleocytosis. The immunochromatography test with cerebrospinal fluid samples was positive in 100% in animals with neurological signs being very useful in identifying the illness. Conversely, samples of conjunctival scrapings were not as useful in infection identification because only 67% of animals with neurological sigs were positive. In the second experiment, we quantified and correlate neural apoptosis and viral load in the frontal lobe, hippocampus and cerebellum by real time PCR of 21 naturally infected dogs with canine distemper. We also evaluate the relation between this factors and neurological signs. Gene expression of anti (Bcl-2) and pró-apoptotic (Bax, caspase-3, caspase-8) factors showed that canine distemper virus induces apoptosis in the hippocampus, by the extrinsic and intrinsic pathways, and in cerebellum, by an intrinsic pathway (p<0,05). Despite the higher viral load in cerebellum, there was no statistical difference in the amount of viral load among the three brain regions (p>0,05). There was also no significant correlation between gene expression of apoptotic factors and viral load in the evaluated brain regions (p>0,05), neither possible association with neurological signs too. We concluded that there is no correlation, positive or negative between virus load, apoptosis genetic expression in the brain and neurological signs in natural distemper canine virus infection in dogs

Geração de vetor lentiviral sintético para terapia genética ex vivo

A terapia gênica consiste em introduzir uma sequência de nucleotídeos, codificante ou não-codificante, que tenha a capacidade de interferir na progressão de uma doença por ativação, inativação ou modulação da expressão de um gene alvo. Uma das rotas de transferência gênica é a ex vivo. Essa rota consiste em realizar a modificação gênica ex vivo de um tipo celular do organismo afetado, seguida do transplante celular no indivíduo para a correção do fenótipo. Dentre os vários vetores virais utilizados para transferência gênica, o sistema lentiviral é considerado um dos mais eficazes, visto que é capaz de manter altos níveis de expressão a longo prazo. Além disso, dentre os vetores virais que se integram no genoma, esse é considerado o mais seguro, tendo apresentado apenas um caso com relatado de efeito colateral sem reação adversa. Uma nova tecnologia utilizada para padronizar sistemas biológicos é a biologia sintética. Essa tecnologia pode ser utilizada como ferramenta para produzir e/ou otimizar sistemas de expressão para produção de proteínas de interesse terapêutico. O objetivo desse trabalho é gerar um vetor lentiviral sintético, para terapia gênica ex vivo, para reposição enzimática. Foram geradas quatro linhagens celulares humanas com produção transiente das proteínas terapêuticas Prot_Ctr e Prot_Mut sob controle dos promotores CMV e HeF1a. Para padronização do ensaio de transfecção, foram geradas duas linhagens celulares humanas que expressão da proteína fluorescente verde (GFP) sob controle dos mesmos promotores citados acima. Como controle negativo das linhagens produtoras da proteína terapêutica, foi gerada uma linhagem como vetor plasmidial vazio pLV_GTW_Mock. O nível de expressão do mRNA relativo às proteínas terapêuticas variou de 3.581,95 + 1.322 a 10.377,18 + 2.562 URE, não havendo diferenças significativas entre as linhagens produzidas (p > 0,05). O nível de produção da proteínas terapêuticas variou de 30,98 UI/mL a 241,1 UI/mL. A linhagem com maior produção dessa proteína foi a 293T/HeF1a_Prot_Mut, e essa diferença é significativa (p < 0,05). A partir da transfecção dos plasmídeos auxiliares e plasmídeo portador do cDNA que codifica a Prot-Mut na linhagem celular 293-T foi obtido o vetor lentiviral com título de 1,68x107 pLV/mL. Em conclusão, é possível gerar um vetor lentiviral funcional portador da Prot_Mut para utilização em terapia gênica ex vivo. Espera-se que o produto desse projeto de pesquisa gere uma patente. Para evitar a quebra de novidade, atividade inventiva e suficiência descritiva, requisitos mínimos de patenteabilidade, os resultados foram apresentados sem mencionar a doença e o gene em estudo.

Gene therapy involves introducing a nucleotide sequence, coding or non-coding that can to interfere with the progression of a disease by activating, inactivating or modulating the expression of a target gene. One of the gene transfer routes is the ex vivo. This route consists in producing a ex vivo gene modification of a cellular kind of the affected organismo, following the transplant of those cells to correct the fenotype. Among the various viral vectors used for gene transfer, the lentiviral system is considered one of the most effective, since it is able to maintain high levels of long-term expression. Between the viral vectors that integrate into the genome, the lentiviral system is considered the safest, and It has only filed a case with reported side effect without adverse reaction. A new technology used to standardize biological systems is the synthetic biology. This technology can be used as a tool to produce and/or optimize expression systems for production of proteins of therapeutic interest. The aim of this study is to generate a synthetic lentiviral vector for ex vivo gene therapy, for enzyme replacement therapy. It were generated four human cell lines with transient production of therapeutic proteins Prot_Ctr and Prot_Mut under the control of CMV and HeF1a promoters. To standardize the transfection assay were generated two human cell lines expressing green fluorescent protein (GFP) under control of the same promoters cited above. As a negative control of the producing cell lines, It was generated a human cell line with an empty plasmid vector pLV_GTW_Mock. The level of mRNA expression relative to the therapeutic proteins ranged from 3581,95 + 1322 to 10377,18 + 2562 REU, there were no significant differences among the produced cell lines ( p> 0.05 ). The production level of therapeutic proteins ranged from 30.98 IU/mL to 241.1 IU/mL. The cell line with the highest production of the therapeutic protein was 293T/HeF1a_Prot_Mut+, and this difference is significant (p < 0.05 ). From the transfection of the plasmid containing the cDNA encoding the Prot_Mut and packing plasmid It was obtained lentiviral vector with the titer 1,68x107 pLV/mL. In conclusion, it is possible to generate a functional lentiviral vector carrying the Prot_Mut for use in ex vivo gene therapy. It is expected that the product of this research project generates a patent. To avoid breaking novelty, inventive activity and descriptive sufficiency, minimum requirements for patentability, the results were presented without mentioning the disease and the gene under study.