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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-202330

Resumo

Mastite é uma inflamação da glândula mamária e é apontada como a maior causa de perdas econômicas na cadeia láctea mundial. As espécies de Streptococcus estão entre os principais patógenos da mastite. É notável a emergência de patógenos resistentes aos compostos tradicionalmente usados para o controle de doenças. Dessa forma, novas alternativas têm sido buscadas nos produtos naturais, destacando-se as plantas. Rheedia brasiliensis é muito utilizada na medicina popular brasileira com diversos fins terapêuticos. Foi isolado de seu fruto a benzofenona 7-epiclusianona. Uma boa estratégia para aumentar a atividade antimicrobiana é complexar moléculas ativas com metais. Assim, foi sintetizado um complexo metálico composto por duas moléculas de 7-epiclusianona com cobre. O objetivo do presente trabalho foi verificar a atividade de 7-epiclusianona (7-epi) e do complexo metálico 7epiclusianona-cobre (7-epi-Cu) sobre bactérias do gênero Streptococcus isoladas de mastite bovina, e avaliar a citotoxidade dessas moléculas sobre células MAC-T. Foram utilizados para esse estudo quatro isolados de mastite bovina, dois de Streptococcus agalactiae (SA3930 e SA4038) e dois de Streptococcus uberis (SU959 e SU3580). Eles foram submetidos ao teste de concentração inibitória mínima (CIM) através da microdiluição em caldo, e também foi determinada a concentração bactericida mínima (CBM) em caldo. A curva de tempo de morte foi traçada a partir da contagem de Unidades Formadoras de Colônias em tempos pré-determinados durante 24 horas com os isolados submetidos à CIM e à CBM. O conteúdo de proteína no sobrenadante foi determinado pela centrifugação da suspensão bacteriana tratada com a CIM dos dois compostos, através do método de Bradford. Para avaliar a indução da aderência, foi utilizada uma concentração subinibitória dos compostos. O efeito citotóxico dos compostos foi medido através dos ensaios do MTT e da captação de vermelho neutro sobre células MAC-T. As médias obtidas nos ensaios de MTT, vermelho neutro, teste de liberação de proteínas e avaliação da aderência foram comparas pelo ANOVA seguido pelo Tukey. O nível de significância adotado foi 95% (p<0,05). As CIMs encontradas para os compostos 7-epi e 7-epiCu foram de 7,8 µg mL-1 para as cepas SA4038, SU959 e SU3580. A cepa SA3930 foi resistente a maior concentração testada (125 µg mL-1). A CBM para SA4038 com 7-epi foi 15,6 µg mL-1, para as demais combinações composto/isolado foi 31,3 µg mL-1. A dinâmica da curva de tempo de morte para os compostos mostrou ação bacteriostática de uma maneira tempo/dose-independente. Não foi evidenciada a presença de proteína no sobrenadante das culturas tratadas com os compostos. 7-epi e 7-epi-Cu que, em subdose, não induziram a aderência das bactérias S. agalactiae e S. uberis. Ambos compostos não apresentaram atividade citotóxica quando na CIM para as células MAC-T, porém foram tóxicos na concentração 7×CIM. Os compostos testados apresentaram excelentes resultados quanto à sua atividade contra essas bactérias Gram-positivas. Uma vez que os resultados dos dois compostos avaliados foram semelhantes, seria mais recomendada a utilização de 7-epi, por ser mais simples e barata sua produção.

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Mastitis is an inflammation of the mammary gland and is identified as the major cause of economic losses in global dairy chain. Streptococcus species are among the main mastitis pathogens. It is remarkable the emergence of resistant pathogens to compounds traditionally used for disease control. Thus, new alternatives have been researched in natural products, especially plants. Rheedia brasiliensis is widely used in Brazilian folk medicine with various therapeutic purposes. It was isolated from its fruit the benzophenone 7epiclusianone. A good strategy to enhance the antimicrobial activity is complex active molecules with metals. Then it was synthesized a metal complex with two molecules of 7-epiclusianone with copper. The aim of this study was to determine the activity of 7-epiclusianone (7-epi) and the metal complex 7epiclusianone-copper (7-epi-Cu) on bovine mastitis isolated Streptococcus spp, and assess the cytotoxicity of these molecules on MAC-T cells. Were used for this study four bovine mastitis isolates, two Streptococcus agalactiae (SA3930 and SA4038) and two Streptococcus uberis (SU959 and SU3580). They were subjected to a minimum inhibitory concentration test (MIC) by broth microdilution and minimum bactericidal concentration (MBC) test in broth. Timekill curve was plotted from Forming Units Colony count at predetermined times during 24 hours with the isolates submitted to the CIM and CBM. The protein content in the supernatant was determined by centrifugation of bacterial suspension treated with MIC of both compound by Bradfords method. To evaluate the induction of adhesion one sub-inhibitory concentration of the compounds was used. Cytotoxic effect of the compounds was measured through MTT assay and neutral red uptake on MAC-T cells. The average obtained in the MTT assay, neutral red uptake, protein leakage and adherence evaluation were compared by ANOVA followed by Tukey. The significance level xiv was 5% (p <0.05). The MICs found for compounds 7-epi and 7 epi-Cu was 7.8 µg mL-1 to SA4038, SU959 and SU3580 strains. SA3930 strain was resistant to the highest concentration tested (125 µg mL-1). CBM for SA4038 with 7-epi was 15.6 µg mL-1, for the other combinations compound/strain was 31.3 µg mL-1. Time-kill curve dynamic of compounds showed bacteriostatic action in a manner time/dose independent. There was no evidence of protein in supernatant of cultures treated with the compounds. 7-epi-7-epi-Cu, in sub-doses, no induced S. agalactiae and S. uberis adhesion. Compounds tested showed no cytotoxic activity when at the MIC for the MAC-T cells, but were toxic in 7×CIM. Two compounds tested had excellent results for their activity against these Grampositive bacteria. Since results of both compounds evaluated were similar, would most recommended use of 7-epi, because its simpler and cheaper production.

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