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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-8293

Resumo

Cinco experimentos foram realizados para testar a hipótese de que o estresse térmico e o fator de necrose tumoral-α (TNF-α) induzem apoptose em embriões bovinos através de um mecanismo dependente da caspase-9. O experimento 1 determinou se o inibidor de caspase-9, z-LEHD-fmk, bloqueia os efeitos apoptóticos do estresse térmico e do TNF- α. Embriões foram selecionados nos dia 4, 5 e 6 após a fertilização in vitro e incubados por 24 h 100 μM z-LEHD-fmk reconstituído em 0.5% (v/v) DMSO ou veículo (DMSO) à 1) 38.5C por 24 h (controle), 2) 41C por 15 h seguido de 38.5C por 9 h (estresse térmico), ou 3) 38.5C por 24 h com 10 ng/mL de TNF-α. A proporção de blastômeros apoptóticos foi analisada utilizando-se a técnica de TUNEL. O experimento foi repetido 4-5 vezes utilizando 172-248 embriões por dia. Nos grupos controle o estresse térmico e o TNF-α aumentaram a proporção de células TUNEL-positivas quando comparados aos embriões incubados a 38.5C for 24 h (P<0.001). Em contraste, embriões incubados com z-LEHD-fmk e submetidos ao estresse térmico e ao TNF-α não apresentaram aumento nas células TUNEL-positivas (tratamento x inibitor; P<0.05). O experimento 2 testou os efeitos de diferentes concentrações de z-LEHD-fmk nas respostas apoptóticas dos embriões ao TNF-α. Embiões 16 células foram selecionados no dia 6 e incubados na presença de z-LEHD-fmk em 0, 1 10, and 100 μM 10 ng/mL TNF-α.. Após 24 h a 38.5C, os embriões foram lavados, fixados e analisados por TUNEL. O experimento foi repetido 4 vezes (176 embriões). A adição de 10 ng/mL TNF-α aumentou a porcentagem de células TUNEL-positivas e este aumento foi bloqueado por todas as concentrações de z-LEHD-fmk (TNF-α x inibidor; P<0.05). No experimento 3, analisamos se o estresse térmico aumenta a atividade da caspase-9 e se o z-LEHD-fmk bloqueia este efeito. Embriões em estágio de mórula ou blastocisto inicial foram selecionados no dia 6 e transferidos para novas gotas contendo 100 μM z-LEHD-fmk ou DMSO veículo. Os embriões foram incubados a 38.5C por 24 h ou 41C por 15 h seguido de 38.5C por 9 h. Ao final do estresse térmico os embriões eram lavados e incubados no substrato para caspase-9 (5 μM CaspaLux 9- M1D2) a temperatura ambiente por 1 h. A atividade da caspase-9 foi determinada avaliando-se a intensidade da fluorescência. Os embriões foram classificados apresentando baixa, média e alta atividade de caspase. O experimento foi repetido 5 vezes utilizando 22-26 embriões/tratamento. O estresse térmico aumentou a porcentagem de embriões classificados como tendo média e alta atividade de caspase-9 e z-LEHD-fmk bloqueou este efeito (tratamento P<0.05; inibidor P<0.001). Para o experimento 4 foram medidos os efeitos do TNF-α na atividade da caspase-9. Embriões no dia 6 foram incubados a 38.5C por 3, 6, 9, 12, e 15 h com 10 ng/mL TNF-α ou veículo, analisando-se a atividade da caspase-9 foi como descirto anteriormente. O experimento foi repetido 8 vezes utilizando 37-39 embriões/tratamento. A proporção de embriões classificados como média e alta atividade de caspase aumentaram quando expostos ao TNF-α em todos os períodos de exposição, exceto 3 h (tratamento P<0.05; inibidor P<0.01). O experimento 5 foi realizado para analisar os efeitos do estresse térmico e TNF-α na integridade da membrana mitocondrial. Embriões no dia 3.5 foram incubados com + TNF-α a 38.5C for 24 h ou a 41C por 15 h seguido por 9 h a 38.5C. Após os tratamemtos os embriões foram lavados e incubados em 20 nM de DiOC6 a 38.5C por 20 min no escuro. A despolarização da mitocôndria foi mensurada por quantificação da fluorescência por unidade/área em cada embrião. O estresse térmico causou uma significativa perda no potencial da membrana mitocondrial (P<0.01). Entretanto, TNF-α não apresentou diminuição significativa. O experimento foi repetido 5 vezes (71-78 embriões/tratamento). Concluindo, o mecanismo de ativação da caspase-9 está envolvido na indução da apoptose pelo estresse térrmico e TNF-α

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We tested the hypothesis that heat shock and tumor necrosis factor-α (TNF-α) induce apoptosis in bovine embryos through a caspase-9 dependent mechanism.Experiment 1 determined whether the caspase-9 inhibitor, z-LEHD-fmk, blocks the apoptotic effects of heat shock and TNF-α. Embryos were collected on day 4, 5, and 6 after in vitro insemination and cultured for 24 h in the presence of either 100 μM z-LEHD-fmk reconstituted in 0.5% (v/v) DMSO or vehicle (DMSO) at either 1) 38.5C for 24 h (control), 2) 41C for 15 h followed by 38.5C for 9 h (heat shock), or 3) 38.5C for 24h with 10 ng/mL murine TNF-α. The proportion of blastomeres undergoing apoptosis was determined using TUNEL labeling. The experiment was replicated 4-5 times/day using 172-248 embryos/day. In control embryos, heat shock and TNF-α increased the proportion of cells that were TUNEL-positive as compared to embryos cultured at 38.5C for 24 h (P<0.001). For embryos incubated with z-LEHD-fmk, in contrast, neither heat shock nor TNF-α caused an increase in TUNEL labeling (treatment x inhibitor; P<0.05). Experiment 2 tested effects of different concentrations of z-LEHDfmk on apoptotic responses of embryos to TNF-α. Embryos 16 cells were collected on Day 6 and cultured in the presence of different concentrations of z-LEHD-fmk (0, 1 10, and 100 μM ) 10 ng/mL TNF-α.. After 24 h at 38.5C, embryos were washed, fixed, and analyzed by TUNEL. The experiment was replicated 4 times (176 embryos). Addition of 10 ng/mL TNF-α increased the percentage of cells that were TUNELpositive and this increase was blocked by all concentrations of z-LEHD-fmk (TNF-α x inhibitor; P<0.05). For Exp. 3, we analyzed whether heat shock increases caspase-9 activity and whether z-LEHD-fmk blocks this increase. Embryos at the morula or early blastocyst stage were collected on day 6 and transferred to a new drop with 100 μM z- LEHD-fmk or DMSO vehicle. Embryos were then cultured at either 38.5C for 24 h or 41C for 15 h followed by 38.5C for 9 h. At the end of heat shock, embryos were washed and then incubated in a caspase-9 substrate (5 μM CaspaLux 9-M1D2) at room temperature for 1 h. Caspase-9 activity was then determined by evaluation of fluorescent intensity. Embryos were classified as having low, medium or high caspase activity. The experiment was replicated 5 times using 22-26 embryos/treatment. Heat shock increased the percent of embryos classified as having medium and high caspase-9 activity and z-LEHD-fmk blocked this effect (treatment P<0.05; inhibitor P<0.001). For Exp. 4, effects of TNF-α on caspase-9 activity were evaluated. Embryos at day 6 were cultured at 38.5C for 3, 6, 9, 12, and 15 h with 10 ng/mL TNF-α or vehicle and then caspase-9 activity was measured as described before. The experiment was replicated 8 times using 37-39 embryos/treatment. The proportion of embryos classified as having medium or high caspase activity was increased by TNF-α at all time points except 3 h (treatment P< 0.05; inhibitor P<0.01). Exp. 5 was performed to analyze the effects of heat shock and TNF-α on mitochondrial membrane integrity. Embryos at Day 3.5 were incubated at 38.5C for 24 h + TNF-α or were incubated at 41C for 15 h followed by 9 h at 38.5C (heat shock). After treatment, embryos were washed and incubated in 20 nM of DiOC6 at 38.5C for 20 min in the dark. Mitochondrial depolarization was measured by quantifying the fluorescence units/area of each embryo. Heat shock caused loss in mitochondria membrane potential (P< 0.01). However, TNF- α did not show a significant decrease on membrane polarization. The experiment was replicated 5 times (71-78 embryos/treatment). In conclusion, activation of caspase-9 dependent pathways is involved in the induction of apoptosis by heat shock and TNF-α

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