VIABILIDADE DE BLASTOCISTOS DE Mus musculus domesticus EXPOSTOS À ALTA PRESSÃO GASOSA E SUBMETIDOS À CRIOPRESERVAÇÃO

A alta pressão gasosa (high gaseous pressure, HGP) tem sido descrita como um agente estressante capaz de induzir resposta ao estresse subletal, fornecendo proteção celular a estresses subsequentes, como a criopreservação, embora os mecanismos celulares envolvidos ainda não estejam elucidados. Este princípio foi investigado em blastocistos murinos expostos a diferentes tratamentos utilizando-se HGP, seguidos ou não de criopreservação. De um total de 427 fêmeas de Mus musculus domesticus superovuladas, 308 (72,1%) produziram 3070 blastocistos viáveis (média de 7,2 ± 11,5 blastocistos/fêmea superovulada e de 10,0 ± 12,5 blastocistos/fêmea responsiva ao tratamento superovulatório) que foram expostos a tratamentos de distintas pressões e tempos de exposição, em quatro grupos experimentais: (a) 20,7 MPa por 2 h (P20.T2); (b) 20,7 Mpa por 4 h (P20.T4); (c) 27,6 Mpa por 2 h (P27.T2); e (d) 34,5 Mpa por 2 h (P34.T2). Todos os grupos foram pareados com controles não expostos à HGP. No primeira parte do experimento, embriões foram expostos à HGP, conforme os grupos experimentais acima, e posteriormente submetidos ao cultivo in vitro por 72 h com o objetivo de verificar a influência dos protocolos de HGP sobre a taxa de eclosão. Não houve diferença nas taxas de eclosão e na morfologia entre os grupos experimentais e os controles. Já na segunda parte do experimento, os embriões foram expostos à HGP, conforme os grupos experimentais acima, e posteriormente criopreservados por curva de congelamento clássica (rápida). Após o descongelamento, os embriões foram cultivados in vitro por 72 h para a avaliação das taxas de eclosão entre os grupos. A taxa de eclosão do Grupo P34.T2 foi significativamente maior do que a dos controles criopreservados não expostos à HGP (70,2% vs. 58,6%, p < 0,05). Conclui-se que a HGP pode ser usada como agente estressor subletal sem perda da viabilidade embrionária, e que o uso da HGP de 34,5 MPa por 2 h prévio à criopreservação modificou positivamente a taxa de sobrevivência in vitro de blastocistos murinos criopreservados.

High gaseous pressure (HGP) has been reported as a sublethal stressor able to induce "sublethal stress response, providing cell protection to subsequent stress, such as cryopreservation, although the involved cellular mechanisms are little understood. This principle was investigated on murine blastocysts exposed to different HGP treatments with and without subsequent cryopreservation. A total of 308 (72.1%) out of 427 superovulated Mus musculus domesticus females produced 3,070 viable blastocysts (7.2 ± 11.5 blastocysts/superovulated mouse and 10.0 ± 12.5 blastocysts/female responsive to superovulation) that were exposed to distinct pressure intensities and exposure times, according to four experimental groups: (a) 20.7 MPa for 2 h (P20.T2); (b) 20.7 MPa for 4 h (P20.T4); (c) 27.6 MPa for 2 h (P27.T2); and (d) 34.5 MPa for 2 h (P34.T2). All groups were compared with non-exposed HGP controls. In the first part of the experiment, embryos were exposed to HGP treatments, according to the experimental groups as above, and subsequently in vitro-cultured for 72 h aiming to compare the effects of the HGP protocols on subsequent hatching rates. No differences in hatching rates and morphology were observed between experimental and control groups. In the second parto of the experiment, embryos were exposed to HGP treatments, according to the experimental groups as above, and subsequently cryopreserved by rapid (classic) freezing. After thawing, embryos were in vitro-cultured for 72 h to compare hatching rates between groups. Hatching rates in the P34.5.T2 group were significantly higher than for the cryopreserved control embryos with no HGP treatment (70.2% vs. 58.6%, p < 0.05). Therefore, we conclude that HGP can be used as a stressor without compromising subsequent in vitro embryo viability, and the use of HGP at 34.5 MPa for 2 h prior to cryopreservation improved the in vitro survival of cryopreserved murine blastocysts compared with control counterparts.

Effects of cryoprotectant and plunging temperature in liquid nitrogen on the in vitro and in vivo development of murine morulae / Efeitos do crioprotetor e da temperatura de imersão em nitrogênio líquido sobre o desenvolvimento in vivo e in vitro de mórulas de camundongos

The effects of plunging temperature in liquid nitrogen and cryoprotectant dilution methods were evaluated for compacted mouse morulae frozen in 1.5 M ethylene-glycol (E), 1.5M propylene-glycol (P) or 1.4M glycerol (G). Morulae were equilibrated for 10 minutes in cryoprotectant solution and loaded into 0.25 ml straws with cryoprotectant solution in 3 columns (groups E1, P1, G1) or cryoprotectant in the center and PBS in the lateral columns (E2, P2). Straws were cooled at 0.5ºC/min to -25 or -30ºC and plunged into liquid nitrogen. Straws were thawed in water at 22ºC for 20 seconds. Cryoprotectant was diluted in 3 steps for group G1 and in one step for groups E1 and P1 (direct transfer to PBS + 10% FCS) and E2 and P2 (shaken to mix the 3 columns before transferring to PBS+ 10% FCS). Plunging temperature had no significant effect on the proportion of morulae developed to blastocysts in vitro; this proportion was higher (p 0.0001) in E1 (69.2%) than in E2 (60.3%), G1 (51.9%) and combined for P1 and P2 (46.9%). In second experiment, the proportion of transferred morulae that developed to viable fetuses was lower (p 0.07) for E1-25 than for E1-30, G1-30, E2-25 or unfrozen (control) embryos (8.7, 20.0, 20.0, 17.4 and 19.8%, respectively). In conclusion, the ethylene glycol diluted directly in PBS (E1) exhibit the highest rate of in vitro embryos development, but based on in v

Os efeitos das temperaturas de imersão em nitrogênio líquido e dos métodos de remoção dos crioprotetores foram avaliados em mórulas de camundongos congeladas em etilenoglicol (E), propilenoglicol (P) e glicerol (G). Os embriões foram equilibrados em E (1,5M), P (1,5M) ou G (1,4M) por 10 minutos e envasados em palhetas de 0,25 ml com crioprotetor nas três colunas (E1, P1 G1) ou PBS nas colunas das extremidades (E2, P2). As palhetas foram resfriadas a 0,5ºC/minuto até -25 ou -30ºC e imersas em nitrogênio líquido. A descongelação dos embriões foi feita em água a 22ºC por 20 segundos. O crioprotetor dos embriões congelados em glicerol (Gl) foi removido em 3 etapas, dos congelados em etilenoglicol e propilenoglicol com crioprotetor nas 3 colunas (El e Pl) removido diretamente em PBS e dos congelados em etilenoglicol e propilenoglicol com PBS nas colunas das extremidades (E2, P2), após mistura das três colunas dentro da palheta, em PBS. Não houve influência da temperatura de imersão sobre o desenvolvimento embrionário in vitro, observando maior taxa (p 0,0001) para El (69,2%) que para E2 (60,3%), Gl (51,9%) e a combinação P1 e P2 (46,9%). Para o desenvolvimento in vivo, a taxa de fetos foi menor (p 0,07) para o grupo E1-25 do que para o Controle; Gl-30ºC; El-30ºC e E2-25ºC. Pode-se concluir que in vitro o melhor crioprotetor foi o etilenoglicol com remoção direta em PBS e q

Apoptose em embriões bovinos em estágio de préimplantação submetidos ao estresse térmico e ao fator de necrose tumoral-a (TNF-a) / Apoptosis in preimplantation bovine embryos caused by heat stress and Tumor necrosis factor-α (TNF-α)

Cinco experimentos foram realizados para testar a hipótese de que o estresse térmico e o fator de necrose tumoral-α (TNF-α) induzem apoptose em embriões bovinos através de um mecanismo dependente da caspase-9. O experimento 1 determinou se o inibidor de caspase-9, z-LEHD-fmk, bloqueia os efeitos apoptóticos do estresse térmico e do TNF- α. Embriões foram selecionados nos dia 4, 5 e 6 após a fertilização in vitro e incubados por 24 h 100 μM z-LEHD-fmk reconstituído em 0.5% (v/v) DMSO ou veículo (DMSO) à 1) 38.5C por 24 h (controle), 2) 41C por 15 h seguido de 38.5C por 9 h (estresse térmico), ou 3) 38.5C por 24 h com 10 ng/mL de TNF-α. A proporção de blastômeros apoptóticos foi analisada utilizando-se a técnica de TUNEL. O experimento foi repetido 4-5 vezes utilizando 172-248 embriões por dia. Nos grupos controle o estresse térmico e o TNF-α aumentaram a proporção de células TUNEL-positivas quando comparados aos embriões incubados a 38.5C for 24 h (P<0.001). Em contraste, embriões incubados com z-LEHD-fmk e submetidos ao estresse térmico e ao TNF-α não apresentaram aumento nas células TUNEL-positivas (tratamento x inibitor; P<0.05). O experimento 2 testou os efeitos de diferentes concentrações de z-LEHD-fmk nas respostas apoptóticas dos embriões ao TNF-α. Embiões 16 células foram selecionados no dia 6 e incubados na presença de z-LEHD-fmk em 0, 1 10, and 100 μM 10 ng/mL TNF-α.. Após 24 h a 38.5C, os embriões foram lavados, fixados e analisados por TUNEL. O experimento foi repetido 4 vezes (176 embriões). A adição de 10 ng/mL TNF-α aumentou a porcentagem de células TUNEL-positivas e este aumento foi bloqueado por todas as concentrações de z-LEHD-fmk (TNF-α x inibidor; P<0.05). No experimento 3, analisamos se o estresse térmico aumenta a atividade da caspase-9 e se o z-LEHD-fmk bloqueia este efeito. Embriões em estágio de mórula ou blastocisto inicial foram selecionados no dia 6 e transferidos para novas gotas contendo 100 μM z-LEHD-fmk ou DMSO veículo. Os embriões foram incubados a 38.5C por 24 h ou 41C por 15 h seguido de 38.5C por 9 h. Ao final do estresse térmico os embriões eram lavados e incubados no substrato para caspase-9 (5 μM CaspaLux 9- M1D2) a temperatura ambiente por 1 h. A atividade da caspase-9 foi determinada avaliando-se a intensidade da fluorescência. Os embriões foram classificados apresentando baixa, média e alta atividade de caspase. O experimento foi repetido 5 vezes utilizando 22-26 embriões/tratamento. O estresse térmico aumentou a porcentagem de embriões classificados como tendo média e alta atividade de caspase-9 e z-LEHD-fmk bloqueou este efeito (tratamento P<0.05; inibidor P<0.001). Para o experimento 4 foram medidos os efeitos do TNF-α na atividade da caspase-9. Embriões no dia 6 foram incubados a 38.5C por 3, 6, 9, 12, e 15 h com 10 ng/mL TNF-α ou veículo, analisando-se a atividade da caspase-9 foi como descirto anteriormente. O experimento foi repetido 8 vezes utilizando 37-39 embriões/tratamento. A proporção de embriões classificados como média e alta atividade de caspase aumentaram quando expostos ao TNF-α em todos os períodos de exposição, exceto 3 h (tratamento P<0.05; inibidor P<0.01). O experimento 5 foi realizado para analisar os efeitos do estresse térmico e TNF-α na integridade da membrana mitocondrial. Embriões no dia 3.5 foram incubados com + TNF-α a 38.5C for 24 h ou a 41C por 15 h seguido por 9 h a 38.5C. Após os tratamemtos os embriões foram lavados e incubados em 20 nM de DiOC6 a 38.5C por 20 min no escuro. A despolarização da mitocôndria foi mensurada por quantificação da fluorescência por unidade/área em cada embrião. O estresse térmico causou uma significativa perda no potencial da membrana mitocondrial (P<0.01). Entretanto, TNF-α não apresentou diminuição significativa. O experimento foi repetido 5 vezes (71-78 embriões/tratamento). Concluindo, o mecanismo de ativação da caspase-9 está envolvido na indução da apoptose pelo estresse térrmico e TNF-α

We tested the hypothesis that heat shock and tumor necrosis factor-α (TNF-α) induce apoptosis in bovine embryos through a caspase-9 dependent mechanism.Experiment 1 determined whether the caspase-9 inhibitor, z-LEHD-fmk, blocks the apoptotic effects of heat shock and TNF-α. Embryos were collected on day 4, 5, and 6 after in vitro insemination and cultured for 24 h in the presence of either 100 μM z-LEHD-fmk reconstituted in 0.5% (v/v) DMSO or vehicle (DMSO) at either 1) 38.5C for 24 h (control), 2) 41C for 15 h followed by 38.5C for 9 h (heat shock), or 3) 38.5C for 24h with 10 ng/mL murine TNF-α. The proportion of blastomeres undergoing apoptosis was determined using TUNEL labeling. The experiment was replicated 4-5 times/day using 172-248 embryos/day. In control embryos, heat shock and TNF-α increased the proportion of cells that were TUNEL-positive as compared to embryos cultured at 38.5C for 24 h (P<0.001). For embryos incubated with z-LEHD-fmk, in contrast, neither heat shock nor TNF-α caused an increase in TUNEL labeling (treatment x inhibitor; P<0.05). Experiment 2 tested effects of different concentrations of z-LEHDfmk on apoptotic responses of embryos to TNF-α. Embryos 16 cells were collected on Day 6 and cultured in the presence of different concentrations of z-LEHD-fmk (0, 1 10, and 100 μM ) 10 ng/mL TNF-α.. After 24 h at 38.5C, embryos were washed, fixed, and analyzed by TUNEL. The experiment was replicated 4 times (176 embryos). Addition of 10 ng/mL TNF-α increased the percentage of cells that were TUNELpositive and this increase was blocked by all concentrations of z-LEHD-fmk (TNF-α x inhibitor; P<0.05). For Exp. 3, we analyzed whether heat shock increases caspase-9 activity and whether z-LEHD-fmk blocks this increase. Embryos at the morula or early blastocyst stage were collected on day 6 and transferred to a new drop with 100 μM z- LEHD-fmk or DMSO vehicle. Embryos were then cultured at either 38.5C for 24 h or 41C for 15 h followed by 38.5C for 9 h. At the end of heat shock, embryos were washed and then incubated in a caspase-9 substrate (5 μM CaspaLux 9-M1D2) at room temperature for 1 h. Caspase-9 activity was then determined by evaluation of fluorescent intensity. Embryos were classified as having low, medium or high caspase activity. The experiment was replicated 5 times using 22-26 embryos/treatment. Heat shock increased the percent of embryos classified as having medium and high caspase-9 activity and z-LEHD-fmk blocked this effect (treatment P<0.05; inhibitor P<0.001). For Exp. 4, effects of TNF-α on caspase-9 activity were evaluated. Embryos at day 6 were cultured at 38.5C for 3, 6, 9, 12, and 15 h with 10 ng/mL TNF-α or vehicle and then caspase-9 activity was measured as described before. The experiment was replicated 8 times using 37-39 embryos/treatment. The proportion of embryos classified as having medium or high caspase activity was increased by TNF-α at all time points except 3 h (treatment P< 0.05; inhibitor P<0.01). Exp. 5 was performed to analyze the effects of heat shock and TNF-α on mitochondrial membrane integrity. Embryos at Day 3.5 were incubated at 38.5C for 24 h + TNF-α or were incubated at 41C for 15 h followed by 9 h at 38.5C (heat shock). After treatment, embryos were washed and incubated in 20 nM of DiOC6 at 38.5C for 20 min in the dark. Mitochondrial depolarization was measured by quantifying the fluorescence units/area of each embryo. Heat shock caused loss in mitochondria membrane potential (P< 0.01). However, TNF- α did not show a significant decrease on membrane polarization. The experiment was replicated 5 times (71-78 embryos/treatment). In conclusion, activation of caspase-9 dependent pathways is involved in the induction of apoptosis by heat shock and TNF-α