Taxa de recuperação embrionária em éguas Mangalarga Marchador inseminadas com sêmen refrigerado / Embryonic recovery rate in Mangalarga Marchador mares inseminated with refrigerated semen

O acompanhamento reprodutivo da espécie equina tem sido cada vez mais aplicado na aplicade de diversos países, resultando em melhores índices reprodutivos para a espécie e em animais de linhagens selecionadas. Nos programas de transferência de embrião, a taxa de recuperação embrionária consiste em um parâmetro essencial a fim de verificar o sucesso da técnica. Por conseguinte, este trabalho propõe-se a avaliar as taxas de recuperação embrionária de éguas doadoras submetidas à inseminação artificial com sêmen refrigerado de maneira a complementar os dados relacionados ao assunto. Conforme os dados coletados durante a estação de monta de agosto de 2018 a fevereiro de 2019, obteve-se 129 lavados uterinos provenientes de 20 éguas e 83 embriões recuperados. Desse modo, a taxa de recuperação embrionária obtida foi de 64,34%. Diante dos dados apresentados neste estudo, conclui-se que a aplicabilidade da técnica de recuperação embrionária visando o uso do sêmen refrigerado na inseminação artificial de éguas se mostra promissora, pois permite o transporte de material genético de alto valor entre propriedades sem interferir drasticamente nos índices dos programas de reprodução.

The reproductive monitoring of the equine species has been increasingly applied in several countries, resulting in better reproductive rates for the species and in animals from selected strains. In embryo transfer programs, the embryo recovery rate is an essential parameter to verify the technique success. Therefore, the present work proposes to evaluate the embryo recovery rates of donor mares submitted to artificial insemination with refrigerated semen to complement the data related to the subject. According to the data collected during the breeding season for the period from August 2018 to February 2019, 129 uterine washes were obtained from 20 mares and 83 recovered embryos. Thus, the embryonic recovery rate obtained was 64.34%. Given the data presented in this study, it is concluded that the applicability of the embryonic recovery technique aiming at the use of refrigerated semen in artificial insemination of mares is promising, as it allows the transport of high-value genetic material between properties without interfering dramatically in breeding program indexes.

Uso de quercetina em meio de refrigeração de sêmen equino a base de leite em pó desnatado / Use of quercetin in equine semen cooling medium based on skimded milk poder

A biotécnica de refrigeração de sêmen equino para o trasporte de material genético está amplamente distribuida. Com a necessidade da manutenção da viabilidade espermática é indispensável a autilização e diluentes para este fim. O objetivo deste estudo foi avaliar se a adição de quercetina, que é um flavonóide antioxidante, em diluentes espermáticos altera a viabilidade dos espermatozoides equinos refrigerados. Foram avaliados cinco ejaculados de um garanhão, por meio da análise de motilidade e vigor espermático, em diferentes períodos de refrigeração em quatro meios de diluição: BotuSêmen®; BotuSêmen® adicionado de 20 µg/mL de quercetina (SIGMA®); Solução aquosa com 10% leite em pó desnatado (Molico®) ou Solução aquosa com 10% leite em pó desnatado (Molico®) adicionado de 20 µg/mL de quercetina (SIGMA®). Por meio dos resultados obtidos no presente estudo, foi possível verificar que não há diferença estatística entre a motilidade espermática de sêmen de garanhão diluído em BotuSêmen® em relação ao diluído solução aquosa com 10% leite em pó desnatado (Molico®) pelo período de refrigeração avaliado (36h).

The biotechnique of equine semen cooling for the transfer of genetic material is widely distributed. With the need to maintain sperm viability, it is indispensable to use and thinners for this purpose. The aim of this study was to evaluate whether the addition of quercetin, which is an anti-oxidant flavonoid, in spermatic diluents alters the viability of refrigerated equine spermatozoa. Five ejaculates of a stallion were evaluated by analysis of motility and spermatic vigor in different cooling periods in four dilution media: BotuSêmen® ; BotuSêmen® added 20 µg/mL of quercetin (SIGMA® ); Aqueous solution with 10% skimmilk powder (Molico® ) or Aqueous solution with 10% skimmilk powder (Molico® ) added 20 µg/mL quercetin (SIGMA® ). Through the data obtained, it was possible to verify that there is no statistical difference between the sperm motility of diluted stallion semen in BotuSêmen® in relation to the diluted aqueous solution with 10% skimmed milk powder (Molico® ) for the evaluated refrigeration period (36h).

Uso de quercetina em meio de refrigeração de sêmen equino a base de leite em pó desnatado / Use of quercetin in equine semen cooling medium based on skimded milk poder

A biotécnica de refrigeração de sêmen equino para o trasporte de material genético está amplamente distribuida. Com a necessidade da manutenção da viabilidade espermática é indispensável a autilização e diluentes para este fim. O objetivo deste estudo foi avaliar se a adição de quercetina, que é um flavonóide antioxidante, em diluentes espermáticos altera a viabilidade dos espermatozoides equinos refrigerados. Foram avaliados cinco ejaculados de um garanhão, por meio da análise de motilidade e vigor espermático, em diferentes períodos de refrigeração em quatro meios de diluição: BotuSêmen®; BotuSêmen® adicionado de 20 µg/mL de quercetina (SIGMA®); Solução aquosa com 10% leite em pó desnatado (Molico®) ou Solução aquosa com 10% leite em pó desnatado (Molico®) adicionado de 20 µg/mL de quercetina (SIGMA®). Por meio dos resultados obtidos no presente estudo, foi possível verificar que não há diferença estatística entre a motilidade espermática de sêmen de garanhão diluído em BotuSêmen® em relação ao diluído solução aquosa com 10% leite em pó desnatado (Molico®) pelo período de refrigeração avaliado (36h).(AU)

The biotechnique of equine semen cooling for the transfer of genetic material is widely distributed. With the need to maintain sperm viability, it is indispensable to use and thinners for this purpose. The aim of this study was to evaluate whether the addition of quercetin, which is an anti-oxidant flavonoid, in spermatic diluents alters the viability of refrigerated equine spermatozoa. Five ejaculates of a stallion were evaluated by analysis of motility and spermatic vigor in different cooling periods in four dilution media: BotuSêmen® ; BotuSêmen® added 20 µg/mL of quercetin (SIGMA® ); Aqueous solution with 10% skimmilk powder (Molico® ) or Aqueous solution with 10% skimmilk powder (Molico® ) added 20 µg/mL quercetin (SIGMA® ). Through the data obtained, it was possible to verify that there is no statistical difference between the sperm motility of diluted stallion semen in BotuSêmen® in relation to the diluted aqueous solution with 10% skimmed milk powder (Molico® ) for the evaluated refrigeration period (36h).(AU)

Freezing goat embryos at different developmental stages and quality using ethylene glycol and a slow cooling rate / Congelação de embriões caprinos em diferentes estádios de desenvolvimento e qualidade utilizando etileno glicol e taxa de resfriamento lenta

The efficiency of an alternative freezing protocol for goat embryos of different morphology and quality was tested. Fifty-eight embryos on Day 6-7 stage were transferred as fresh or after freeze-thawing (n=29/group). For freezing, embryos were placed into 1.5M ethylene-glycol solution for 10min. During this time, they were loaded in the central part of 0.25mL straw, separated by air bubble from columns containing PBS/BSA 0.4% plus 20% BFS. Straws were then frozen using a freezing machine from 20ºC to -6ºC at a cooling rate of 3ºC/min, stabilization for 15min (seeding after 5min), from -6 C to -32ºC at 0.6 C/min,and plunged into liquid nitrogen. Frozen embryos were thawed for 30s at 37ºC in a water bath. Embryos subjected to fresh transfer were maintained in holding medium (37ºC). Fresh and frozen-thawed embryos were transferred at day 7 post-estrus to 30 recipients. Kidding and kid born rates were similar (P> 0.05), respectively, for recipients receiving fresh (66.7% or 10/15; 55.2% or 16/29) or frozen-thawed (60% or 9/15; 51.7% or 15/29) embryos. The cryopreservation of goat embryos using slow-freezing protocol and 1.5MEG resulted in similar efficiency rates of fresh embryos.(AU)

Este estudo testou a eficiência de protocolo alternativo de criopreservação de embriões caprinos de diferentes qualidades morfológicas. Foram utilizados 58 embriões, coletados entre o sexto e o sétimo dia do ciclo estral (n=29/grupo). Embriões congelados passaram por solução 1,5M etilenoglicol por 10min e foram aspirados durante esse tempo para parte central de palheta 0,25mL, separada por bolhas de ar de colunas contendo PBS 0,4% BSA e 20% SFB. As palhetas foram congeladas em máquina de congelação de 20ºC a -6ºC, com taxa de resfriamento de 3ºC/min, estabilização por 15min (seeding após 5min), -6ºC a -32ºC a 0,6ºC/min, e imersas em nitrogênio líquido. Os embriões foram descongelados por 30s a 37ºC, em água. Embriões frescos foram mantidos em solução de manutenção (37ºC). Embriões frescos e congelados/descongelados foram transferidos para 30 receptoras no sétimo dia do ciclo estral. A taxa de partos e a de crias nascidas (respectivamente) foram similares (P>0,05) para receptoras recebendo embriões frescos (66,7% ou 10/15; 55,2% ou 16/29) ou congelados/descongelados (60,0% ou 9/15; 51,7% ou 15/29). O protocolo de criopreservação de embriões utilizado no presente estudo resultou em índices de eficiência semelhantes aos de embriões frescos.(AU)

Freezing goat embryos at different developmental stages and quality using ethylene glycol and a slow cooling rate / Congelação de embriões caprinos em diferentes estádios de desenvolvimento e qualidade utilizando etileno glicol e taxa de resfriamento lenta

The efficiency of an alternative freezing protocol for goat embryos of different morphology and quality was tested. Fifty-eight embryos on Day 6-7 stage were transferred as fresh or after freeze-thawing (n=29/group). For freezing, embryos were placed into 1.5M ethylene-glycol solution for 10min. During this time, they were loaded in the central part of 0.25mL straw, separated by air bubble from columns containing PBS/BSA 0.4% plus 20% BFS. Straws were then frozen using a freezing machine from 20ºC to -6ºC at a cooling rate of 3ºC/min, stabilization for 15min (seeding after 5min), from -6 C to -32ºC at 0.6 C/min,and plunged into liquid nitrogen. Frozen embryos were thawed for 30s at 37ºC in a water bath. Embryos subjected to fresh transfer were maintained in holding medium (37ºC). Fresh and frozen-thawed embryos were transferred at day 7 post-estrus to 30 recipients. Kidding and kid born rates were similar (P> 0.05), respectively, for recipients receiving fresh (66.7% or 10/15; 55.2% or 16/29) or frozen-thawed (60% or 9/15; 51.7% or 15/29) embryos. The cryopreservation of goat embryos using slow-freezing protocol and 1.5MEG resulted in similar efficiency rates of fresh embryos.(AU)

Este estudo testou a eficiência de protocolo alternativo de criopreservação de embriões caprinos de diferentes qualidades morfológicas. Foram utilizados 58 embriões, coletados entre o sexto e o sétimo dia do ciclo estral (n=29/grupo). Embriões congelados passaram por solução 1,5M etilenoglicol por 10min e foram aspirados durante esse tempo para parte central de palheta 0,25mL, separada por bolhas de ar de colunas contendo PBS 0,4% BSA e 20% SFB. As palhetas foram congeladas em máquina de congelação de 20ºC a -6ºC, com taxa de resfriamento de 3ºC/min, estabilização por 15min (seeding após 5min), -6ºC a -32ºC a 0,6ºC/min, e imersas em nitrogênio líquido. Os embriões foram descongelados por 30s a 37ºC, em água. Embriões frescos foram mantidos em solução de manutenção (37ºC). Embriões frescos e congelados/descongelados foram transferidos para 30 receptoras no sétimo dia do ciclo estral. A taxa de partos e a de crias nascidas (respectivamente) foram similares (P>0,05) para receptoras recebendo embriões frescos (66,7% ou 10/15; 55,2% ou 16/29) ou congelados/descongelados (60,0% ou 9/15; 51,7% ou 15/29). O protocolo de criopreservação de embriões utilizado no presente estudo resultou em índices de eficiência semelhantes aos de embriões frescos.(AU)

TRANSFERÊNCIA DE GENOMA EM OVÓCITOS BOVINOS FRESCOS E VITRIFICADOS: PRODUÇÃO DE EMBRIÕES.

A transferência de genoma (TG), o qual permite substituir um citoplasma danificado por um integro, pode ser uma alternativa para melhorar a eficiência da criopreservação de ovócitos bovinos. Neste trabalho objetivou-se estabelecer a técnica de TG utilizando a placa metafásica (PM) e corpúsculo polar (CP) de ovócitos bovinos como fontes do material genético. Para isso foram realizados quatro experimentos. No primeiro foi estabelecida a TG utilizando a PM (TG-PM) avaliando a concentração espermática a ser utilizada, a taxa de fecundação, a de polispermia e a de embriões. Na avaliação da concentração espermática, a taxa de fecundação foi maior (P<0,05) no grupo controle (76,1%) do que no TG-PM fecundados com 1x106 sptz/ml (46,9%) e com 0,5x106 sptz/ml (46%), que não diferiram entre si. Com relação à produção de embriões o grupo TG-PM apresentou taxas de clivagem (50%) e blastocisto (13,6%) inferiores ao grupo controle (80,2% e 32,6%,). No segundo experimento foram avaliados os mesmos parâmetros do primeiro, porém com estruturas submetidas à transferência de corpúsculo polar (TG-CP). Os resultados mostraram que o grupo TG-CP apresentou taxa de fecundação (82,3% x 96,2%) e de blastocisto (7,7% x 36,8%) inferiores, mas a taxa de clivagem (88,5% x 85,3%) semelhante ao grupo controle. No terceiro experimento foi avaliado o efeito da TG-PM e TG-CPna quantidade e distribuição de Grânulos Corticais (GC), Mitocôndrias (MT) e numero de cópias de DNA mitocondrial (mtDNA). A quantificação do GC foi semelhante (p> 0,05) entre as estruturas reconstruídas GT-PM (n = 22) e GT-CP (n = 20). No entanto, ambos os grupos apresentaram menos GC (p <0,05) que os grupos controle (n = 22) e enucleados (n = 20). Para distribuição do GC, o grupo GT-PM apresentou menos estruturas com distribuição periférica, diferente dos grupos controle e enucleado (p<0,05), mas não apresentou diferença significativa em relação ao grupo GT-CP (p> 0,05). Não foi observado diferença entre os grupos quanto a quantidade e distribuição de MT e quantidade de mtDNA. No quarto experimento foi realizada a TG-PM utilizando ovócitos vitrificados (TG-PMV) como fonte de material genético. Para isso, forma utilizados 3 grupos, TG-PMV, controle vitrificado (VIT) e controle PIVE. A taxa de clivagem do grupo TG-PMV (70,34%) foi semelhante ao grupo controle PIVE e superior (p<0,05) ao grupo controle VIT (60%). Já a taxa de blastocisto não se diferiu do grupo controle VIT (9,1% e 5%) porem foram menores que o grupo controle PIVE (33%). Os resultados obtidos sugerem que as estruturas reconstruídas pela técnica de TG-PM e TG-CP são capazes de se desenvolver em embrião, e podem ser fecundados usando o mesmo protocolo utilizado na PIVE, sem aumento na taxa de polispermia. Além disso, os resultados mostraram que é possível produzir embriões por TG a partir de ovócitos vitrificados, possibilitando o uso de material genético armazenado em banco de germoplasma.

A genome transfer (GT), which allows replacing this damaged cytoplasm with an integer, is presented as an alternative for the use of these structures in PIVE. Therefore, this work aims to define the GT technique using the metaphasic plate (MP) and the polar body (PB) of bovine oocytes as sources of genetic material. For this, four experiments were carried out. In the first experiment, GT was established using MP (GT-MP). In the evaluation of sperm concentration, the fertilization rate in the control group (76.1%) was higher (p <0.05) than that of GT-MP fertilized with 1x106 sptz/ml (46.9%) and GT-MP fertilized with 0.5x106 sptz/ml (46%), which did not differ between them. However, the rate of polyspermia was similar (p> 0.05) between groups. Regarding the production of embryos, the GT-MP group showed cleavage rates (50%) and blastocyst (13.6%) lower than the PIVE control group (80.2% and 32.6%, respectively). In the second experiment, the same parameters as the first were evaluated, but with structures submitted to polar body transfer (GT-PB). The results showed that the GT-PB group had a lower fertilization rate (82.3% x 96.2%) and a blastocyst (7.7% x 36.8%), but the cleavage rate (88.5% x 85.3%) similar to the control group. In the third experiment, the effect of micromanipulation on the amount and distribution of Cortical Granules (CG), Mitochondria (MT) and number of copies of mitochondrial DNA (mtDNA) was evaluated. CG quantification was similar (p> 0.05) between the reconstructed structures GT-MP (n = 22) and GT-PB (n = 20). However, both groups had less CG (p<0.05) than the control (n = 22) and enucleated (n = 20) groups. For CG distribution, the GT-MP group had fewer structures with peripheral distribution, different from the control and enucleated groups (p<0.05), but there was no significant difference in relation to the GT-PB group (p> 0.05). The GT-PB was the only group that did not differ from the others (p> 0.05). There was no difference between groups regarding the amount and distribution of MT and the amount of mtDNA. In the fourth experiment, GT-MP was performed using vitrified oocytes (GT-VMP) as a source of genetic material. The cleavage rate of the TG-PMV group (70.34%) was similar to the IVP control group and higher (p<0.05) than the control VIT group (60%). The blastocyst rate did not differ from the control VIT group (9,1% and 5%) but were lower than the control group PIVE (33%). The results obtained so far suggest that the structures reconstructed by the TG-PM and TG-CP technique are capable of developing in embryo, and can be fertilized using the same protocol used in IVEP, without increasing the rate of polyspermia. In addition, the results showed that it is possible to produce embryos by TG from vitrified oocytes, enabling the use of genetic material stored in a germplasm bank.

TRANSFERÊNCIA GÊNICA DE FIBROBLASTOS, OÓCITOS E EMBRIÕES SUÍNOS MEDIADA POR POLIETILENOIMINA

SOUZA, A. P. Transferência gênica de fibroblastos, oócitos e embriões suínos mediada por polietilenoimina. 2019. 87p. Tese (Doutorado em Ciência Animal. Área: Produção Animal) Universidade do Estado de Santa Catarina. Programa de Pós-graduação em Ciência Animal, Lages, 2019. Diferentes metodologias são utilizadas para produzir suínos transgênicos, entre elas estão microinjeção pronuclear, transferência gênica mediada por espermatozoide, microinjeção de vetores retrovirais em oócitos, transferência nuclear de células somáticas previamente modificadas. Todos esses métodos foram capazes de produzir com sucesso suínos transgênicos. Porém, ainda apresentam limitações, como a baixa integração do transgene e baixo percentual de animais produzidos, ainda, algumas são caras e laboriosas. Assim, torna-se relevante o desenvolvimento de métodos e padronizações que aumentem a eficiência e melhorem a relação custo-benefício da produção de suínos geneticamente modificados. A Polietilenoimina (PEI) é um polímero catiônico, que condensa o DNA em partículas carregadas positivamente, formando complexos que se ligam aos resíduos de superfície aniônicos e são levados para dentro da célula por endocitose. Tem-se descrito o uso da PEI como um bom agente transfectante numa ampla gama de tipos celulares, apesar disso, até o momento não há um protocolo desenvolvido para este polímero visando a transfecção de células na espécie suína. Diante disto, o objetivo do presente trabalho desenvolver protocolos de transfecção celular eficiente para fibroblastos fetais, oócitos e embriões suínos. Para isso, o presente trabalho foi realizado em duas etapas. A etapa I consistiu no desenvolvimento de um protocolo para de transfecção gênica para fibroblastos fetais suínos (FFS). Para isso foram conduzidos 3 experimentos. No experimento 1 foi avaliada a capacidade da PEI de ser internalizada em diferentes concentrações (0,625; 1,25; 2,5; 5; 10; 20; 40 e 80g/mL) por incubação em diferentes períodos (0,5, 1 e 2 horas). O experimento 2 foi realizado para determinar a melhor razão polímero/eDNA, sendo o grau de complexação avaliado por eletroforese em gel de agarose. No experimento 3, a transfecção foi realizada baseada nos resultados dos experimentos anteriores. Para a transfecção, foram utilizadas as concentrações 10 e 40g/mL, a razão N/P igual a 2, por um período de incubação de 0,5h. Não foi verificada diferença entre as concentrações de PEI utilizadas na porcentagem de células positivas para GFP, no entanto, a concentração de 40g/mL causou maiores danos as células transfectadas. Além disso, a GFP foi expressa por um período de 3 dias, o que sugere que o plasmídeo atingiu o núcleo dos fibroblastos, tendo o gene sido expresso de forma não transiente. A etapa II, consistiu no desenvolvimento de um protocolo para de transfecção gênica para oócitos e embriões suínos. Nesta etapa foram conduzidos 2 experimentos. No experimento 1 foi avaliada a capacidade da PEI de ser internalizada em diferentes concentrações (10; 20; 40 e 80g/mL). No experimento 2, baseado nos resultados do experimento 1, as transfecções foram realizadas utilizando as concentrações 20 e 80g/mL, a razão de PEI/ eDNA igual a 2, por 0,5h de incubação. Nesta etapa foi demostrado que a PEI, diferente de outros agentes transfectantes, tem a capacidade de passar a zona pelúcida, sendo o protocolo desenvolvido foi capaz de produzir blastocistos transgênicos para GFP, tanto de oócitos e embriões transfectados. Os resultados apresentados neste trabalho mostram que através da transfecção gênica mediada pela polietilenoimina foi possível gerar fibroblastos e blastocistos suínos transgênicos para proteína verde fluorescente de forma eficiente.

SOUZA, A. P. Polyethyleneimine-mediated gene transfer in swine fibroblast, oocyte and embryos. 2019. 87p. Doctoral Thesis in Animal Science. Area of concentration: Animal Production Santa Catarina State University. Animal Science Postgraduate Program, Lages, 2018. Different methodologies are used to produce transgenic pigs, among them are pronuclear microinjection, sperm-mediated gene transfer, microinjection of retroviral vectors into oocytes, and nuclear transfer of previously modified somatic cells. These methods are able to successfully produce transgenic pigs. However, limitations such as low transgene integration and low percentage of animals produced, furthermore some are expensive and laborious. The development of methods and standards increases the efficiency and improve the cost-benefit ratio of genetically modified pig production becomes relevant. Polyethyleneimine (PEI) is a cationic polymer which condenses the DNA into positively charged particles forming complexes that bind to the anionic surface residues and are carried into the cell by endocytosis. The use of PEI as a transfectant agent in a wide range of cell types has been described, however, so far has not been yet a protocol developed for this polymer to transfect of cells into the swine species. In view of this, the objective of the present work was to develop efficient cellular transfection protocols for fetal fibroblasts, oocytes and swine embryos. The present work was carried out in two stages. Stage I consisted of the development of a protocol for gene transfection for swine fetal fibroblasts (FFS). Therefore, 3 experiments were conducted. In the experiment 1, the capacity of the PEI to be internalized at different concentrations (0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40 and 80g / mL) by incubation at different periods (0.5, 1 and 2 hours). Experiment 2 was performed to determine the best polymer / eDNA ratio, and the degree of complexation was evaluated by agarose gel electrophoresis. In experiment 3, transfection was performed based on the results of the above experiments. For transfection, the concentrations 10 and 40 g / mL were used, the N / P ratio was 2, for an incubation period of 30 minutes. No difference was found between the concentrations of PEI used in the percentage of GFP positive cells, however, the concentration of 40 g / ml caused greater damage to the transfected cells. In addition that, GFP was expressed for a period of 3 days, suggesting that the plasmid reached the fibroblast nucleus, and the gene was expressed non-transiently. Stage II consisted of the development of a protocol for gene transfection for oocytes and swine embryos. In this stage 2 experiments were conducted. In the experiment 1, the capacity of the PEI to be internalized in different concentrations (10; 20; 40 and 80g/mL) was evaluated. In experiment 2, based on the results of experiment 1, transfections were performed using concentrations of 20 and 80g / mL, the PEI / eDNA ratio was 2, for 0,5 hours of incubation. In this step it was demonstrated that PEI, unlike other transfecting agents, has the ability to pass the zona pellucid, and the protocol developed was able to produce transgenic blastocysts for GFP, both oocytes and transfected embryos. The results presented in this work show that through polyethyleneimine-mediated gene transfection it was possible to generate transgenic fibroblasts and swine blastocysts to efficiently express fluorescent green protein.

Produção in vitro de embriões de doadoras pré-púberes da raça Holandesa

A produção in vitro de embriões em vacas Holandesas de alta produção (Bos taurus) ainda apresenta baixa eficiência quando comparada à de fêmeas Bos indicus. Nesse contexto, a utilização de novilhas de 8-10 meses de idade como doadoras de oócitos pode ser uma alternativa para melhorar a eficiência dessa biotecnologia e acelerar o ganho genético pela redução do intervalo de gerações dos rebanhos. Entretanto, as informações acerca da produção in vitro de embriões originados de doadoras pré-púberes são controversas na literatura. Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar a aspiração folicular, seguida da produção in vitro (PIVE) de embriões de doadoras pré-púberes da raça Holandesa e posteriormente, a taxa de concepção após a transferência dos embriões. Um total de 120 doadoras de quatro categorias animais: novilhas pré-púberes (PP, n = 30), novilhas púberes (PU, n = 30), vacas lactantes (VL, n = 30) e vacas não lactantes (VNL, n = 30) foi submetido à aspiração folicular (OPU), sem sincronização prévia da onda de crescimento folicular. Realizaram-se seis sessões de OPU com cinco animais de cada categoria, ou seja, vinte doadoras por sessão. Imediatamente antes da OPU, os folículos ovarianos foram quantificados e classificados de acordo com o diâmetro [folículos pequenos (FP = < 6 mm), folículos médios (FM = 6 a 10 mm) e folículos grandes (FG = > 10 mm)]. Posteriormente, todos os folículos 2 mm foram puncionados e o total de estruturas recuperadas, quantidade e qualidade de oócitos viáveis foram registrados. Os oócitos viáveis foram submetidos à produção in vitro e o desenvolvimento embrionário (taxa de clivagem e de blastocisto) foi avaliado. Sêmen sexado do mesmo touro e partida foi utilizado para fertilização dos oócitos de todas as categorias de doadoras. Os embriões produzidos (n = 206) foram transferidos em receptoras cruzadas (Bos taurus x Bos indicus) de corte. Número de folículos no dia da OPU, proporção de folículos conforme o diâmetro, número de oócitos totais e viáveis recuperados, taxa de recuperação, taxa de clivagem, número de embriões produzidos por OPU e taxa de blastocisto foram variáveis analisadas pelo procedimento GLIMMIX do SAS® e a taxa de concepção pelo teste exato de Fisher. Não foi observada diferença entre os grupos experimentais quanto ao número total de folículos aspirados (PP: 18,3 ± 2,1; PU: 17,3 ± 1,2; VL: 14,0 ± 1,0; VNL: 17,7 ± 1,7; P = 0,08). Entretanto, verificou-se que as doadoras PP apresentaram maior proporção de folículos pequenos (PP: 58,4% a; PU: 45,7% b; VL: 41,7% b; VNL: 50,6% b; P < 0,0001) quando comparado às demais categorias. Apesar do semelhante número de oócitos totais recuperados (PP: 14,2 ± 2,2; PU: 13,1 ± 1,1; VL: 9,8 ± 1,1; VNL: 14,6 ± 1,7; P = 0,12), PP apresentaram quantidades intermediárias de oócitos viáveis (PP: 10,5 ± 1,8 ab; PU: 8,3 ± 0,8 ab), sendo que VNL obtiveram maior número de oócitos viáveis (11,5 ± 1,4 a; P = 0,03) quando comparadas às VL (6,5 ± 0,9 b). Ainda, doadoras PP apresentaram menor taxa de clivagem (PP: 68,6% b; PU: 98,8% a; VL: 87,6% a; VNL: 90,1% a; P < 0,0001), menor número de embriões produzidos por sessão de OPU (PP: 0,5 ± 0,2 b; PU: 1,1 ± 0,2 b; VL: 1,2 ± 0,4 b; VNL: 4,2 ± 0,6 a; P < 0,0001) e menor taxa de blastocisto (PP: 4,8% c; PU: 12,7% b; VL: 18,0% b; VNL: 36,5% a; P < 0,0001) quando comparada às demais categorias. Por fim, observou-se diferença na taxa de concepção após transferência de embriões oriundos de doadoras novilhas e vacas [PP: 0,0% (0/15) b; PU: 9,7% (3/28) b; VL: 28,6% (10/25) a; VNL: 32,7% (36/74) a; P < 0,05]. Dessa forma, conclui-se que doadoras pré-púberes da raça Holandesa apresentam baixa competência para produção in vitro de embriões, sendo vacas não lactantes a categoria mais eficiente para programas de PIVE. Ainda, embriões de novilhas pré-púberes apresentam taxas de concepção inferiores a de embriões de vacas lactantes e não lactantes. Entretanto, taxas de concepção semelhantes foram verificadas entre embriões de novilhas pré-púbere e púberes.

The in vitro embryo production of high productive dairy cows (Bos taurus) presents low efficiency in comparison to Bos indicus females. In this context, the use of heifers of 8-10 months age as oocyte donors could be an alternative in order to improve results of this biotechnology and accelerate the genetic gain by the reduction of the interval between generations. However, informations about the in vitro production of embryos coming from prepubertal donors are controversial at literacture. Thus, the objective of the present study was to evaluate the in vivo ovum pick-up (OPU), followed by in vitro embryo production of prepubertal Holstein donors and the conception rate after embryo transfer. The study was performed at Santa Rita farm, with a completely randomized experimental design, performed in six consecutive replicates with distinct animals. A total of 120 donors of four animal categories: prepubertal heifers (PP, n = 30), pubertal heifers (PU, n = 30), lactating cows (LC, n = 30) and non-lactating cows (NLC, n = 30) were submitted to OPU without previous synchronization of follicular wave. Six OPU sessions ware performed with five animals of each category i.e., 20 donors per session. Immediately before the OPU, all follicles were quantified and classified according to their diameter [small (SF 6 mm), medium (MF = 6 to 10 mm) and large (LF 10 mm) follicles]. Subsequently, all visible follicles ( 2 mm) were punctured and the total recovered structures, quantity and quality of viable oocytes were registered. All viable oocytes were submitted to the in vitro embryo production and their development (cleavage and blastocyst rate) was evaluated. Sex-sorted sperm from the same bull and semen batch were used for the oocytes fertilization of all donor categories. The embryos produced (n = 206) were transferred in crossbred recipients (Bos taurus x Bos indicus). Number of follicles at OPU day, proportion of follicles according to its diameter, number of total and viable oocytes, recovery rate, clivage rate, number of embryos produced per OPU and blastocyst rate were the variables analyzed by the GLIMMIX procedure of SAS® and conception rate by the Fishers exact test. No difference was observed between the experimental groups, regarding the total number of aspirated follicles (PP: 18.3 ± 2.1; PU: 17.3 ± 1.2; LC: 14.0 ± 1.0; NLC: 17.7 ± 1.7; P = 0.08). However, PP donors presented higher proportion of small follicles (PP: 58.4% a; PU: 45.7% b; LC: 41.7% b; NLC: 50.6% b; P < 0.0001) in comparison to other categories. Despite the similar number of total recovered oocytes (PP: 14.2 ± 2.2; PU: 13.1 ± 1.1; LC: 9.8 ± 1.1; NLC: 14.6 ± 1.7; P = 0.12), PP presented intermediate quantity of viable oocytes (PP: 10.5 ± 1.8 ab; PU: 8.3 ± 0.8 ab) and NLC produced more viable oocytes (11.5 ± 1.4 a; P = 0.03) in comparison to LC (6.5 ± 0.9 b). Still, PP donors presented lower clivage rate (PP: 68.6% b; PU: 98.8% a; LC: 87.6 a; NLC: 90.1 a; P < 0.0001), fewer embryos produced per OPU session (PP: 0.5 ± 0.2 b; PU: 1.1 ± 0.2 b; LC: 1.2 ± 0,4 b; NLC: 4.2 ± 0.6 a; P < 0.0001) and lower blastocyst rate (PP: 4.8% c; PU: 12.7% b; LC: 18.0% b; NLC: 36.5% a; P < 0.0001) in comparison to other categories. Lastly, it was observed a different conception rate among heifers and adult cows [PP: 0.0% (0/15) b; PU: 9.7% (3/28) b; LC: 28.6% (10/25) a; NLC: 32.7% (36/74) a; P < 0.05]. Thus, it is concluded that prepubertal Holstein donors present low competence for in vitro embryo production, being non-lactating cows the most efficient category for IVEP. Yet, PP embryos resulted in inferior conception rate in comparison to LC and NLC embryos. However, similar conception rate was verified between PP and PU embryos.

Efeito da adição de antioxidantes enzimáticos na criopreservação do sêmen caprino / Effect of enzymatic antioxidants on goat cryopreserved semen

A caprinocultura no Brasil vem crescendo consideravelmente nos últimos anos. No entanto, este crescimento é limitado pela qualidade espermática pós-descongelamento, o que inviabilizaria a utilização de biotecnologias aplicadas à reprodução (e.g., inseminação artificial e transferência de embriões). Um dos motivos para a queda na qualidade espermática pós-descongelação é o ataque das espécies reativas de oxigênio (ROS), que podem levar a danos em membrana, acrossomo, mitocôndria e DNA. Uma alternativa para a melhora na qualidade espermática de amostras criopreservadas de caprinos seria o tratamento do meio diluidor com a antioxidantes. No entanto, é fundamental identificar a espécie reativa de oxigênio mais deletéria ao sêmen de caprinos para determinar o antioxidante ideal. O objetivo do presente estudo foi identificar a ROS mais deletéria ao sêmen de caprinos e, com isso, tratar o diluidor com antioxidantes específicos para a destruição da mesma. No experimento 1, amostras espermáticas de 12 bodes foram submetidas á incubação com 3 sistemas de produção de ROS e um subproduto da peroxidação de lipídeos, conhecida por também levar a danos oxidativos. As amostras espermáticas foram submetidas a incubação com xantina (20mM) e xantina oxidase (ânion superóxido), sulfato de ferro (4mM) e ascorbato (20mM- Radical hidroxila), peróxido de hidrogênio (H2O2; 20 mM) e malondialdeído (20 mM). Após a incubação as amostras espermáticas foram avaliadas quanto a morfologia, motilidade, membrana (eosina/nigrosina), acrossomo (Rosa Bengala/ Fast Green), mitocôndria (3,3 diaminobenzidina) e substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS, avalia a susceptibilidade do espermatozóide ao estresse oxidativo). Os resultados do experimento 1 indicaram que a ROS mais deletéria ao espermatozóide caprino é o H2O2, que levou a danos de membrana plasmática e mitocôndria. Assim, no Experimento 2, o diluidor para a criopreservação do sêmen caprino foi suplementado com catalase e Glutationa Peroxidase (GPx), antioxidantes enzimáticos responsáveis pela destruição do H2O2. A análise estatística dos dois experimentos foi realizada através do SAS system for Windows. Os resultados do experimento 2 não revelaram efeitos benéficos para nenhuma das variáveis e com a utilização de ambos os antioxidantes. De fato, a catalase apreesntou efeitos deletérios à membrana plasmática das amostras criopreservadas com 240 UI/mL de catalase quando comparadas ao controle (13,42±2,96% e 25,08±4,80% de espermatozóides com membrana íntegra, respectivamente). De fato, estudos anteriores indicam que as concentrações de catalase em sêmen de caprinos são extremamente baixas, o que indicaria que o tratamento com as dosagens utilizadas de catalase pode ter sido excessivo. Além disto, diferentes antioxidantes aparentemente atuam em diferentes regiões do espermatozóide, sendo que, apenas a combinação de diferentes antioxidante poderia ser eficiente. Por outro lado, os resultados do Experimento 1 foram obtidos em amostras frescas, sendo que provavelmente, em amostras criopreservadas, a espécie reativa mais deletéria poderia ser outra

The goat production in Brazil has grown considerably in recent years. However, this growth is limited by the post-thaw sperm quality, which would impais the use of biotechnologies applied to reproduction (e.g., artificial insemination and embryo transfer). One reason for the decline in sperm quality after thawing is the attack of reactive oxygen species (ROS), which can lead to damage of membrane, acrosome, mitochondria and DNA. An alternative to improve the quality of cryoprerved goat sperm samples would be the treatment of the extender with antioxidants. However, it is crucial to identify the reactive oxygen species more deleterious to semen of goats to determine the ideal antioxidant. The aim of this study was to identify the ROS more deleterious to semen of goats and thereby to treat the extender with specific antioxidants for the destruction of this ROS. In experiment 1, sperm samples from 12 goats were incubated with 3 systems of production of ROS and a by-product of lipid peroxidation, known to also lead to oxidative damage. The sperm samples were subjected to incubation with xanthine (20 mM) and xanthine oxidase (superoxide anion), iron sulfate (4 mM) and ascorbate (20mM-hydroxyl radical), hydrogen peroxide (H2O2, 20 mM) and malondialdehyde (20 mM). After incubation the samples were evaluated for sperm morphology, motility, membrane (eosin / nigrosin), acrosome (Rose Bengal / Fast Green), mitochondria (3.3 diaminobenzidine) and thiobarbituric acid reactive substances (TBARS, assesses the susceptibility of sperm to oxidative stress). The results of experiment 1 indicated that ROS most deleterious to the goat sperm is the H2O2, especially due to damages to the plasma membrane and mitochondria. Thus, in Experiment 2, the extender for cryopreservation of goat semen was supplemented with catalase and glutathione peroxidase (GPx), enzymatic antioxidants responsible for the destruction of H2O2. Statistical analyses were performed using the SAS system for Windows. The results of experiment 2 revealed no beneficial effects of the use of neither catalase oor GPx. In fact, catalase showed deleterious effects on the plasma membrane of cryopreserved samples; Samples treated with 240 IU / mL of catalase showed a lower percentage of sperm with intact membrane when compared with controls (13.42 ± 2.96 ± 4.80% and 25.08%, respectively ). In fact, previous studies indicate that concentrations of catalase in semen of goats are very low, which indicates that catalase treatment with the dosages used in the present study may have been excessive. Apparently different antioxidants work in different regions of the sperm, and only the combination of different antioxidant could be effective. Moreover, the results of Experiment 1 were obtained in fresh samples, and probably, in cryopreserved samples, other ROS could be the most deleterious

EMBRYOGENESIS OF MYLOSSOMA DURIVENTRE (PACU-PEVA)

This paper aimed to test a semi natural reproduction and to study the morphological development of the Mylossoma duriventre embryo until hatching. We selected six females with coelomic cavity bulging and softness and eighteen males that release sperm under light belly compression. We applied two doses of luteinizing hormone (0.0125 mg/kg and 0.125 mg/kg) for females and for males no hormonal induction was made, a semi natural reproduction was performed. After fertilization the embryos were transfer to a incubator and were evaluated every at 15-min intervals during the first hours of development and at one-hour intervals until hatching. The embryos are megalecites with meroblastic division, being visualized six different stages of development: fertilization, cleavage, blastula, gastrula, segmentation and pharyngula. In gastrulation (120-min post fertilization), there is formation of "tail bud" and appearance of somites during segmentation (510-min post fertilization), after the blastopore closure. The hatching occurred with 20 hours of development, at a temperature of 24°C. It was possible to reproduce the pacu peva in captivity, and the morphological development of the embryos showed some specificity when compared to other species and its results regarding embryonic development are essential for a better understanding of biology this species.