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Tese em Inglês | VETTESES | ID: vtt-203492

Resumo

As marcações epigenéticas da lisina 27 da histona H3 (H3K27) parecem exercer importante papel na regulação do desenvolvimento embrionário de mamíferos. O objetivo deste trabalho foi investigar o perfil de alterações da H3K27 e o efeito da inibição da trimetilação da H3K27 em dois modelos animais: embriões suínos e bovinos. Para tanto, foram realizados dois experimentos. O Experimento 1 teve como intuito investigar o perfil de acetilação e metilação (simples, dupla ou tripla) da H3K27 (H3K27ac, me1, me2 e me3, respectivamente) durante a maturação oocitária e desenvolvimento inicial de embriões suínos produzidos in vitro (PIV). O Experimento 2 objetivou investigar o efeito da adição do DZNep, inibidor do Complexo Repressivo Polycomb 2 (PRC2), ao meio de cultivo embrionário em diferentes períodos no desenvolvimento de embriões. Além disso, foi avaliada a expressão de mRNA dos genes das enzimas do PRC2 EZH2, EED e SUZ12; dos genes marcadores de pluripotência OCT4 e NANOG e do gene marcador de diferenciação celular CDX2. No Experimento 1, oócitos e embriões suínos foram fixados em diferentes estágios de desenvolvimento (de vesícula germinativa a blastocistos em D8) e submetidos a um protocolo de imunofluorescência para a identificação das marcas H3K27ac, me1, me2 e me3. No Experimento 2, embriões clivados foram expostos ao DZNep nos dias 3 a 5 (DZNep D3-D5), nos dias 3 a 8 (DZNep D3-D8), nos dias 5 a 8 (DZNep D5-D8) ou cultivados sem a adição do DZNep (Controle). No Experimento 1, o sinal fluorescente da H3K27ac esteve presente em quase todos os estágios, atingindo o mínimo no estágio de 8 células. H3K27me1, me2 e me3 foram detectadas em oócitos e apresentaram sinal fraco ou ausente durante o desenvolvimento embrionário, intensificando-se novamente no estágio de blastocisto. Três padrões distintos da H3K27me3 foram observados em blastocistos suínos em D8. No Experimento 2, o grupo DZNep D3-D8 apresentou menor taxa de blastocisto (6,9%) em comparação ao grupos DZNep D3-D5 (16,7%) e DZNep D5-D8 (14,3%; p < 0,01), sendo todas estas menores ao se comparar à taxa do grupo Controle (33,9%). O número médio de células também foi reduzido de 118,2 ± 5,6 (Controle) para 70,4 ± 4,3 (DZNep D3-D5), 51,5 ± 2,5 (DZNep D5-D8) e 36,3 ± 1,6 (DZNep D3-D8; p < 0,01). Os embriões expostos ao DZNep tiveram também o desenvolvimento atrasado, apresentando menos embriões em estágios avançados de desenvolvimento. O DZNep não influenciou a expressão de mRNA dos genes SUZ12, NANOG, OCT4 e CDX2. Entretanto, o grupo DZNep D3-D8 apresentou maiores níveis de mRNA dos genes EZH2 e EED em comparação ao grupo Controle. Os resultados do Experimento 1 sugerem que as alterações epigenéticas da H3K27 são remodeladas durante a embriogênese suína. Sugerem também que os baixos níveis de H3K27me e altos níveis de H3K27ac indicam um estado transcricionalmente ativo da cromatina durante o desenvolvimento inicial de embriões suínos PIV. Com os resultados obtidos no Experimento 2, é possível concluir que a ação do PRC2 é importante para o desenvolvimento embrionário, uma vez que o DZNep reduziu a taxa de blastocistos, o número de células embrionárias e a velocidade de desenvolvimento. A exposição dos embriões ao DZNep nos dias 3 a 8 aumentou a expressão de mRNA das enzimas Polycomb EZH2 e EED.

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The epigenetic marks of lysine 27 of histone H3 (H3K27) appear to play an important role in the regulation of embryonic development in mammals. The aim of this study was to investigate the profile of H3K27 modifications and the effect of inhibiting trimethylation of H3K27 in two animal models: porcine and bovine embryos. Therefore, two experiments were conducted. Experiment 1 had the purpose to investigate the profile of acetylation and methylation (mono-, di- and trimethylation) of H3K27 (H3K27ac, me1, me2 and me3, respectivally) during oocyte maturation and early development of in vitro-produced (IVP) porcine embryos. Experiment 2 aimed to investigate the effect of adding DZNep, an inhibitor of the Polycomb Repressive Complex (PRC2), to the culture media in different periods of culture on embryo development. Furthermore, mRNA expression of genes encoding the PRC2 enzymes EZH2, EED and SUZ12; the markers of pluripotency OCT4 and NANOG and the marker of cell differentiation CDX2 was investigated. In Experiment 1, oocytes and embryos were fixed at different developmental stages (from germinal vesicle to D8 blastocysts) and submitted to an immunocytochemistry protocol to identify the H3K27ac, me1, me2 e me3 marks. In Experiment 2, cleaved embryos were exposed to DZNep from day 3 to 5 (DZNep D3-D5), from day 3 to 8 (DZNep D3-D8), from day 5 to 8 (DZNep D5-D8) or cultured without DZNep (Control). In Experiment 1, the fluorescent signal of H3K27ac was observed in most development stages, reaching a minimum at the 8-cell stage. H3K27me1, me2 and me3 signals were detected in oocytes and showed a weak or absent signal during embryo development, rising again at the blastocyst stage. Three different patterns of the H3K27me3 mark were observed in porcine D8 blastocysts. In Experiment 2, DZNep D3-D8 had lower blastocyst rate (6.9%) than DZNep D3-D5 (16.7%) and DZNep D5-D8 (14.3%; P < 0.05), which in turn were lower than the rate of Control group (33.9%). Mean cell number was also reduced from 118.2 ± 5.6 (Control group) to 70.4 ± 4.3 (DZNep D3-D5), 51.5 ± 2.5 (DZNep D5-D8) and 36.3 ± 1.6 (DZNep D3-D8; P < 0.01). Embryos treated with DZNep also had development delayed, evidenced by fewer embryos at later stages of development. DZNep did not influence mRNA expression of SUZ12, NANOG, OCT4 and CDX2. However, DZNep D3-D8 had higher mRNA levels of EZH2 and EED when compared to the Control group. Results from Experiment 1 suggest that the epigenetic marks of H3K27 are globally remodeled during porcine embryogenesis. Furthermore, the low levels of H3K27me and high levels of H3K27ac indicate a transcriptionally active chromatin state during porcine early embryonic development. With the results obtained from Experiment 2, it is possible to conclude that PRC2 is important for embryo development, considering that DZNep decreased blastocyst rates, blastocyst cell number and speed of development. Exposure of embryos to DZNep from days 3 to 8 increased mRNA expression of the Polycomb enzymes EZH2 and EED.

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