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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-202078

Resumo

A Brucelose bovina é uma zoonose causada por uma bactéria gram-negativa, intracelular-facultativa que sobrevive e multiplica-se dentro de macrófagos, denominada Brucella abortus, responsável por ocasionar perdas reprodutivas em animais domésticos e febre ondulante em humanos. A imunoprofilaxia certificada pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento são as vacinas B19 e RB51, manipuladas a partir de amostras atenuadas de B. abortus, que são obrigatórias para bovinos. As vacinas comerciais disponíveis contra B. abortus apresentam algumas limitações como: conferir infecção persistente que pode provocar aborto nas fêmeas gestantes vacinadas, ser patogênica para os seres humanos e possuir custo elevado de produção. Além disso, a amostra B19 produz anticorpos que interferem no diagnóstico para diferenciação de populações infectadas naturalmente e vacinadas. O desenvolvimento de vacinas de DNA e subunidade são uma alternativas bastante promissoras como alternativa as vacinas clássicas, pois além de conferirem resposta imune humoral e celular é também de baixo custo e fácil manipulação. Assim, o objetivo neste estudo foi desenvolver vacinas de DNA e subunidade contra B. abortus, testá-las em camundongos BALB/c para avaliar a produção de anticorpos específicos e níveis de proteção conferida aos animais testados. Os genes virB9 e virB12, os quais são essenciais para sobrevivência e multiplicação de Brucella spp., foram usados como alvo da construção das vacinas de DNA e subunidade. Para isto, os genes virB9 e virB12, que produzem proteínas potencialmente antigênicas, foram amplificados pela técnica de PCR e clonados, separadamente, nos plasmídeos pET47b e pcDNA3.1+ para produção das proteínas recombinantes in vitro e expressão in vivo, respectivamente. Grupos de cinco camundongos da linhagem BALB/c receberam três doses dos candidatos vacinais e associações (pcDNAvirB9, pcDNAvirB9+VirB9r, pcDNAvirB12 e pcDNAvirB12+VirB12r e, separadamente, VirB9r e VirB12r), acompanhados das doses controle (pcDNA3.1(+), Montanide, B19 e PBS). O estudo de proteção foi avaliado após o desafio com a amostra de B. abortus S2308. A detecção de IgG específico no soro dos camundongos imunizados, bem como suas subclasses IgG1 e IgG2a, foram avaliadas por ELISA indireto. Os níveis de IFN- e IL-10 foram determinados por ELISA de captura a partir dos sobrenadantes de culturas de esplenócitos, estimulados com VirB9r e VirB12r, separadamente. Os candidatos a imunógenos pcDNAvirB9, pcDNAvirB9-VirB9r e pcDNAvirB12-VirB12r, VirB9 e VirB12 induziram a produção de IgG e suas subclasses IgG1 e IgG2a em níveis significativos (p<0,05). A resposta imune induzida pela formulação vacinal VirB9r foi capaz de proteger camundongos após o desafio com B. abortus virulenta S2308. Essa formulação pode ser promissora contra a brucelose em bovinos.

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The bovine Brucellosis is a zoonosis caused by facultative intracellular Gramnegative bacterial that survive and multiply within macrophages, called Brucella abortus, responsible for causing late-term abortions, stillbirths and birth of weak calves of domestic animals and undulant fever in humans. The immunoprophylaxis certified by the Ministry of Agriculture, Livestock and Supply are the B19 and RB51 vaccine, manipulated from attenuated strains of B. abortus, which are suitable for cattle. Currently available commercial vaccines against B. abortus present some limitations as to confer a persistent infection that can cause abortion in pregnant animals vaccinated and be pathogenic to humans and possess high production cost. Furthermore, sample B19 produce antibodies that interfere with the diagnotic for the differentiation of vaccinated and naturally infected populations. The development of a DNA and subunit vaccines are a considerable alternatives because besides conferring humoral immune response and cell is also inexpensive and easy handling. The objective of this study was development and evaluation of DNA and subunit vaccines against B. abortus, test them in BALB / c mice, to evaluate the production of specific antibodies and levels of protection given to test animals. The candidate immunogens virB9 and virB12, which are essential for survival and proliferation of Brucella spp., Were used as a target of construction of DNA and subunit vaccines. For this, the virB9 and virB12 genes which produce potentially antigenic proteins were amplified by PCR and cloned, separately, in pET47b and pcDNA3.1 + recombinant plasmids for production of in vitro and in vivo protein expression, respectively. Groups of five mice of BALB/c received three doses of the candidate immunogens and associations (pcDNAvirB9, pcDNAvirB9 + VirB9r, pcDNAvirB12 and pcDNAvirB12 + VirB12r and separately VirB9r and VirB12r), accompanied by the dose control (pcDNA3.1 (+), Montanide, B19 and PBS). The protection study was evaluated after challenge with sample B. abortus S2308. The specific detection of IgG in the serum of immunized mice as well as their isotypes IgG1 and IgG2a were measured by ELISA. The levels of IFN- and IL-10 were determined by capture ELISA from the supernatants of splenocyte cultures stimulated with VirB9r and VirB12r separately. The detection of specific IgG in the serum of immunized mice, as well as their isotypes IgG1 and IgG2a were measured by ELISA. IFN- and IL-10 were determined by capture ELISA from the supernatants of splenocyte cultures stimulated with VirB9r and VirB12r, separately. The candidate immunogens pcDNAvirB9, pcDNAvirB9-VirB9r and pcDNAvirB12- VirB12r, and VirB9 VirB12 induced IgG production and their isotypes IgG1 and IgG2a levels and achieved significant (p <0.05). The immune responses induced by the vaccine formulations VirB9r were able to protect mice after challenge with virulent B. abortus S2308. These formulations may be promising against brucellosis in cattle.

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