Padrão de metilação dos genes xist e igf2 em ovocitos de folículos antrais de vacas nelore

RESUMO

Modificações epigenéticas são eventos que controlam a expressão diferencial de genes, sendo a metilação do DNA um dos mais conhecidos, importante para a reprogramação epigenética durante a gametogênese. Entender como isso ocorre na ovogênese é importante para criar parâmetros para a competência ovocitária com o intuito de melhorar a produção in vitro de embriões. Nesse trabalho objetivou-se avaliar o padrão de metilação em ovócitos de duas categorias de folículos antrais entre 1 e 3 mm e maiores que 6 mm. Para isso foram escolhidas duas ilhas CpGs, uma no éxon 1 do gene XIST – que está relacionado com a inativação do cromossomo X em fêmeas, e outra no último éxon do gene IGF2 – envolvido no desenvolvimento embrionário e placentação. Os ovócitos foram obtidos a partir de ovários de vacas Nelore provenientes de abatedouros usando o tissue chopper e sucessivas pipetagens para o isolamento dos ovócitos. A classificação dos ovócitos foi realizada de acordo com o seu diâmetro. O DNA extraído dos ovócitos foi tratado com bissulfito de sódio e os genes de interesse foram amplificados através de PCR nested. Os produtos purificados de gel de agarose 2% foram utilizados clonagem em células DH5α. Os clones foram sequenciados usando a metodologia dideoxi e analisados no programa BiQ Analyzer utilizando sequências controle do “GenBank”. Apenas sequências com mais de 90% de identidade e de conversão pelo bissulfito de sódio foram consideradas para análises. Os resultados mostraram que os ovócitos de folículos entre 1 e 3 mm e maiores que 6 mm possuem padrão de metilação iguais, tanto para o gene XIST (89,5% e 92,7%, respectivamente) quanto para o gene IGF2 (73,4% e 61,5%, respectivamente). Esses dados sugerem que, pelo menos para as regiões estudadas, o padrão de metilação já está estabelecido a partir da fase antral do folículo ovariano em ovócitos imaturos.