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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-202250

Resumo

O controle do carrapato Rhipicephalus microplus é motivo de grande preocupação para os bovinocultores, especialmente em razão do aumento de frequência de populações de carrapatos resistentes. No Brasil, foi relatado que este parasito, isoladamente, é responsável por uma perda anual superior a 3 bilhões de dólares. Os acaricidas tem um papel fundamental no controle dos carrapatos, entretanto o uso intensivo desses químicos tem favorecido o desenvolvimento de populações resistentes desses parasitos. O amitraz é um acaricida presente no mercado há mais de quarenta anos, sendo utilizado para o controle de ectoparasitos em diversas espécies. A perspectiva de que o amitraz possa ser reutilizado em regiões onde a resistência está presente, introduz uma alternativa aos produtores que tem esse problema. No presente trabalho, foi realizada a caracterização fenotípica e genotípica da resistência ao amitraz em uma cepa de R. microplus resistente a acaricidas. Adicionalmente, realizou-se o cruzamento dessa cepa resistente com uma cepa suscetível a acaricidas, objetivando uma potencial reversão da resistência em condições experimentais. Para tanto, foram mantidas em condições laboratoriais por cinco gerações, três colônias de carrapatos: uma suscetível (cepa Porto Alegre (Poa)), uma resistente (cepa São Gabriel (SG)) e uma formada a partir de uma combinação de ambos os isolados (cepa MIX). A caracterização fenotípica de resistência ao amitraz foi realizada através de bioensaios laboratoriais com adultos e larvas (teste de imersão de adultos - TIA e teste do pacote de larvas - TPL). Para a ivestigação dos mecanismos de resistência, foram realizados testes com inibidores enzimáticos para avaliação do papel da degradação metabólica na resistência dos isolados de R. microplus estudados. Visando a caracterização genotípica da resistência ao amitraz, carrapatos, resistentes e suscetíveis ao amitraz, tiveram o seu DNA extraído e utilizado em PCR para a amplificação de um fragmento do gene do receptor de octopamina/tiramina e identificação de possíveis marcadores moleculares de resistência ao amitraz. Os resultados demonstrados no TIA indicaram que não foram observadas alterações na suscetibilidade ao amitraz na cepa mix até a quarta geração. A atividade in vitro (94,83%) do amitraz na quinta geração da cepa mesclada foi significativamente maior do que a geração anterior, demonstrando ser parcialmente eficaz o acaricida. No TPL conduzido com a primeira geração utilizada para realizar a mistura, a cepa resistente apresentou fator de resistência (FR) de 15,699 comparada com a cepa suscetível. A primeira geração da cepa MIX apresentou um FR de 1,199 e a cepa resistente um FR de 1,930, sendo estatisticamente diferentes. As duas gerações consecutivas formadas não apresentaram diferença estatística, sendo o FR da Mix G3 (0,977) comparado com FR da SG G3 (0,975) e o FR da Mix G3 (3,225) relacionado com o FR da SG G4 (3,211). Nos testes com inibidores enzimáticos, o dietilmaleato (DEM - inibidor de GSTs) e o butóxido de piperonila (PBO - inibidor de P450) conferiram sinergismo ao amitraz contra a cepa SG. Na cepa MIX, apenas o PBO aumentou a toxicidade. Sugere-se que as citocromo P450 oxidases e a GST podem estar envolvidas com a detoxificação do amitraz. No fragmento amplificado do gene do receptor de octopamina/tiramina a partir do DNA de indivíduos da cepa SG, foram identificados dois SNPs previamente associados à resistência ao amitraz em R. microplus dos continentes americano e africano. O presente trabalho adiciona algumas informações fenotípicas e genotípicas a respeito de uma cepa resistente ao amitraz, obtidas através do acompanhamento e evolução do perfil de resistência em laboratório.

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The control of the tick Rhipicephalus microplus is a reason of great concern for the beef and milk farmers, especially because of the increasing resistant ticks population. In Brazil, it was reported that this parasite, singly, is responsible for an annual lost over 3 billion dollars. Acaricides have a fundamental role in ticks control, however, the intensive use of these chemicals has favored the development of these resistant tickss population. Amitraz is an acaricide present in the market over forty years, been used to control the ectoparasites in many species. The prospect that the amitraz can be used in regions where resistance is present, introduces an alternative to farmers who have this problem. In the present paper, it was done a phenotypic and genotypic characterization of amitraz resistance to a strain R. microplus resistant to acaricides. Additionally, it was done a cross of this resistant strain with a susceptible strain to acaricides, aiming a potential reversal of resistance in experimental conditions. Therefore, were maintained in laboratory conditions for five generations tickss colonies: a susceptible (strain Porto Alegre), a resistant (strain São Gabriel) and one formed from a combination of both the isolates (strain MIX). The phenotypics characterization about the amitraz was held through laboratory bioassays with adults and larval, the adults immersion test (AIT) and the larval packet test (LPT). For the investigation of resistance mechanisms, tests with enzymatic inhibitors were made for evaluation of the role of metabolic degradation in the resistance of the strains of R. microplus studied. Aiming at the genotypic characterization of resistance to amitraz, resistant and susceptible tick to amitraz had their DNA extracted and used in Polymerase Chain Reaction for the amplification of a fragment of the receptor gene octopamine/tyramine and identify possible molecular markers of resistance to amitraz. The results shown in AIT indicated that changes were not observed in susceptibility to amitraz in the mix strain to the fourth generation. The in vitro activity (94.83%) of amitraz in the fifth generation of the merged strain was significantly higher than the previous generation, proving to be partially effective in acaricide. In the LPT, the first generation used to make the mixture, the resistant strain presented a resistance factor (RF) of 15,699 compared to the susceptible strain. The MIX strain presented a RF of 1,199 and the resistant strain presented a RF of 1,930, beeing statistically different. Both consecutive generations formed didn't present statistic differences, beeing Mix G3's RF (0,977) compared with SG G3's RF (0,975) and Mix G4's RF (3,225) related with SG G4's RF (3,211). In the test with enzymatic inhibitors, the diethylmaleate (DEM GST inhibitor) and the piperonyl butoxide (PBO P450 inhibitor) conferred synergism to amitraz against the Sg strain. In the Mix strain only the PBO increased acaricides toxicity. It is suggested that the cytochrome P450 oxidases and GST may be involved with the amitraz detoxification. In the amplified fragment of the receptor gene octopamine/tyramine from the individualss DNA of the strain SG were identified two SNPs are associated with amitraz resistance in R. microplus of the American and African continents. The present paper adds some phenotypic and genotypic informations about a amitrazs resistant strain, obtained through follow-ups and resistances profile evolution in laboratory.

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