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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-200449

Resumo

O Brasil figura como o maior produtor de embriões bovinos do mundo, mas alguns gargalos, como o uso do sêmen sexado e a criopreservação eficiente de embriões ainda tem que ser trabalhados para que a produção e a exportação do material genético sejam otimizadas. A criopreservação de embriões produzidos in vivo é considerada eficiente e o conhecimento de sua biologia básica pode ser utilizado como parâmetro para melhor entendimento dos mecanismos envolvidos na baixa eficiência da criopreservação dos embriões produzidos in vitro. O objetivo desse estudo foi avaliar as modificações da trimetilação da lisina 4 na Histona 3 (H3K4me3) em embriões bovinos produzidos in vivo com sêmen sexado e submetidos a criopreservação. Vacas da raça Girolando (n=5) foram superovuladas e inseminadas com sêmen sexado ou convencional. Após a coleta de embrião (D7), parte dos embriões coletados foram armazenados em Paraformaldeído logo após a coleta, e outra parte armazenada em Paraformaldeído após a criopreservação/descongelamento. Todos os embriões (frescos/sêmen convencional; frescos/sêmen sexado; criopreservados/sêmen convencional e criopreservados/sêmen sexado) foram avaliados por imunofluorescência sob microscopia confocal, para identificação da H3K4me3. Das 190 estruturas coletadas, 100 foram produzidas com sêmen convencional e 90 com sêmen sexado. O uso do sêmen convencional proporcionou a produção de embriões viáveis (72%), sendo a maioria (52,77%) em fases mais avançadas do desenvolvimento (blastocistos expandidos; 52,77%). Por outro lado, os embriões produzidos com sêmen sexado apresentaram menores taxas de viabilidade (36,7%) e a maioria foi coletada em estágios mais precoces de desenvolvimento (Mórula e Blastocisto; 42,42%; p<0,05). Embriões na fase de mórula (209,26±10,95), independente da criopreservação ou do uso de sêmen sexado, apresentaram maior intensidade do sinal da trimetilação da H3K4 quando comparada com o embrioblasto de blastocistos (160,35±10,52) (p<0,05). Os resultados demonstraram que fêmeas da raça Girolando produzem embriões em fases mais avançadas do desenvolvimento após lavagem uterina. Esses são os primeiros resultados que descrevem o perfil epigenético de embriões bovinos produzidos in vivo. Como esperado, todos os embriões apresentam metilação da H3K4, no entanto em mórulas essa característica foi mais acentuada.

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The Brazil stands as the largest producer of embryos in the world, but some obstacles, such as the use of sexed semen and efficient cryopreservation of embryos has yet to be worked out so that the production and export of genetic material are optimized. Cryopreservation of embryos produced in vivo is considered efficient and the knowledge of its basic biology can be used as a parameter for better understanding of the mechanisms involved in the low efficiency of cryopreservation in embryos produced in vitro. The objective of this study was to characterize the modifications of tri-methylated lysine 4 on histone 3 (H3K4me3) in bovine embryos produced in vivo with sex-sorted semen and subjected to cryopreservation. Girolando cows (a common brasilian dairy breed, crossbreed Gir x Holsteins; n = 5) were superovulated and inseminated with sex-sorted or conventional semen. After the embryo collection (n = 4), aliquots of the collected embryos were stored in Paraformaldehyde immediately after collection, or stored in Paraformaldehyde after cryopreservation / thawing. All embryos (fresh / conventional semen, fresh / sexed semen; cryopreserved / conventional semen and cryopreserved / sexed semen) were evaluated by immunofluorescence in confocal microscopy to identify the H3K4me3. From 190 embryos collected, 100 were produced with conventional semen and 90 with sexed semen. The use of conventional semen provided 72% of viable embryos, the majority (52.77%) of them was in more advanced stages of development (expanded blastocysts; 52.77%). In contrast, embryos produced with sexed semen showed lower viability rate (36.7%) and earlier stages of development at time of collection (morula and blastocyst, 42.42%; p <0.05). Embryos in morula stage, regardless of cryopreservation or the use of sexed semen, showed the most prevalent signal of the H3K4me3 compared to blastocysts (209.26 ± 10.95 vs. 160.35 ± 10.52 intensity channels; p <0.05). Furthermore our results demonstrated those after uterine flushing of Girolando cows the embryos are in more advanced stages of development. These are the first results that describe the H3K4me3 profile of bovine embryos produced in vivo. As expected, all embryos show methylation of H3K4, but in morula the abundance was more pronounced.

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