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Tese em Português | VETTESES | ID: vtt-203454

Resumo

Membro da família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus, herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV1) tem sido associado a diferentes condições clínicas em bovinos (doenças respiratórias, genitais e falhas reprodutivas). Não existe um procedimento padrão para medidas de controle e profilaxia das infecções causadas por herpesvírus. Uma abordagem alternativa para seleção de novos antígenos vacinais ou para diagnóstico é a seleção de mimetopos recombinantes por meio da sua interação com anticorpos específicos. Foi realizado um experimento de phage display utilizando uma biblioteca de peptídeos randômicos e lineares composta de 12 resíduos de aminoácidos fusionada à pIII de fagos M13, contra IgGs específicas para o BoHV1, purificadas em coluna de cromatografia por afinidade, a partir de bovinos soropositivos. Foram realizados três ciclos de seleção e amplificação para o enriquecimento dos alvos ligantes às proteínas totais de BoHV1. A reatividade dos clones selecionados foi confirmada por ELISA, demonstrando a eficiência da seleção a partir dos anticorpos específicos. Dentre os 27 clones selecionados por phage-display e biopanning, três apresentaram os melhores resultados no ensaio imunoezimático. Um destes, o E, apresentou potencial antigênico na detecção de anticorpos para o diagnostico sorológico do BoHV1. Nos testes de imunização em coelhos, os peptídeos (B, C e E) não induziram a produção de anticorpos soroneutralizantes pelo sistema imune dos animais testados. A utilização de peptídeos como um imunógeno a base de epitopo não apresentou resultados satisfatórios com indução de anticorpos soroneutralizantes do BoHV1. A análise in silico do dodecapeptídeo 1 DRALYGPTVIDH 12 possibilitou a identificação de um novo epitopo descontínuo na glicoproteína B de envelope (Env gB) do herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV1). Há um curto motivo (338 YKRD 341) dentro de uma região do gene Env gB do BoHV1, com alta similaridade com os motivos compartilhados pelo dodecapeptídio da região N-terminal (5YxARD1) da gB e do HSV-1 (326YARD329), em que o resíduo 328Arg é descrito como um alvo para anticorpos neutralizantes. Concluindo, além da caracterização de um sítio de ligação ao anticorpo na Env gB (BoHV1), demonstramos que o peptídeo expresso pelo fago tem potencial para ser usado como reagente para o diagnóstico virológico por ensaio ELISA-fago, que discrimina amostras de soro positivas e negativas para o BoHV1.

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Member of the Herpesviridae family, subfamily Alphaherpesvirinae, gender Varicellovirus, bovine herpesvirus type 1 (BoHV1) has been associated with different clinical conditions in cattle (respiratory and genital/reproductive diseases). There is no standard procedure to control measures and prophylaxis of infections caused by herpesviruses. An alternative approach for the selection of new vaccine or diagnostic antigens is the selection of recombinant mimetopes through their interaction with specific antibodies. We realized a phage display experiment using a linear random peptide library that consists of 12 amino acid residues fused to the III of M13 protein phage against specific BoHV1 IgGs, purified by column chromatography by affinity, from seropositive cattles. Three cycles of selection and amplification for enrichment of target ligands to total BoHV1 proteins were performed. The reactivity of selected clones was confirmed by ELISA, demonstrating the efficiency of selection from the specific antibodies. Out of the 27 clones selected by phage-display and biopanning, three presented the good results in ELISA assay, and the E, showed to be potential antigen for antibodies detection for the serological diagnosis of BoHV1. In immunization tests on rabbits, the obtained peptides (B, C and E) did not induce detectable serum neutralizing antibodies in tested animals. The use of peptides as an immunogen based epitope did not show satisfactory results. The in silico analysis of the dodecapeptide 1DRALYGPTVIDH12 enabled the identification of a new discontinuous epitope on the envelope glycoprotein B (gB Env) of bovine herpesvirus type 1 (BoHV1). There is a short motif (338YKRD341) within a region of the env gB BoHV1 with high similarity to motifs shared by dodecapeptide the N-terminal region (5YxARD1) of gB and HSV-1 (326YARD329), wherein the 328Arg residue is described to be a neutralizing antibody target. Besides the characterization of an antibody-binding site of the BoHV-1 Env gB, we have demonstrated that the phage-fused peptide has potential use as a reagent for virus diagnosis by phage-ELISA assay, discriminating BoHV-1 positive serum samples from negative ones.

Biblioteca responsável: BR68.1